Inzercia lyzostafínového génu sprostredkovaná zinkovými prstami do lokusu kaseínu u klonovaných kráv | prírodná komunikácia

Inzercia lyzostafínového génu sprostredkovaná zinkovými prstami do lokusu kaseínu u klonovaných kráv | prírodná komunikácia

Anonim

predmety

  • Génové zacielenie
  • Genetické inžinierstvo

abstraktné

Nickázy so zinkovými prstami (ZFNickázy) sú typom programovateľnej nukleázy, ktorá sa dá skonštruovať z nukleáz so zinkovými prstami, aby sa vyvolali miestne špecifické jednoreťazcové zlomeniny alebo priehlbiny v genómovej DNA, čo vedie k homologicky orientovanej oprave. Hoci sa u ošípaných a hovädzieho dobytka preukázalo narušenie génov sprostredkované nukleázou so zinkovými prstami, neboli použité na zacielenie adície génov na endogénny génový lokus u žiadnych veľkých domácich druhov. Tu ukazujeme u hovädzích fetálnych fibroblastov, že cielenie ZFNickáz na endogénny lokus β-kazeínu (CSN2) stimuluje adíciu génov lyzostafínu homológiou zameranou opravou. Zistili sme, že bunky ošetrené ZFNickase sa môžu úspešne použiť na jadrový prenos somatických buniek, čo vedie k živo narodeným kráv zameraným na gény. Okrem toho gény cielené na gény vylučujú lyzostafín do svojho mlieka a testy in vitro preukazujú schopnosť mlieka zabíjať Staphylococcus aureus . Náš úspech s touto stratégiou umožní nové transgénne technológie prospešné pre poľnohospodárstvo aj pre biomedicínu.

úvod

Zinok-prstová nikáza (ZFN) je výkonným nástrojom pre genómové inžinierstvo, ktorý umožňuje cielenú mutagenézu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 . ZFN štiepia DNA a vytvárajú miestne špecifické dvojvláknové zlomy (DSB) v genóme. DSB sa opravujú nehomologickým spájaním koncov (NHEJ), ktoré často zavádza krátke inzercie alebo delécie (indely) pri zapečatenej prestávke alebo opravou homológiou (HDR), ktorá verne obnovuje pôvodnú sekvenciu jej skopírovaním zo sestry. chromatidov. Tieto dve dráhy sa môžu použiť na cielenú modifikáciu genómu, aj keď NHEJ je dominantnou cestou opravy DSB vo vyšších eukaryotických bunkách a organizmoch 8 . V súčasnosti sa ZFN všeobecne používajú v základnom výskume, biotechnológii a medicíne, ale genómové inžinierstvo s programovateľnými nukleázami je obmedzené nevyhnutnou výrobou DSB a spoliehaním sa na NHEJ náchylné na chyby. Ďalej tieto programovateľné nukleázy často indukujú náhodne generované a nežiaduce indely na vysoko homológnych miestach. Ďalej sú nukleové bunky, ktoré indukujú príliš veľa mimo cieľových DSB, toxické pre bunky. Ďalej je ťažké správne izolovať bunky cielené na gény 5, 9 . Jednou z potenciálnych stratégií na prekonanie tohto obmedzenia je cielené zavedenie do DNA obsahujúcej SSB alebo nick. Rovnako ako DSB, aj SSB / nick môže teoreticky stimulovať HDR dráhu 10, 11, 12 . Na rozdiel od DSB je dôležité, aby nick alebo SSB neboli substrátom v dobrej viere na opravu cestou NHEJ. Cielená SSB má teda potenciál obmedziť opravu HDR dráhy 13 .

Lysostafín, ktorý sa prirodzene produkuje Staphylococcus simulans , bol navrhnutý ako systémová terapia infekcie S. aureus 14 . Jeho účinnosť proti mastitíde spôsobenej S. aureus bola preukázaná na myšom modeli 15, 16 . Uvádza sa, že transgénny hovädzí dobytok exprimujúci lyzostafín v ich mlieku by mohol odolávať intramamárnej infekcii S. aureus 17 a že autentický lyzostafín produkovaný in vitro bunkovou líniou cicavcov by mohol mať za následok glykozyláciu inaktivitu proteínov 16 . Kódujúca sekvencia sa teda modifikovala tak, aby sa generoval Gln 125, 232- glystyloxín, takže sa odstránili dve potenciálne glykozylačné miesta. Tým sa zabránilo glykozylácii proteínu a obnovila sa čiastočná aktivita 16 . Cieľom tejto štúdie bolo uskutočniť účinné a reprodukovateľné zacielenie génov v bovinných fetálnych fibroblastoch vložením exogénneho génu Gln 125, 232- lyostostafínu do lokusu beta-kazeínu tak, aby sa lyzostafínový proteín mohol produkovať v mliečnej žľaze génovo zameranej kravy.

výsledok

Hodnotenie aktivity ZFN v bovinných fetálnych fibroblastoch

Pretože 51-bázová signálna peptidová sekvencia kódujúceho regiónu hovädzieho CSN2 génu je lokalizovaná v exóne 2, exogénny gén obsahujúci adíciu zostrihových akceptorových sekvencií v intron2 by mal byť úspešne zacielený, aby spôsobil expresiu exogénneho génu napodobňujúceho endogénny p-kazeín., Okrem toho aktivita akceptora zostrihu bola validovaná u hovädzích fetálnych fibroblastov (obr. 1). Preto sme vybrali intrón 2 hovädzieho lokusu CSN2 na zacielenie pomocou párov ZFN pomocou predtým opísanej stratégie 3 . Navrhli sme ZFN, ktoré tvorili páry zacielené na CSN2 lokus, a skrínovali ich v pučiacom kvasinkovom systéme, aby sa rýchlo zmerala ich aktivita ZFN (obr. 2a, b). Potom sme testovali ZFN na natívnu génovú disrupčnú aktivitu v ich cieľovom mieste v BFF. BFF boli transfekované rôznymi množstvami plazmidov exprimujúcich ZFN a frekvencia prerušenia sprostredkovaného ZFN v cieľovom mieste v každej skupine buniek bola stanovená pomocou nukleázového testu CEL-I (obr. 2c). Oba páry ZFN1 / ZFN2 a ZFN3 / ZFN4 mohli štiepiť a tým iniciovať mutáciu cieľového miesta v intróne 2 CSN2 . Pár ZFN1 / ZFN2 však štiepi cieľový gén efektívnejšie ako pár ZFN3 / ZFN4, ako je preukázané zvýšeným výskytom alelických mutácií (frekvencia NHEJ), najmä pri vyšších hladinách vstupných ZFN (obr. 2c). Preto sme v nasledujúcich experimentoch použili pár ZFN1 / ZFN2.

Image

a ) Schematický prehľad znázorňujúci stratégiu overovania pre činnosť akceptora zostrihu. ( b ) Hovädzie fetálne fibroblasty boli transfekované pEGFP-EI. ( c ) Hovädzie fetálne fibroblasty boli transfekované pEGFP-EIS. Mierka stupnice v ( b ) a ( c ) predstavuje 100 μm.

Obrázok v plnej veľkosti

Image

a ) Časť génu CSN2 zameraná na ZFN. Horná časť zobrazuje karikatúry dvoch párov ZFN, ktoré sa viažu na špecifické genomické miesta. DNA sekvencia primárneho väzbového miesta pre každý ZFN je veľká. Vystrihnuté miesta štiepené dimerizáciou nukleázových domén Fok I sú malé písmená. b ) Overenie zacielenia CSN2 pomocou ZFN. Aktivity dvoch párov ZFN pre miesto CSN2 boli merané testom kvasiniek MEL-I. Štiepna aktivita ZFN bola meraná pred (0 h, modré stĺpce) a po indukcii expresie ZFN (6 h, červené stĺpce). Hladiny MEL-I pozitívne korelujú so schopnosťou ZFN vytvárať zlomky s dvoma vláknami na požadovanom cieľovom mieste. ZFN, ktoré vykazovali> 50% signál relatívne k CCR5 štandardnému ZFN (pozitívna kontrola) po 6 hodinách, sa považovali za užitočné pre experimenty s editáciou genómu. c ) Porovnanie aktivity ZFN vo hovädzích fibroblastoch. Plazmidy kódujúce každý pár ZFN (ZFN1 / ZFN2 a ZFN3 / ZFN4) obsahujúce variant ELKK FokI sa dodávali do hovädzích fibroblastov v uvedených množstvách. Frekvencia alelickej mutácie v každej skupine ošetrených buniek bola stanovená pomocou testu CEL-I. Frekvencia NHEJ je vynesená proti dávke ZFN.

Obrázok v plnej veľkosti

Mutácia katalytickej domény ZFN generuje ZFNickázu

Aby sa vytvorili ZFN s vláknovo špecifickou aktivitou pre vytrhávanie, zmutovali sme katalytickú doménu Fok I v jednom z dvoch ZFN nevyhnutných na dimerizáciu a následné štiepenie DNA 18 . Konkrétne sme sa zamerali na aminokyselinu D450, o ktorej sa ukázalo, že pri mutácii 19 vedie k katalyticky neaktívnemu Fok I. Na testovanie aktivity ZFN nesúcich bodové mutácie D450A sme digerovali lineárny 366-bp PCR fragment génu CSN2 obsahujúci cieľové miesto mimo centrum pre CSN2- špecifické ZFN (obrázok 3a, b). Použitie in vitro syntetizovaných ZFN špecifických pre CSN2 divokého typu (ZFN1 a ZFN2) viedlo k účinnému dvojreťazcovému štiepeniu templátovej DNA na dva menšie fragmenty (> 70% účinnosť štiepenia), bez ohľadu na to, či boli produkty rozdelené. elektroforézou na polyakrylamidovom géli (PAGE) za podmienok nedenaturácie (obrázok 3c, dráha 1) alebo denaturácie (obrázok 3c, dráha 3). Keď sa spojil s pravou rukou ZFN (ZFN2) divokého typu, zavedenie mutácie D450A do ZFN1 eliminovalo dvojvláknové štiepenie (obrázok 3c, dráha 2). Aby sa potvrdila aktivita vytrhávania špecifická pre jednotlivé vlákna, boli rovnaké produkty štiepenia rozdelené za denaturačných podmienok, aby sa oddelili dve jednovláknové molekuly DNA. Ako sa očakávalo, mutácia D450A do značnej miery eliminovala štiepenie jedného z dvoch reťazcov DNA, čo sa pozorovalo ako pretrvávanie lineárneho jednoreťazcového templátu s úplnou dĺžkou (obrázok 3c, dráha 4). Tieto dáta dokazujú, že eliminácia štiepnej aktivity v jednej polovici ZFN páru zavedením mutácie D450A vedie k vytvoreniu silnej, vláknovo špecifickej ZFNickázy. Je to v súlade s nedávnou správou, ktorá opisuje konštrukciu nickáz pomocou variantov domény Fok I s mutáciou Asp450 na Ala 20 .

Image

a ) Ilustrácia produktov DNA po štiepení in vitro s uvedenými kombináciami WT a mutantného ZFN a uvedené očakávané štiepne udalosti. b ) Ilustrácia očakávaných vzorcov digescie po vytrhnutí špecifickom pre vlákno, keď sa vyrieši v podmienkach nedenaturácie a denaturácie. Špecifickosť oblasti je odhalená, pretože miesto štiepenia je mimo stredu. c ) Hodnotenie in vitro dvojreťazcového štiepenia DNA s variantmi ZFN1 / ZFN2 a ZFN1-D450A / ZFN2 za podmienok nedenaturácie a denaturácie. Čísla na spodku každej dráhy označujú% štiepených produktov. ( d ) Experimentálny náčrt a schéma postupu, pri ktorom sa DSB indukovaná ZFN alebo SSB indukovaná ZFNickasami opraví použitím extrachromozomálneho donora ako templátu. e ) Meranie frekvencie integrácie značiek riadenej ZFN do lokusu CSN2 v hovädzích fibroblastoch založené na PCR. Bunky sa nechali netransfekované (dráha 2, negatívna pre negatívnu kontrolu) alebo sa transfekovali donorovými plazmidmi nesúcimi Hin dIII-značku ohraničenú 700-bp homologickými ramenami (dráha 3) a expresné kazety pre ZFN, ktoré indukujú DSB alebo ZFNickázy. ktoré indukujú SSB na intróne 2 CSN2 v neprítomnosti (dráha 4, 5) a v prítomnosti (dráha 6, 7) donorových plazmidov. Genomická DNA sa extrahovala o 72 hodín neskôr. Percento DNA citlivej na Hin dIII je uvedené pod dráhou 6 a dráhou 7. ( f ) Vzorky v paneli e (dráha 6, 7) boli tiež analyzované na prítomnosť indolov pomocou Surveyorovej nukleázy. Čísla na spodku každej dráhy označujú percento alel CSN2 obsahujúcich indely.

Obrázok v plnej veľkosti

ZFNickase sprostredkovaná génová modifikácia na endogénnom mieste

Aby sme preskúmali, či by ZFNickázy mohli podporovať účinné pridanie malého fragmentu DNA na vopred určený endogénny lokus v cicavčích bunkách, postavili sme donor DNA plazmid skonštruovaný tak, aby zaviedol značku rozpoznávacieho miesta Hin dIII v rámci endogénneho lokusu (Obr. 3d). V tomto konštrukte bolo rameno s homológiou 1 476 bp izogénne pre lokus CSN2 prerušené sekvenciou 6 bp, ktorá bola skonštruovaná tak, aby zaviedla rozpoznávacie miesto pre HindIII (generovanie polymorfizmu dĺžky reštrikčných fragmentov (RFLP)). Dôležité je, že (obr. 3d) bol tag umiestnený presne v polohe zlomov vyvolaných ZFN. Tento donorový plazmid sme zaviedli spolu s expresným plazmidom kódujúcim ZFNickázu vytvorenú tak, aby zaviedla SSB do intrónu 2 CSN2 do BFF. Cotransfekcia darcu fragmentu CSN2 párom ZFN1 / ZFN2 (indukujúci DSB) viedla k prenosu RFLP na chromozóm pri frekvencii 7, 8% endogénnych alel CSN2 v neprítomnosti pozitívnej selekcie (obrázok 3e, pruh) 6). Okrem toho BFF kotransfekované párom ZFN1-D450A / ZFN2 ZFNickase (indukujúce SSB) viedli tiež k zavedeniu RFLP do endogénneho lokusu CSN2 pri frekvencii 1, 5% (obrázok 3e, dráha 7). Pridanie RFLP nebolo možné detegovať vo vzorkách ošetrených bez ZFN alebo ZFNickas (obr. 3e, dráhy 2–5).

Analýza identických BF poolov ošetrených ZFN / ZFNickázy pomocou testu Surveyor Nuclease odhalilo indely v 4, 7% alel CSN2, keď sa použil pár ZFN1 / ZFN2 indukujúci DSB (obrázok 3f, pruh 3). Naopak, vo vzorkách ošetrených ZFNl-D450A / ZFN2 ZFNickase neboli detegované žiadne udalosti NHEJ (Obr. 3f, dráha 2). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že cielený DNA nick v lokuse CSN2 môže byť opravený pomocou HDR (s využitím fragmentu donora DNA obsahujúceho RFLP), a takéto niky nevytvárajú indely charakteristické pre opravnú cestu NHEJ.

ZFNickázy podporujú HDR-sprostredkovanú miestne špecifickú adíciu génov

Vytvorili sme gén zameraný na gén, pCSN2-Lys-Neo-EGFP, vložením zrelej časti génu lyzostafínu s akceptorovou sekvenciou zostrihu do miesta HindIII donoru fragmentu CSN2 (obr. 4a, b). Tento cieľový vektor sme zaviedli spolu s expresnými plazmidmi kódujúcimi ZFN / ZFNickázy, ktoré boli skonštruované tak, aby zaviedli DSB / SSB v intróne 2 CSN2 do BFF (obrázok 4c, d). Na transfekciu sa použili dve rôzne primárne bunkové línie BFF s skorým pasážovaním (P2 alebo P3): ženská bunková línia, BFF 0911 a samčia bunková línia, BFF1101 (tabuľka 1). Stabilne transfekované bunky prítomné v cieľových bunkových populáciách boli identifikované po 7 až 9 dňoch (600 μg ml -1 ) G418 selekcie.

Image

a ) Schematický prehľad znázorňujúci stratégiu zacielenia pre lokus CSN2. Modré škatule, exóny CSN2; vertikálna šípka, translačné iniciačné signály (ATG) p-kazeínu; tučná zvislá šípka, genómové miesto rezané príslušným párom ZFN; vodorovné čiary šípok, priméry používané pre spojovacie PCR a PCR s dlhým dosahom; Polohy a orientácie loxP miest sú označené ako duté šípky. Vyššie uvedené je schéma konštrukcie plazmidu darcu. Vytvoril sa donorový plazmid zodpovedajúci miestu štiepenia ZFN párov a niesol každú zhruba 700-bp homológnu oblasť k sekvencii CSN2 obkličujúcu miesto štiepenia. SA, zostrihová akceptorová sekvencia; Lys, génová sekvencia lysostafínu; pA, polyadenylačné signály; Neo, gén rezistencie na neomycín; GFP, zosilnený gén zeleného fluorescenčného proteínu; PTK, promótor proteínovej tyrozínkinázy; CMV, okamžitý skorý promótor ľudského cytomegalovírusu; Amp, gén rezistencie na ampicilín. Vsadenie vpravo hore je kresba dvoch ZFN, ktoré sa viažu na konkrétne genomické miesto (veľké písmená), čo vedie k dimerizácii nukleázových domén FokI. ( b ) vektorové mapy vektora zameraného na gény pCSN2-Lys-Neo-GFP. ( c, d ) Hovädzie fibroblasty boli transfekované vektorom na cielenie génov pCSN2-Lys-Neo-GFP, c je pohľad na svetlé pole d. Mierka stupnice predstavuje 100 μm.

Obrázok v plnej veľkosti

Tabuľka v plnej veľkosti

Kolónie rezistentné na liečivo boli trypsinizované a skrínované na zameranie udalostí pomocou 5 'junction PCR s použitím primerov 5JP1 a 5JP2 špecifických pre lokus CSN2 a gén Lysostaphin, aby sa potvrdilo, či stabilná genetická modifikácia buniek v každej z týchto experimentálnych skupín bola spôsobená cieleným alebo náhodná inzercia DNA (obr. 4a). Z celkom štyroch transfekcií v dvoch rôznych bunkových líniách sa odobrali 1138 kolónie rezistentné voči G418 a 131 kolónií (11, 5%) z nich bolo pozitívnych na zacielenie génov CSN2 v počiatočnej 5'junkčnej PCR obrazovke (rozsah 4, 2 - 21, 5% pre rôzne transfekcie; tabuľka 1).

Na vylúčenie potenciálnych falošne pozitívnych výsledkov sme použili 3 'spojovaciu PCR na genómovej DNA z 5' spojovacích PCR pozitívnych kolónií pomocou primérov 3JP1 a 3JP2 na amplifikáciu pravého spoja medzi endogénnou a exogénnou DNA (Obr. 4a). Ďalej sme uskutočnili PCR s dlhým dosahom s oboma primermi (LRP1 a LRP2) umiestnenými mimo oblasti rekombinácie (obr. 4a). Zistili sme, že 8, 7% (99) kolónií rezistentných voči G418 obsahovalo správne cielené bunky (tabuľka 1). Niekoľko cieľových kolónií dozrelo skôr, ako sa mohli pripraviť na prenos jadra. Bol skontrolovaný karyotyp každej kolónie; všetky mali chromozómové čísla v rozsahu podobnom čerstvo izolovaným bunkám BFF (~ 80% nátierok so 60 chromozómami). Nakoniec bolo k dispozícii 69 kolónií na výber klonovanej cieľovej populácie so stabilným karyotypom, ktorý by sa mohol rozšíriť na prenos jadrom (tabuľka 1).

Jadrový prenos na produkciu kráv zameraných na gény

Aby sme vylúčili náhodnú integráciu transgénu, nasadili sme Southern blot analýzy genómovej DNA štiepenej Bgl II extrahovanej z spojovacej PCR a kolónie pozitívnych na PCR s dlhým dosahom (obr. 5). Na analýzu Southern blot sa použilo šestnásť cielených kolónií (osem kolónií zo skupiny indukovanej ZFNickasami a osem kolónií vyvolaných ZFNs). Ako je znázornené na obr. 5, iba jeden klon (dráha 8) obsahoval druhú náhodnú integráciu transgénu. Potom bolo pripravených 12 cielených kolónií bez náhodnej integrácie na nukleárny prenos somatických buniek (SCNT). Nakoniec bolo úspešne zrekonštruovaných 5 799 embryí, do štádia blastocysty bolo vyvinutých 1 671 embryí (miera tvorby blastocýst sa pohybovala v rozmedzí od 25, 8 do 31, 9%) a medzi skupinami nebol pozorovaný žiadny významný rozdiel v rýchlosti štiepenia alebo tvorby blastocyst. Na prenos embryí bolo použitých celkom 559 príjemcov. Miera tehotenstva príjemcov, ktorí dostali kolónie indukované ZFNickázou, bola vyššia ako miera príjemcov, ktorí dostávali kolónie indukované ZFNs (tabuľka 2). Nakoniec sa vyvinulo 19 zo 140 tehotenstiev (16 pochádzajúcich zo skupiny indukovanej ZFNickase a 3 zo skupiny indukovanej ZFN), čo viedlo k 14 živým teľatám zameraným na gény, s pôrodnou hmotnosťou medzi 45 a 55 kg. Šesť z týchto teliat zahynulo krátko po narodení, ale osem žilo viac ako 1 mesiac (tabuľka 2). Všetky tieto defekty boli často opísané u klonovaného hovädzieho dobytka 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 . Neočakávali sme, že by abnormálne fenotypy boli priamym dôsledkom adície na zacielenie génov s použitím ZFN alebo ZFNickases, pretože darcovské bunky pre SCNT boli prísne vybrané na jednokópiovú a miestne špecifickú integráciu exogénneho génu bez vloženia mimo cieľ do ich genómov., Ďalej sme tieto druhy buniek použili pre SCNT a získali 8 živých kráv zameraných na gény.

Image

Dráha 1, netransfekované bunky sa použili na negatívnu kontrolu. Dráhy 2 - 9, 8 kolónií zo skupiny indukovanej ZFN. Dráhy 10 - 17, 8 kolónií zo skupiny indukovanej ZFNickasami.

Obrázok v plnej veľkosti

Tabuľka v plnej veľkosti

Očakávali sme, že teľatá by boli heterozygotné na knock-in kazetu Lys-neo-EGFP v lokuse CSN2, a preto by mali jednu normálnu kópiu a jednu cielenú kópiu génu CSN2 (obrázok 6a). Použili sme 5 'spojovaciu PCR, 3' spojovaciu PCR a PCR s dlhým dosahom na overenie, či 14 teliat zameraných na gén, vrátane tých 6, ktoré zomreli postnatálne, obsahuje cielený lokus CSN2 (obrázok 6b). Taq DNA polymeráza neaplikuje účinne amplifikáciu dlhších cieľov (> 5 kb), pravdepodobne preto, že nemá exonukleázovú aktivitu 3 '→ 5' a nemôže korigovať nesprávne vložené dNTP. Rýchlosť predĺženia z nezhody je výrazne znížená, čo znižuje výťažok dlhších produktov, čo naznačuje vyššia intenzita PCR pásu s dlhým dosahom z neadresnej alely v porovnaní s intenzitou cieľovej alely. Na potvrdenie úspešného zacielenia sa použila aj analýza Southern blot. Ako sa očakávalo, pri použití štiepenia Bgl II a sondy 5 'mimo vonkajšej oblasti homológie genómu vykazovali mláďatá teliat CSN2 dva pásy: pás 7, 5 kb z endogénnej alely CSN2 a pás 5, 6 kb charakteristický pre inzerciu ( Obrázok 6c, horný). Pás 5, 6 kb bol tiež detegovaný pomocou neo sondy (Obr. 6c, nižšie).

Image

a ) Schéma hovädzieho dobytka CSN2 a štruktúra cieľového miesta po homológnej rekombinácii. Mená a polohy primerov použitých pre Junction PCR a PCR s dlhým dosahom sú označené krátkymi šípkami. Červené stĺpce označujú sondu použitú pre Southern blot analýzu. Je uvedená predpokladaná veľkosť Southern hybridizačných prúžkov s digesciou BglII, tak pre endogénny lokus CSN2, ako aj pre lokus zameraný na CSN2. b ) PCR analýza vykonaná na chromozomálnej DNA netransgénnej kravy (dráha 1) a ôsmich teliat zameraných na gény, ktoré prežili viac ako 1 mesiac (dráha 2–9) a šiestich teliat uhynutých krátko po narodení (dráha 10–15), 5'junkčná PCR by mala produkovať 1376-bp PCR produkty s použitím primerov 5JP1 a 5JP2 (horný), 3'junkčná PCR by mala poskytovať 1419-bp PCR produkty s použitím primerov 3JP1 a 3JP2 (stredný), PCR s dlhým dosahom by mala viesť k 1, 4-kb PCR produkty (štandardná alela) a 5, 4 kb PCR produkty (cielená alela) s použitím primerov LRP1 a LRP2 (nižšie). Polohy a veľkosti konkrétnych produktov PCR sú uvedené vpravo. ( c ) Southern blot analýza mláďat teliat CSN2. Dráha 1 obsahuje normálnu kravskú DNA štiepenú Bgl II ako negatívnu kontrolu. Dráha 2 - 9 sú genómovou DNA štiepenou Bgl II z ôsmich teliat zameraných na gény, ktoré žili> 1 mesiac. Pri použití vonkajšej sondy 5 'oblasti homológie genómu vykazovali mláďatá teliat CSN2 dva pruhy: pás 7, 5 kb z endogénnej alely CSN2 a pás 5, 6 kb, charakteristický pre inzerciu (horný). Pás 5, 6 kb bol tiež detegovaný pomocou neo sondy (nižšie). d ) Nukleotidová sekvenčná analýza spojení medzi endogénnou a exogénnou DNA, ktorá zodpovedá HR udalostiam. 1 376 bp a 1 219 bp PCR produkty špecifické pre ľavú a pravú križovatku sú označené tmavými a svetlo modrými čiarami. Údaje o primárnych nukleotidových sekvenciách, ktoré zodpovedajú prechodným oblastiam medzi ramenami homológie pCSN2-Lys-Neo-GFP a vonkajšou hostiteľskou chromozomálnou DNA a medzi ramenami homológie pCSN2-Lys-Neo-GFP a vnútornou transgénovou DNA.

Obrázok v plnej veľkosti

Nakoniec sme testovali, či spojenia medzi CSN2 a vloženou DNA boli presné na úrovni nukleotidov. My PCR sme amplifikovali ľavý a pravý spoj medzi endogénnou a exogénnou DNA z génov zameraných na gény s použitím sady primérov 5JP1 plus 5JP2 a 3JP1 plus 3JP2 (obr. 6d). Klonovali a sekvenovali sme výsledné fragmenty 1 376 bp a 1 419 bp. Na oboch stranách oboch homologických ramien (obr. 6d) neboli žiadne bodové mutácie ani mikroorganizmy (ako sú indely). Tieto výsledky spolu s výsledkami PCR (Obr. 6b) a Southern blotting (Obr. 6c) jasne demonštrujú kapacitu ZFNickáz so sekvenčne a vláknovo špecifickou endonukleázovou aktivitou na spustenie homológiou riadenej inzercie funkčnej expresnej jednotky v natívny lokus v hovädzom genóme.

Teľatá predpubertálne zamerané na gény (GT12120 a GT12128) vo veku 4–5 mesiacov s hmotnosťou 90–150 kg boli indukované na laktát, ako už bolo opísané 28 . Očakávalo sa, že expresia exogénneho génu lyzostafínu bude napodobňovať expresiu endogénneho p-kazeínu. Lyzostafínový proteín bol v skutočnosti prítomný v mlieku od dvoch transgénnych kráv, ale nie v mlieku od netransgénnej kravy (obrázok 7a). Okrem toho došlo k jasnému zníženiu expresie CSN2 u transgénnych kráv v porovnaní s netransgénnou kravou (obr. 7b). Bakteriolytickú aktivitu mlieka z transgénnych kráv sme demonštrovali pomocou testu lýzy, pri ktorom sa vzorky mlieka inkubovali na trávniku S. aureus (obr. 7c). Z analýzy Western blot mlieka testovaného s protilátkou proti rekombinantnému lyzostafínu pre transgénne zvieratá GT12120 a GT12128 je koncentrácia lyzostafínu v transgénnom mlieku ~ 5 ng μl -1 (obrázok 7a). Biologická aktivita in vitro pre 50 ng (10 μl transgénneho mlieka) transgénne produkovaného lyzostafínu bola ekvivalentná 5 ng rekombinantného lyzostafínu (obr. 7c), čo naznačuje, že transgénne produkovaný proteín je ~ 10% aktívny ako bakteriálne získaný rekombinantný lyzostafín.

Image

a ) Western blot analýza mlieka sondovaného protilátkou proti rekombinantnému lyzostafínu: 1 μl mlieka z kráv zameraných na gény GT12120, GT12128 a netransgénnej kravy AU1119. Bakteriálne získaný rekombinantný lyzostafín vo fyziologickom roztoku (10 ng). b ) Western blot analýza na expresiu p-kazeínu: Použilo sa 1 μl mlieka z kráv zameraných na gény GT12120, GT12128 a netransgénnej kravy AU1119. c ) Stanovenie stafylolytickej aktivity na bakteriálnych doštičkách. Lytické zóny vyvinuté na trávniku S. aureus 12 hodín po aplikácii vzorky: 10 μl mlieka z netransgénnej kravy (1) a 10 μl (500 ng ml −1 ) rekombinantného lyzostafínu (2) a 10 μl mlieka z kráv zameraných na gény ( 3, 4). d ) Osem teliat zameraných na gény žilo dlhšie ako jeden mesiac.

Obrázok v plnej veľkosti

diskusia

Tu demonštrujeme uskutočniteľnosť adície génov stimulovaných ZFNickase na endogénnych hovädzích lokusoch a úspešnú produkciu klonovaných kráv pomocou SCNT s použitím buniek zameraných na ZFNickase. Adícia génov sprostredkovaná ZFNickázou je lepšia ako konvenčné zacielenie na ZFN kvôli svojej vysokej účinnosti a neprítomnosti významnej mutagenézy opravnou cestou NHEJ náchylnou na chyby 20, 29 .

Aplikácia transgenézy na smerovanie expresie cudzieho proteínu do materského mlieka bola prvýkrát publikovaná v roku 1987 (odkaz 30). Transgény špecifické pre laktáciu boli odvtedy včlenené do ošípaných 31, oviec 32, kôz 33 a hovädzieho dobytka 34 a boli primárne určené pre farmaceutické záujmy, ktoré sa snažili vytvoriť živočíšne bioreaktory. Produkcia mliečnych antibakteriálnych proteínov na zvýšenie odolnosti proti mastitíde bola navrhnutá ako prvotná poľnohospodárska aplikácia tejto technológie 15, 35 . V mlieku od transgénnych kráv, ktoré boli skonštruované tak, aby produkovali lyzostafín v mlieku, bola pozorovaná antibakteriálna aktivita 17 . Technológia, ktorá sa potom použila, bola jednoducho náhodná integrácia transgénu, ktorý obsahoval lyzostafín a regulačnú oblasť beta-laktoglobulínu. V tejto štúdii uvádzame technológiu, ktorá umožňuje produkciu presne skonštruovaného transgénneho hovädzieho dobytka. Úspešne sme vložili bakteriálny lyzostafínový gén do lokusu teliat beta-kazeínu. Keď sa tieto teľatá priviedli k laktátu, mlieko obsahovalo lyzostafín, ktorý mal antibakteriálnu aktivitu. To predstavuje krok k prípadnému schváleniu transgénnych zvierat FDA, pretože transgén je možné vložiť do vopred definovaného miesta.

Metóda vývoja bunkovo ​​sprostredkovanej transgenézy založená na SCNT poskytuje príležitosť formovať genetické zloženie hospodárskych zvierat oveľa cielenejším prístupom ako tradičné systémy šľachtenia a selekcie zvierat. Pokrok v cielenej modulácii živočíšnych genómov je v súčasnosti obmedzený nízkou účinnosťou génového zacielenia, ktoré je vyvolané nízkou frekvenciou homológnej rekombinácie a obmedzenou proliferačnou kapacitou primárnych somatických buniek, ktoré sa používajú na produkciu transgénnych zvierat. Posledné nové technológie umožňujú cielenú úpravu genómov v rôznych systémoch. To zahŕňa presnú manipuláciu s génovými sekvenciami v ich prirodzenom chromozomálnom kontexte a pridanie transgénov k špecifickým genomickým lokusom. Tento pokrok bol uľahčený pokrokom v inžinierstve cielených nukleáz s programovateľnými, miestne-špecifickými doménami viažucimi DNA, vrátane proteínov zinkových prstov a efektorov podobných transkripčným aktivátorom (TALE). Zlepšenie génového zacielenia prostredníctvom nukleázou sprostredkovaného štiepenia DNA je známe už viac ako 15 rokov, ale editácia genómu sa doposiaľ široko neuplatňovala pri produkcii živočíšnych druhov 1, 7, 36, 37, 38 . Genómové inžinierstvo sprostredkované CRISPR sa skúmalo aj na zebrafish 39 a na ľudských bunkách 40, čo preukázalo široké uplatnenie tejto novej technológie. Tieto štúdie naznačujú, že systém CRISPR môže poskytnúť ďalšiu generáciu cieľových štiepiacich reagencií na produkciu živočíšnych druhov.

Nedávno dve nezávislé štúdie o ZFNickázach modifikovali CCR5 špecifické ZFN na výrobu ZFNickáz a ukázali, že tieto nikázy neindukujú signifikantné hladiny indolov v cieľovom mieste 13 a že ZFNickázy nevyvolávajú mutagénne NHEJ pri akejkoľvek merateľnej frekvencii pomocou konvenčného sekvenovania DNA, hlboké sekvenovanie a test T7E1 20 . Ďalšia štúdia nedávno ukázala, že TALEN nickáza môže ovplyvniť korekciu cieľového génu na endogénnom lokusu 41 . Pre aplikácie vo výskume kmeňových buniek a génovej terapii, pri ktorých sú obavy mimo cieľové mutácie, by bola uprednostnená presná editácia genómu s nickázami.

Záverom možno povedať, že relatívne vysoké percento integrácie dlhého fragmentu DNA do vopred určeného miesta v hovädzom genóme ukazuje, že ZFNickázy sú aktívne v BFF. Rovnako ako ZFN, aj ZFNickases sa môžu použiť na produkciu knock-in cows od SCNT. ZFNickázy môžu byť konštruované proti širokému spektru endogénnych génov v priebehu niekoľkých týždňov a pridanie génov riadené ZFNickázou a generovanie knock-in kráv klonovaním sa môže uskutočniť do 10 mesiacov. ZFNikázy, na rozdiel od svojich zodpovedajúcich nukleáz, umožňovali účinné adičné cielenie génov v cieľovom mieste bez alebo s menej indukujúcou nechcenou náhodnou integráciou transgénu (tabuľka 3, obr. 8). Navrhujeme, aby programovateľné nickázy boli novými nástrojmi precízneho inžinierstva genómu, ktoré umožňujú cielené pridávanie génov do všetkých buniek alebo organizmov. Náš úspech s touto stratégiou uľahčí celý rad nových transgénnych technológií prospešných pre poľnohospodárstvo aj pre biomedicínu.

Tabuľka v plnej veľkosti

Image

Genomická DNA sa digerovala s Bgl II a hybridizovala s vonkajšou 5 'sondou alebo vnútornou neo sondou. Správne zacielené klony bez ďalších integrácií sú označené červenou farbou. Veľkosti fragmentov: pre 5 'sondu a neo sondu, wt, 7, 5 kb, cielené, 5, 6 kb.

Obrázok v plnej veľkosti

metódy

Konštrukcia a validácia ZFN a ZFNickases

ZFN zamerané na intrón 2 hovädzieho génu CSN2 boli navrhnuté a skonštruované Sigma-Aldrichom (St Louis, MO, USA, číslo šarže: 08181029MN). Návrh, klonovanie a validácia ZFN sa uskutočňoval Sigma-Aldrich. Dizajn ZFN zahrňoval použitie archívu vopred validovaných dvojprstových a jednoprstových modulov. Cieľová oblasť bola prehľadaná na pozície, kde v archíve existujú moduly. To umožnilo fúziu dvoch alebo troch takýchto molekúl za vzniku proteínu s 5 prstami, ktorý rozpoznáva miesto 18 bp na spodnom vlákne a fúzie dvoch až troch rôznych modulov, ktoré rozpoznávajú miesto 16 bp na hornom vlákne, ktoré leží 5 bp. ZFNickázy s vláknovo špecifickou nicking aktivitou boli vytvorené zavedením mutácie D450A domény Fok I do plazmidu pZFN1 (ktorý kóduje ľavý ZFN s mutáciami Q486E a I499L) pomocou súpravy QuikChange Site-Directed Mutagenesis (Stratagene, Carlsbad, CA, USA)., Catalog: 200518) 19 . Počet zvyškov každej mutácie sa týka jej polohy v kompletnej Fok I endonukleáze.

Test štiepenia DNA in vitro

Fragment 1, 4 kb lokusu CSN2 obsahujúci cieľové miesto ZFN sa klonoval do vektora PMD19-T (TaKaRa, Dalian, Čína, kód TaKaRa: D102A) a použil sa ako templát pre PCR amplifikáciu 366-bp fragmentu CSN2 s použitím primerov: 5'-TACACTATTTCCTCATCTTCCCATTC-3 'a 5'-GTTAGTCTGTTGCTTATTGGTTTA-3'. Výsledný produkt PCR bol nariedený na 1 ng μl -1 v pufri Fok I pozostávajúcom z 20 mM Tris-HCI, pH 8, 5, 150 mM NaCI, 2 mM MgCl2, 5% ( obj./obj . ) Glycerol, 10 mM ZnCl2, 0, 5 mg ml -1 BSA a 1 mM DTT. ZFN sa syntetizovali in vitro s použitím systému TNT T7 Quick Coupled Transcription / Translation System (Promega, Madison, WI, USA, katalóg: L1170) podľa odporúčaní výrobcu. Príslušné ZFN a cieľová DNA 366 bp sa zmiešali v pufri Fok I a inkubovali sa pri 37 ° C počas 2 hodín. Cieľová DNA sa potom extrahovala zmesou fenol / chloroform a buď sa nespracovala (dvojvláknová DNA) alebo sa nechala spracovať (jednovláknová DNA) roztokom glyoxalu / DMSO (1, 0 M glyoxal, 10 mM NaH2P04 / Na2) . HP04, pH 7, 0, asi 50% obj./obj. DMSO) pri 50 ° C počas 1 hodiny 42 . Double-stranded or single-stranded DNAs were then separated on a 10% PAGE and the gel stained with DuRed nucleic acid gel stain (Fanbo Biochemicals). Cleavage was quantified using ImageJ software.

In vivo DNA cleavage assay

The frequency of targeted gene mutation in ZFN-treated cells was determined using the CEL-I nuclease assay This assay detects alleles of the target locus that deviate from WT as a result of NHEJ-mediated imperfect repair of ZFN- and ZFNickase-induced DNA breaks. PCR amplification of the targeted region from a pool of ZFN- or ZFNickase-treated cells generates a mixture of WT and mutant amplicons. Melting and reannealing of this mixture results in mismatches forming between heteroduplexes of the WT and mutant alleles using a temperature programme of: 95 °C per 10 min; 95 °C–85 °C (−2 °C s −1 ); 85 °C–25 °C (−0.1 °C s −1 ); 4 °C hold. A DNA 'bubble' formed at the site of mismatch is cleaved by the Surveyor enzyme (Transgenomic SURVEYOR Kit, Catalogue No.706025), and the cleavage products are incubated at 42 °C for 20 min and electrophoresed on a 10% TBE polyacrylamide gel (BioRad) and quantified by densitometry. The relative intensity of the cleavage products compared with the parental band is a measure of the level of CLE-I cleavage of the heteroduplex. This reflects the frequency of ZFN- or ZFNickase-mediated cleavage of the endogenous target locus that has subsequently undergone imperfect repair by NHEJ. The sequences of PCR primers used for amplification of the CSN2 target locus were: forward primer, 5′-TACACTATTTCCTCATCTTCCCATTC-3′; reverse primer, 5′-GTTAGTCTGTTGCTTATTGGTTTA-3′. A 366-bp PCR product was generated from WT genomic template.

Targeting vector construct

The β-casein targeting vector (pCSN2-Lys-Neo-EGFP) was constructed by PCR to include a 1.4-kb homology arm of β-casein (AC_000163).This 1.4-kb homology arm containing the ZFN-binding site (5′-TTCATCCACTATCTCAGTagtatCCTATGGGACCACAAG-3′) was cloned into pMD19-T (TaKaRa). The unique ZFN cut site (5′-agtat-3′) in the center of the ZFN binding site was converted into a Hin dIII site (5′-AAGCTT-3′) using the QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene; Catalogue: 200518) and the exogenous lysostaphin gene and marker genes were inserted into the Hin dIII site using standard recombinant DNA techniques.

Cell culture and selection

Primary fetal bovine fibroblasts were isolated from 35-day-old fetuses. The head and viscera were removed and the remaining tissue was minced with sterile scissors. Explants were cultured on 60-mm culture dishes (Nunclon, Denmark) in ~1 ml of cell culture medium (DMEM/F12 (Gibco, New York, NY, USA), 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT, USA) and 10 ng ml −1 epidermal growth factor) at 37 °C in 5% CO 2 . In addition, 100 U penicillin and 250 ng amphotericin B (Gibco) were added to inhibit microbial growth. The next day, 3 ml of fresh cell culture medium was added. When the cells from the explants reached 70% confluency, on the third day, they were treated with 0.5 ml TE (0.25% trypsin/0.05% EDTA) and passaged 1:2 or 1:3. Then the cells were trypsinized and frozen in 50% FBS, 40% media and 10% DMSO (Sigma), for long-term storage and future use.

When needed, cells were thawed and grown in DMEM/F12 (Gibco) medium supplemented with 15% FBS and incubated at 37 °C in a 5% CO 2 atmosphere. At 70–80% confluency, cells were harvested by trypsinization and 9–10 million cells were resuspended in 2 ml Opti-MEM (Gibco). The cells were placed in a 4 mm gap cuvette with 10 μg of the targeting vector (pCSN2-Lys-Neo-EGFP) and 5 μg of the ZFNs-encoding plasmids or ZFNickases-encoding plasmids, and electroporated at 510 V with three pulses of 1 ms duration using the BTX Electro-cell manipulator ECM2001. Electroporated cells were mixed with fresh cell culture medium and plated on 10 cm plates at 5 × 10 5 cells per plate. Three days later, cells were placed in culture medium containing 600 μg ml −1 G418 (Sigma) for 6 days. Cell clones were then collected for PCR screening.

Detection of gene-targeting events by PCR

G418-positive cell clones derived from cell population transfected with targeting vector pCSN2-Lys-Neo-GFP and either the ZFN or ZFNickases-encoding plasmids were trypsinized and screened for targeting events by PCR. An aliquot of the trypsinization solution (1/3 of the cells) was plated in culture medium containing serum and expanded (for Southern analysis and cryopreservation), while the remaining cells were pelleted. Cell pellets were resuspended in 50 μl PCR lysis buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.5, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, 0.5% NP-40, 0.5% Tween-20 and 400 μg ml −1 proteinase K). Samples were incubated at 65 °C for 1 h, followed by inactivation of proteinase K at 95 °C for 10 min. Five microlitres of the DNA lysate were then used for PCR. Cellular DNA extracted from parental nontransfected cells served as negative control. Five microliters of the DNA lysate were subjected to PCR with the left-hand CSN2-transgene junctions primers (5'J P1: 5′-TTATGTGGGACAAAGGGGAGA-3′; 5′J P2: 5′-TTCCCGCCTCCATAGTTAGACC-3′), the right-hand CSN2-transgene junctions primers (3'J P1: 5′-CGCCGACCACTACCAGCAGAACAC-3′; 3′J P2: 5′-CAGGCTCCTCCTCTATGGGATTTT-3′), and the long-range PCR primers (LRP1: 5′-TCCCAGAATCTAAGACAT-3′; LRP2: 5′-TTGCCTCTGAATGAACAC-3′). Fifty microliter PCR mixtures containing 0.2 mM of each primer, 80 mM dNTPs, 0.6 U of LA Taq DNA polymerase and LA PCR bufferII (TaKaRa) at 1 × final concentration were placed in a DNA thermal cycler. PCR products representing left- and right-hand CSN2-transgene junctions were cloned into pMD19-T (TaKaRa), and sent to GenScript (Nanjing) Co., Ltd. for sequencing.

Analýza Western blot

Prepubertal female cows 4–5 months old and weighing 90–150 kg were induced to lactate. The cows were given daily intramuscular injections of 17β-Estradiol (0.1 mg kg −1 body weight, Abcam) and progesterone (0.25 mg kg −1, Sigma) for 7 d. Dexamethasone (20 mg day −1, Sigma) was administered intramuscularly on days 18–21. Milk was collected by hand in an aseptic manner for the next 5 d. All samples were centrifuged at 4, 000 g for 10 min at 4 °C. One microliter of milk from gene-targeted cows, GT12120 and GT12128, and nontransgenic cow, AU1119, was used for western blot analysis.

The primary antibody(1:2, 000) used to detect lysostaphin was from AIC BIOTECH (Rockville, MD, USA, Catalogue No.PAb102) and the antibody for β-casein was from Uscn Life Science Inc. (Catalogue No. A98332Bo01).

Nuclear transfer

All experiments were approved by Care and Use of Animals Center, Northwest A&F University. This study was carried out in strict accordance with the Guidelines for the Care and Use of Animals of Northwest A&F University. Ovaries were collected from the local abattoir and transported to the laboratory within 4–6 h in sterile saline at 20 °C. Cumulus–oocyte complexes (COCs) were aspirated from 4 to 8 mm antral follicles. Only COCs with compact cumulus and evenly granulated cytoplasm were collected and incubated in bicarbonate-buffered tissue culture medium 199 (TCM-199; Gibco, BRL, Grand Island, NY, USA) supplemented with 10% ( v / v ) FCS, 0.075 IU ml −1 human menopausal gonadotropin (HMG), 1 μg ml −1 17-estradiol and 20 ng ml −1 epidermal growth factor (EGF) for 20–22 h at 38.5 °C in 5% CO 2 in air. Cumulus cells were stripped from COCs in PBS containing 0.2% bovine testicular hyaluronidase and incubated in PBS containing 5 μg ml −1 cytochalasin B (CB) and Hoechst 33, 342 10 μg ml −1 for 10 min prior to enucleation. Matured oocytes were enucleated by aspirating the PB and a small amount of surrounding cytoplasm in microdrops of PBS supplemented with 5 μg ml −1 cytochalasin B (CB) and 10% FBS. The aspirated cytoplasm was examined under ultraviolet radiation to confirm that the nuclear material had been removed. Nuclear donor cells were induced in G0/G1 phase of cell cycle by serum deprivation prior to use for SCNT. The disaggregated donor cell was injected into the pre-vitelline space of enucleated oocytes. The oocyte–cell couplet was sandwiched with a pair of platinum electrodes connected to the micromanipulator in microdrop of Zimmermann's fusion medium. A double electrical pulse of 35 V for 10 μs was applied for oocyte–cell fusion. Successfully reconstructed embryos were kept in mSOFaa for 1 h. Reconstructed embryos were activated in 5 μM ionomycin for 4 min, followed by exposure to 1.9 mM dimethylaminopyridine in SOFaa medium for 4 h. Embryos were then cultured in SOFaa medium supplemented with 8 mg ml −1 BSA in a humidified atmosphere of 5% CO 2 in air at 38.5 °C. Fresh day 7 blastocysts were nonsurgically transferred (two embryos per recipient) to the uterine horn ipsilateral to the corpus luteum in Red Angus recipients on the seventh day of standing oestrus. Pregnancy was detected by rectal palpation/ ultrasonography at 90 days of gestation.

Southern blot analysis of cow tissues

Calf ear biopsies were lysed overnight at 60 °C in a shaking incubator with ~1 ml lysis solution (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.15 M NaCl, 10 mM EDTA, 1% SDS, 25% sodium perchlorate, 1% 2-mercaptoethanol and 200 μg ml −1 proteinase K) per 150 mg tissue. DNA was subjected to phenol/chloroform extraction and precipitated with isopropyl alcohol. Resolubilized DNA was treated with RNase A (1 mg ml −1 ) and RNase T1 (1, 000 U μl −1 ) at 37 °C for 1 h, then with proteinase K (20 mg ml −1 ) at 55 °C for 1 h. DNA was then extracted with phenol/chloroform, precipitated with ethanol and resuspended in TE buffer. About 10 μg DNA was digested with Bgl II and separated on a 1% agarose gel. Following electrophoresis, DNA was transferred to a nylon membrane and probed a 3′-end digoxigenin-labeled probe. Bands were detected using a chemiluminescent substrate system.

Detection of lysostaphin bioactivity

Lysostaphin bioactivity was detected in drops (10 μl) of standards or samples that were spotted onto culture plates that had just been streaked with a culture of S. aureus (ATCC 25923). Following overnight incubation (37 °C), bioactivity was observed as lytic zones in the bacterial lawn. Milk samples used in this test were first pasteurized by heating to 63 °C for 30 min.

Ďalšie informácie

How to cite this article: Liu, X. et al . Zinc-finger nickase-mediated insertion of the lysostaphin gene into the beta-casein locus in cloned cows. Nat. Commun. 4:2565 doi: 10.1038/ncomms3565 (2013).

Komentáre

Odoslaním komentára súhlasíte s tým, že budete dodržiavať naše zmluvné podmienky a pokyny pre komunitu. Ak zistíte, že je niečo urážlivé alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte ho ako nevhodné.