Obvod vizuálnej detekcie pohybu navrhnutý drosophila connectomics príroda

Obvod vizuálnej detekcie pohybu navrhnutý drosophila connectomics príroda

Anonim

predmety

  • Detekcia pohybu
  • Neuroscience

abstraktné

Správanie sa zvierat vyplýva z výpočtov v neuronálnych obvodoch, ale naše chápanie týchto výpočtov bolo frustrované nedostatkom podrobných synaptických máp pripojení alebo konektómov. Napríklad napriek intenzívnym výskumom trvajúcim polstoročie neuronálna implementácia lokálnej detekcie pohybu vo vizuálnom systéme hmyzu zostáva nepolapiteľná. Tu vyvíjame poloautomatizovaný plynovod pomocou elektrónovej mikroskopie na rekonštrukciu konektómu obsahujúceho 379 neurónov a 8 637 chemických synaptických kontaktov v optickej dreni Drosophila . Prispôsobením rekonštruovaných neurónov k príkladom zo svetelnej mikroskopie sme neuróny priradili k bunkovým typom a zostavili konektóm opakujúceho sa modulu drene. V rámci tohto modulu sme identifikovali typy buniek, ktoré tvoria obvod detekcie pohybu, a ukázali sme, že pripojenia k jednotlivým neurónom citlivým na pohyb v tomto obvode boli konzistentné s ich smerovou selektivitou. Naše výsledky identifikujú bunkové ciele pre budúce funkčné výskumy a ukazujú, že konektómy môžu poskytnúť kľúčové pohľady na neurónové výpočty.

Hlavné

Vízia hmyzu bola predmetom intenzívneho behaviorálneho vyšetrenia 1, fyziologického 2 a anatomického 3, avšak naše chápanie základných neurálnych výpočtov ešte zďaleka nie je úplné. Jedným takýmto výpočtom, etologicky vysoko relevantným, je detekcia pohybu, o ktorej sa predpokladá, že sa spolieha na porovnanie signálov posunutých v priestore a čase 4, 5, 6 (obr. La, b). Napriek tomu, že teoretický a experimentálny výskum bol zameraný viac ako pol storočia 7, presný mechanizmus, ktorý je základom tohto výpočtu, zostáva záhadou. Ústrednou prekážkou pri rozbíjaní tohto mechanizmu bola naša neúplná znalosť príslušných neurónov a synapsií.

Image

a, Komponent pohybu modelu Hassenstein-Reichardt EMD 4, smerujúci doprava. Svetelný vstup (blesk) do ľavého kanála (purpurová) sa prenáša s dodatočným oneskorením τ , oproti tomu do pravého kanála (azúrová). Pre objekt, ktorý sa pohybuje vpravo, signály z oboch kanálov dorazia k multiplikačnej jednotke bližšie v čase k sebe, a preto sa nelineárne vylepšia (a naopak pre objekty, ktoré sa pohybujú doľava). Výsledkom je, že model reaguje prednostne na pohyb doprava. b, alternatívny model EMD 6 typu Barlow – Levick podobný EMD 6, ktorý uprednostňuje aj pohyb sprava. Všimnite si, že vstupy sú kombinované s protichodnými znakmi a oneskorenie je teraz na pravom (azúrovom) kanáli. c, Horizontálna sekcia 45 zafarbená bodiánom striebra vizuálneho systému Drosophila melanogaster odhaľujúca štyri neuropily optického laloku. Schéma oblasti záujmu (plný obdĺžnik, expandovaný v roku d ) a širší zobrazovaný objem (prerušovaný obdĺžnik), ktorý sa použil na sledovanie do doštičky lobuly, sú schematicky znázornené. d, Požadovaná oblasť medully 37 μm x 37 μm je sústredená na referenčný stĺpec (červený) a šesť okolitých stĺpcov (modrý). Medulla má desať vrstiev (M1 – M10) definovaných arborizáciou jej bunkových typov. Mierka stupnice, 50 μm ( c ) a 10 μm ( d, vo všetkých troch smeroch).

Obrázok v plnej veľkosti

  • Stiahnite si snímku aplikácie PowerPoint

Za behu vizuálne spracovanie začína v optickom laloku, ktorý sa skladá zo štyroch retinotopicky usporiadaných neuropilov. Každý je súbor opakujúcich sa modulov zodpovedajúcich hexagonálnej mriežke ommatídií v zloženom oku (obr. 1c). Každý modul prvého neuropilu, lamina, obsahuje opakujúci sa obvod 8, 9 prijímajúci vstupy od šiestich fotoreceptorov detekujúcich svetlo z rovnakého miesta vo zornom poli. Výstupné bunky každého vrstveného modulu vyčnievajú na zodpovedajúci modul druhého neuropilu, drene (obr. Lc). Každý modul medulla, nazývaný stĺpec (obr. 1d), tiež obsahuje stereotypné obvody 10 . Tieto stĺpce zase inervujú dva downstream neuropily, lobulu a dosku lobula (obr. 1c).

Reakcie na lokálny pohyb sa musia počítať aspoň čiastočne v rámci stereotypných obvodov stĺpcov medully. Medulla je skutočne prvý neuropil s pohybovo špecifickou aktivitou 11 a priamo za medullou tangenciálne bunky doštičiek lobula (LPTC) integrujú signály miestneho pohybu, aby produkovali pohybovú odozvu v širokom poli 12, 13 . Doposiaľ však nedostatok medulárneho kondomu frustroval výskumy detekcie lokálneho pohybu.

Poloautomatická rekonštrukcia konektómu

Aby sme poskytli spoľahlivý základ pre počítačové modelovanie a identifikovali ciele pre elektro / optofyziologické záznamy, pokúsili sme sa o úplnú, hustú rekonštrukciu chemickej synaptickej konektivity v medulle pomocou elektrónovej mikroskopie, zlatého štandardu neuroanatómie 14 . Vzhľadom na časovo náročnú povahu takýchto rekonštrukcií sme chceli určiť najmenší objem medully, ktorého rekonštrukcia by nám umožnila identifikovať obvod, ktorý je základom výpočtu lokálneho pohybu. Ako smerové sústružnícke odozvy 15, tak aj elektrofyziologické odozvy v LPTC 16 sa môžu vyvolať u mušiek postupnou stimuláciou dvoch fotoreceptorov zodpovedajúcich susedným bodom kdekoľvek vo zornom poli 17 . To naznačuje, že nejaká opakujúca sa súčasť obvodu na detekciu pohybu musí byť prítomná vo všetkých dvoch susedných stĺpcoch drieku. Preto sme sa rozhodli zrekonštruovať všetky synaptické spojenia medzi neurónmi v rámci jedného referenčného stĺpca, ako aj všetky spojenia medzi referenčným stĺpcom a neurónmi v šiestich stĺpcoch najbližších susedov (obrázok 1d).

Pretože manuálna rekonštrukcia aj objemu siedmich stĺpcov by bola neúnosne časovo náročná 18, vyvinuli sme poloautomatizovaný rekonštrukčný plynovod 19 a aplikovali sme ho na objem medully (Obr. 2, Metódy a doplňujúce údaje 1), rekonštruovali sme 379 buniek ( Doplnkový obrázok 1 a doplnkový videozáznam 1).

Image

a, reprezentatívny mikrograf, jeden z 2 769 zo série elektrónových mikroskopov. b, Segmentácia mikrografu korektúry v a do neuritových profilov (jednotlivé farby). c, Synapsy zahŕňajú presynaptický proces obsahujúci pás T-pruhu (červená šípka) a pridružené neurity s postsynaptickými hustotami (PSD) (modré šípky) susediace s T-tyčou. Nesynaptický proces (zelený kruh) nemá PSD (v tejto aj v iných rovinách rezov obsahujúcich tento T-stĺpec). d, Neititi sa rekonštruujú spojením profilov v nasledujúcich sekciách (vľavo), aby sa skonštruoval 3D objekt (vpravo). e, Príklad neurónu rekonštruovaného z elektrónovej mikroskopie (vľavo), identifikovaný porovnaním s Golgi impregnovanou bunkou (stred) 20 ako typ Mi1 a krížovo overený zodpovedajúcim neurónom označeným genetickou jednobunkovou (GSC) (vpravo) (Doplnkové metódy). f, Rovnaké ako e pre typ bunky Tm3. Mierka, 500 nm ( a, b ), 250 nm ( c ) a 10 um ( e, f ).

Obrázok v plnej veľkosti

  • Stiahnite si snímku aplikácie PowerPoint

Na zmapovanie našej rekonštrukcie na existujúce vedomosti sme tieto bunky priradili k predtým navrhovaným bunkovým typom 20 porovnaním tvarov rekonštruovaných tŕňov (doplnkový obrázok 1) s tými, ktoré sa zaznamenali zo svetelnej mikroskopie s použitím Golgiho impregnácie alebo genetického jednobunkového značenia ( 2e, f a doplnkové metódy). Pretože existovalo niekoľko rekonštruovaných príkladov pre takmer všetky typy neurónov (doplnkový obrázok 1 a doplnková tabuľka 2), bolo možné charakterizovať spoločné štruktúrne znaky každého typu. V mnohých prípadoch nám to umožnilo jednoznačne priradiť zrekonštruovanú bunku k Golgiho impregnantu 20, pre ktorý bola potom pomenovaná (doplnkové metódy). Existovala však aj podskupina typov buniek, pre ktoré sa Golgiho náprotivok nemohol nájsť, ale ktorý sme overili pomocou izomorfov z genetického označovania jednotlivých buniek. Tieto bunkové typy sme pomenovali Mi13, Mi14, Mi15, TmY14, Dm9 a Dm10 (doplnkový obrázok 2). Celkovo sme zo zbierky 379 rekonštruovaných buniek (doplnkový obrázok 1) dokázali klasifikovať 290 z nich do 56 typov buniek (doplnková tabuľka 2).

Na odhalenie spojení medzi 379 rekonštruovanými neurónmi sme identifikovali pre- a postsynaptické miesta a priradili sme ich príslušným rodičovským bunkám. V referenčnom stĺpci a jeho bezprostrednom okolí sme anotovali 10 093 presynaptických miest a 38 465 pridružených postsynaptických miest (3, 8 ± 1, 2 (priemer ± sd) na presynaptické miesto) (obr. 2c a doplnková tabuľka 1). Aj keď presynaptické T-tyčky typicky padali na korektúrne profily neurónov, postsynaptické miesta zvyčajne padali na izolované profily, nepriradené k žiadnemu neurónu. Bolo teda potrebné vystopovať dendrit obsahujúci každé postsynaptické miesto späť k rodičovskej bunke. Toto postsynaptické sledovanie bolo nesmierne náročné, pretože vetva neurónov Drosophila dendritov bola komplikovaná a skutočne môže byť tenšia ako hrúbka rezu.

Náročné postsynaptické sledovanie viedlo k (1) niektorým chybne identifikovaným synaptickým kontaktom a (2) k vysokej frakcii (asi 50%) kontaktov, ktoré nebolo možné vysledovať k ich materskému neurónu, a preto neboli identifikované. Aby sme zvýšili našu dôveru v identifikované kontakty (1), mali sme dva korektúry sledujúce každé postsynaptické miesto (metódy) a do spojenia sme prijali iba tie kontakty, ktoré obaja korektori identifikovali nezávisle. Naopak, nebolo možné experimentálne znížiť počet neidentifikovaných kontaktov (2). Stále sme však boli schopní zostaviť konektóm, ktorý je cenný pre odvodenú funkciu, pretože sme zistili, že v medulle spojenia vysokej hmotnosti (to znamená vysoký počet synaptických kontaktov na spojenie) zachytávajú veľkú časť celkovej hmotnosti spojenia a možno identifikovať s vysokou vernosťou. Distribúcia hmotnosti spojenia v našom konektome je skutočne silná (chvostový obrázok 3b, vložený a doplnkový obrázok 3), ako sa zistilo v iných organizmoch 21, 22 . Tiež za predpokladu, že synapsie sa dajú rovnako ťažko opraviť, sme zistili, že akékoľvek silné spojenie (s> 5 synaptickými kontaktmi) bude identifikované s pravdepodobnosťou> 95%. Preto vo výslednom konektome je presne identifikovaných 8 637 synaptických kontaktov a sú zobrazené všetky silné spojenia.

Image

a, Synaptická matica pripojiteľnosti pre modulárne typy buniek zostavená z 2 495 synapsií (doplnková tabuľka 1). Tri dráhy, identifikované pomocou Louvainovej zhlukovacej analýzy 46, sú označené farebnými rámčekmi. Sú pomenované podľa ich primárnych vstupných neurónov: L1 (purpurová), L2 (zelená) a L3 / R7 / R8 (azúrová). Dráhy sú usporiadané podľa celkového počtu spojení v dráhe v zostupnom poradí a typy buniek v každej dráhe sú zoradené podľa súčtu ich pre- a postsynaptických spojení s ostatnými bunkovými typmi v ich dráhe a tiež od nich. v zostupnom poradí. b, Medulla connectome module ako 3D graf. Typy buniek so silnejším spojením sú umiestnené bližšie k sebe pomocou vizualizácie algoritmu rozloženia podobností 47 . Pozorujú sa tri priestorovo segregované skupiny, ktoré úzko zodpovedajú cestám identifikovaným zoskupovaním (sfarbenie guľôčok). Dominantný smer toku signálu je orientovaný na stranu 22 . Vstúpenie vb ukazuje zlomok synaptických spojení v celom pripojenom stave, ktorý má hmotnosť spojenia väčšiu, ako je uvedené.

Obrázok v plnej veľkosti

  • Stiahnite si snímku aplikácie PowerPoint

Prepojovací modul a jeho cesty

Na identifikáciu ciest vykonávajúcich lokálne výpočty, ako je detekcia pohybu, bolo potrebné vygenerovať pohodlnejšiu abstrakciu celého konektómu. Pretože očakávame, že záujmové obvody sa opakujú v každom stĺpci, z extraktu medully sme extrahovali periodický modul spojení medzi identifikovanými typmi buniek, ktoré sa v každom stĺpci striedajú. Zahŕňajú tak tzv. Synperiodické bunkové typy s jednotlivými neurónmi v každom stĺpci meduly 23, ako aj typy buniek s niekoľkými členmi v každom stĺpci, ktoré nazývame ultraperiodické. Nezahŕňame infraperiodické tangenciálne ani lokálne bunky podobné amakrinným bunkám, aj keď majú arborizácie v každom stĺpci, pretože to nemožno jednoznačne určiť z našej rekonštrukcie elektrónovou mikroskopiou (doplnková tabuľka 2). Použili sme existenciu viacerých zástupcov zo susedných stĺpcov v rámci našej rekonštrukcie elektrónovou mikroskopiou (doplnkový obrázok 1) na identifikáciu 25 typov buniek ako synperiodických, ako aj dvoch typov buniek, Tm3 a T4, ako ultraperiodických (s 1, 5 a 4 bunkami na stĺpec). (doplnková tabuľka 2). Tieto 27 typy buniek sme nazvali modulárnymi.

Za predpokladu, že spojenia medzi modulárnymi bunkami sú stereotypné medzi stĺpcami, skonštruovali sme modul opakujúcich sa obvodov nájdením všetkých spojení medzi týmito typmi buniek (metódy). Na rozdiel od riedkych rekonštrukcií výsledný spojovací modul (obr. 3a) presne zachytáva nielen prítomnosť, ale aj absenciu silných spojení medzi akýmikoľvek dvoma typmi buniek.

Aby sme určili, ktoré neuróny by mohli byť zapojené do rôznych lokálnych výpočtov, rozdelili sme spojovací modul do troch samostatných dráh spracovania signálu pomocou algoritmu zhlukovania a rozloženia (obr. 3). Rozpoznali sme ich ako predtým identifikované cesty, cesty L1, L2 a L3 / R7 / R8. Následné ciele R7 a R8 boli predtým zapojené do farebného videnia. Pretože farebné dráhy sú rozdelené do rôznych stĺpcov prijímajúcich vstupy buď z bledého alebo žltého ommatídia 24, očakávame, že by sa mali spoliehať na typy infračervených buniek vynechané z nášho modulu pre pripojenie. Jemná štruktúra dráhy L3 / R7 / R8 sa preto bude inde revidovať.

Zvyšné dráhy L1 a L2 signalizujú vizuálny kontrast a sú zapojené do detekcie pohybu 7, 25, 26, 27, 28, 29 . Behaviorálne experimenty a elektrofyziologické záznamy potvrdzujú túto úlohu pre L1 a L2: nie všetky sú potrebné len pre aspekty detekcie pohybu 29, 30, 31, ale medzi bunkami postsynaptickými na fotoreceptory R1 – R6 sú obidva väčšinou postačujúce 30, 31. pre výpočet. Samotným L1 a L2 však chýba smerovo selektívna reakcia 7, 25 . Preto, aby sme hľadali obvody detekcie pohybu v spojovacom module, podrobnejšie sme skúmali neuróny za L1 a L2.

Okruh detekcie pohybu kandidáta

Niekoľko riadkov dôkazu naznačuje, že informácie o pohybe vypočítané za L1 a L2 po prúde sa prenášajú na dosku lobula prostredníctvom typov buniek T4 a T5 (odkaz 25). Najskôr záznamy z LPTC u plodov s geneticky umlčanými T4 a T5 ukazujú, že aspoň jeden z týchto stĺpcových typov buniek je potrebný na detekciu selektivity smeru 32 . Po druhé, bunky T4 a T5 v Drosophila obsahujú štyri podtypy diferencované vrstvou doštičky lobula, v ktorej ich axóny arborizujú 20 . Po tretie, každá z týchto štyroch vrstiev v doske lobula vykazuje aktivitu v reakcii na stimuly so širokým poľom pohybujúce sa v určitom smere: dolu, nahor, dozadu a dopredu (obrázok 4b, e), odhalené ich absorpciou deoxyglukózy 11, 27., Nakoniec dendrity LPTC s rôznymi preferenciami pohybu spoločne zaberajú vrstvy doštičiek lobuly zodpovedajúce ich smerovej preferencii 20 a navyše prijímajú priame synaptické spojenia z koncov 28 T4. Súhrnne tieto dáta naznačujú, že každý podtyp T4 / T5 tvorí výstup obvodov detekcie pohybu signalizujúcich konkrétny smer pohybu.

Image

a, Pohľad zdola dendritov Mi1 (azúrový) a Tm3 (purpurový) neurónov presynaptických na T4-12, prekrytých radom axonálnych terminálov L1 (žltý). Sýtosť farieb pre každý dendritický tŕň odráža počet synaptických kontaktov vytvorených na T4-12 (pozri b a d ). Šípka ukazuje posunutie od ťažiska Tm3 k ťažisku Mi1 vypočítané tak, ako je to znázornené na obr. b, Bočný pohľad na T4-12 a jeho presynaptické bunky Mi1 a Tm3. Smerová preferencia pre bunku T4 (zafarbená tak, aby zodpovedala smerovým preferenciám v e ), je určená arborizačnou vrstvou labulovej platne axonových terminálov (T-tyče v čiernej farbe). c, Zväčšenie (prerušovaný obdĺžnik v a ) ukazujúci rekonštruované neurity buniek Mi1, Tm3 a L1 (bez vážených farieb v a ) a ich synaptické kontakty (L1 → Mi1: modrá; L1 → Tm3: červená). d, Rekonštruovaná dendritická tŕň T4-12 so synapsiami z Mi1 (modrá) a Tm3 (červená). e, Cartoon vstupov do jednej bunky T4 prostredníctvom buniek Mi1 a Tm3. Vysmievacie synaptické hmotnosti ilustrujú, ako sa vypočítali recepty. Ťažisko zložky Mi1 (alebo Tm3), modrý (alebo červený) kruh, sa počíta umiestnením hmotnosti zodpovedajúcej zloženej synaptickej hmotnosti od L1 až Mi1 (alebo Tm3) do T4 do stredu zodpovedajúceho stĺpca. Mierka stupnice, 8 μm ( a ), 8 μm ( b ), 1 μm ( c ) a 4 μm ( d ).

Obrázok v plnej veľkosti

  • Stiahnite si snímku aplikácie PowerPoint

Ďalej tvrdíme, že smerovo selektívne výstupy T5 a najmä T4 sa počítajú do značnej miery nezávisle od seba. V súlade s analýzou prekrývania vrstiev v Drosophile 26 a veľkých muškách 25, náš konektóm (obr. 3a, b) naznačuje, že T4 patrí do dráhy L1. Naopak, aj keď sme sa nesledovali do lobuly, dendrity buniek T5 spoločne obsadili vrstvy v lobule s axónovými terminálmi neurónov, ako sú Tm1 (ref. 20, 25), Tm2 (ref. 20) a Tm4 (ref. 20), ktoré patria do dráhy L2 (obr. 3b). Elektrofyziologické dôkazy 30 a behaviorálne dôkazy 29 naznačujú, že dráhy L1 a L2 v spojovacom module (obr. 3a, b) sú výpočtovo nezávislé a zodpovedajú dráhám ON a OFF vo vizuálnych systémoch stavovcov 30 . Okrem toho väčšina spojení z dráhy L2 k ceste L1 prichádza cez L5 (obr. 3a), pričom typ bunky nie je zapojený do detekcie pohybu 33 . Preto sme sa rozhodli hľadať obvod detekcie pohybu za L1 zbiehajúcimi sa na T4 bunkách. Toto rozhodnutie sa prijalo napriek elektrofyziologickým dôkazom, ktoré preukazujú nedostatočnú smerovú selektivitu v bunkách T4 34, ale od ukončenia našej práce je podporované vápnikovým zobrazením buniek T435 .

Aby sme identifikovali kandidátske prvky premostenia obvodu detekcie pohybu medzi L1 a T4, využili sme skutočnosť, že detekcia pohybu je tak rýchla, ako aj robustná voči šumu 16, 17, a preto by sa mala implementovať prostredníctvom priameho aj silného spojenia. Naša rekonštrukcia hustou elektrónovou mikroskopiou identifikovala päť typov buniek s významným vstupom z L1: Mi1, Tm3, L5, C2 a C3 (obr. 3a). Typy buniek Mi1 a Tm3 sú dvoma najväčšími príjemcami vstupu L1, pričom spolu tvoria viac ako polovicu synaptických kontaktov L1. Na druhej strane, Mi1 a Tm3 spolu prispievajú> 80% presynaptických vstupov k T4 (vrátane všetkých vstupov od modulárnych aj nemodulárnych typov buniek), čím tvoria dve najsilnejšie cesty od L1 do T4. Naopak, bunkový typ C3 kontaktuje T4 s rádovo menším počtom synapsií ako Mi1 a Tm3, čo naznačuje, že jeho príspevok je oveľa slabší. Nakoniec, typy buniek L5 a C2 nemajú priamo synapsie s T4. Tieto vlastnosti nás vedú k domnienke, že Mi1 a Tm3 sú primárne substráty pre robustnú a rýchlu detekciu pohybu v dráhe L1.

Anatomické recepčné polia T4 buniek

Aby sa ďalej preskúmalo, či by bunky Mi1 a Tm3 konvergujúce na bunkách T4 mohli tvoriť dve ramená korelačného detektora pohybu (obr. La, b), skúmali sme, či je os pohybu definovaná týmito vstupmi na konkrétnom T4 v súlade s jeho preferovaný smer, meraný jeho výstupmi. Tento výstup preferovaný smer bol určený pre 16 neurónov T4 sledovaním ich axónov do doštičky lobula a identifikáciou ich arborizačnej vrstvy 11, 27 (obr. 4b, e).

Na porovnanie preferencie výstupu T4 s osou pohybu vyplývajúcou z jeho vstupov sme zostavili vstupnú pohybovú os analýzou počtu kontaktov z jednotlivých buniek Mi1 a Tm3 na príslušný neurón T4. Zistili sme, že každý T4 prijíma vstupy od niekoľkých neurónov Mi1 a Tm3, čo naznačuje, že na rozdiel od obvodov na obr. La a b, niekoľko bodov vo vizuálnom poli poskytuje vstupy do každého ramena detektora pohybu (obr. 4a, b, e)., Toto pozorovanie je podporené štruktúrou vzorkovacích jednotiek odvodených zo záznamov v blowfly H1 (ref. 36), ktoré prijímajú vstupy z LPTC 37 . Preto sme potrebovali charakterizovať vstupy do každého T4 ako receptory poľa sprostredkované Mi1 a Tm3, mapované do zorného poľa. Za týmto účelom sme sledovali synaptické spojenia z terminálov L1 v 19 stĺpcoch (referenčný stĺpec a okolité 18 stĺpcov) k downstream bunkám Mi1 a Tm3 a potom od neurónov Mi1 a Tm3 k bunkám T4, ktoré prijímajú vstup z referenčného stĺpca (ktorý tiež sa stalo s číslom 19). Výsledné vnímavé polia (obr. 4a a doplnkové obr. 4) zobrazujú vstupy T4 mapované, akoby na poli L1, a teda do zorného poľa.

Vo všetkých bunkách T4 sa zložky sprostredkované Mi1 a Tm3 v receptívnom poli T4 v podstate vzájomne prekrývajú (doplnkový obrázok 4). Ťažiská týchto dvoch komponentov sú skutočne posunuté o menej ako jednu inter-ommatidiálnu vzdialenosť (obr. 5a). Avšak pre 15 T4 buniek je toto vytesnenie stále podstatne väčšie ( P <0, 05), ako by sa získalo náhodou z chýb pri sledovaní. Takáto malá veľkosť posunutia vzhľadom na šírku vnímavých polí súhlasí s predchádzajúcimi dôkazmi odvodenými zo záznamov H1 motýľov a bola teoreticky odôvodnená36.

Image

a, vektory posunu pre každý neurón T4 ( n = 19). Neuróny s výrazným posunutím (tučným písmom) majú 95% intervaly spoľahlivosti (elipsy), ktoré vylučujú pôvod (metódy). Vektory sú v ommatidiálnom referenčnom rámci (do 30 ° od vizuálnych osí). b, Vrch, stredný posun, vypočítaný z a, spriemerovaný cez bunky s rovnakým uprednostňovaným smerom ich výstupu. Spodok, uhlový rozdiel medzi priestorovým posunom pre jednotlivé neuróny T4 a uprednostňovaným smerom jeho výstupu (pre vrstvy doštičiek lobula 1–3 (LP1–3)) koreluje s zlomkom chýbajúcich vstupov L1 (metódy). Bunky T4 s> 15% chýbajúcich vstupov L1 boli vynechané zo stredných posunov (hore). Mierka stupnice, 0, 5 ( a ) a 0, 2 ( b ) vzdialenosť medzi stredmi medzi susednými fazetami.

Obrázok v plnej veľkosti

  • Stiahnite si snímku aplikácie PowerPoint

Je smer posunu medzi komponentmi receptívneho pola Tm3 a Mi1 pre neurón T4 konzistentný so smerovou preferenciou neurónu, ako je definované hĺbkou jeho terminálnej axonálnej arborizácie v doske lobuly? Za predpokladu, že smer posunu je určený z ťažiska komponentov Tm3 do Mi1, obrázok 5b (hore) ukazuje, že smer posunu súhlasí so smerovou preferenciou pre tri zo štyroch vrstiev lamelovej platne. Nesúlad v smere premiestnenia a preferencia pohybu T4 buniek, ktoré končia vo štvrtej vrstve (lamelová doska neskôr 4, LP4), môže byť spôsobená zanedbávanými obvodmi, ktoré špecificky prispievajú k odozvám týchto neurónov T4. Napríklad behaviorálny dôkaz implikuje C3 neuróny pri detekcii pohybu spredu dozadu 33 a predbežné výsledky sledovania skutočne naznačujú, že napriek tomu, že bunky C3 poskytujú rádovo menej vstupov do buniek T4 ako bunky Mi1 alebo Tm3, C3 neuróny sa zameriavajú Bunky LP4 T4 prednostne.

Určitá odchýlka medzi receptívnym posunom poľa a smerovou preferenciou jednotlivých buniek T4 (obr. 5a) inervujúcich vrstvy doštičiek lobuly 1–3 je pravdepodobne spôsobená systematickou chybou v našej rekonštrukcii, ktorá je výsledkom konečnej veľkosti rekonštruovanej oblasti. Rozdiel medzi nameraným posunutím vstupu pre daný T4 a jeho predpovedanou preferenciou smeru skutočne koreluje s váženou frakciou chýbajúcich vstupov L1 do buniek Tm3 pred týmto T4 (obr. 5b, spodná časť), čo podporuje názor, že periférne polia Bunky T4 nemusia byť úplne rekonštruované. Okrem toho môžu byť niektoré zo zostávajúcich odchýlok v orientácii posunu skutočné aj vzhľadom na pozorovanú polovičnú šírku ladiacich kriviek 60 ° - 90 ° získanú zobrazením jednotlivých podtypov 35 T4 vápnikom.

Náš výber merať posun od Tm3 k Mi1 (a nie v opačnom poradí) sa zdá byť svojvoľný bez zahrnutia informácií o oneskoreniach a synaptickej polarite (obr. 1a, b). Aby sme odhadli možné oneskorenie vedenia, zmerali sme dĺžku dráhy a kalibru kmeňov hlavných axónov, ktoré vedú signály pozdĺž buniek Mi1 a Tm3 zo syntezácií L1 do synapsií T4 a zistili sme, že sú podobné, do 10% od seba. Okrem toho boli pri použití rozsahu elektrotonických parametrov meraných v iných muškových neurónoch 38 zodpovedajúce káblové oneskorenia stále iba rádovo jednu milisekundu, rádovo menej ako je to potrebné na detekciu pohybu 29 . Ďalej, hoci boli identifikované niektoré neurotransmitery pre príslušné typy buniek, nepoznáme ich pridružené receptory, a teda ani výslednú synaptickú polaritu.

Pri absencii dôkazu o relatívnom oneskorení a polarite synapsie si môžeme zvoliť smer merania z Tm3 do Mi1, čo vedie k priestorovým posunom konzistentným so smerovou preferenciou predpovedanou hĺbkou terminálu T4 v doske lobula. Za predpokladu, že vstupy Mi1 a Tm3 do T4 sú kombinované s rovnakou značkou, ako v prípade modelu 4 s detektorom pohybu Hassenstein-Reichardt (EMD) (obr. 1a), predpokladáme, že rameno Tm3 detektora pohybu by malo predstavovať dlhšie oneskorenie ako rameno Mi1. Keby však boli vstupy kombinované s protichodnými znameniami, ako v prípade modelu EMD 6 typu Barlow - Levick (obr. 1b), naša predpoveď by bola opačná. Pokiaľ ide o mechanizmus oneskorenia, umožňuje mať obe ramená obvodu implementované rôznymi typmi buniek možnosť, že oneskorenie sa môže realizovať biologicky pomocou metabotropných receptorov, ako sa uvádza v sietnici 39 stavovcov.

Pri skúmaní rekonštruovaných buniek T4 sme identifikovali doteraz nerozpoznaný znak ich dendritických tŕňov medully (pozri však T4a, d na obr. 14 v ref. 20 a NJ Strausfeld, osobná komunikácia): dendritické vetvy každého neurónu T4 sú orientované primárne v jednom smere (obr. 6a a metódy). Ďalej, orientácia vetiev každého T4, meraná od špičiek dendritov k ich základniam, sa zhlukuje okolo jedného zo štyroch smerov (obrázok 6b). Tieto štyri smery, keď sú mapované z rámu súradníc medully na zorné pole (obr. 6c), sú zarovnané s preferenciou smeru výstupu pre každú vrstvu doštičky lobula (obr. 6b). Toto pozorovanie nám umožnilo krížovú validáciu klasifikácie každej zo 16 T4 buniek do subtypov smerových preferencií (obr. 6a, b a doplnkový obr. 5). Toto pozorovanie sme potom použili na odvodenie smerovej preferencie pre zostávajúce tri bunky T4, pre ktoré nebolo možné dokončiť sledovanie do doštičky lobula (obr. 6c).

Image

a, Štyri reprezentatívne dendritické tŕne medully T4 buniek. Farby predstavujú lokálnu orientáciu dendritických vetiev. Farebná mapa bola vytvorená priradením farieb z každej vrstvy doštičky lobula (obr. 4e) k priemernej dominantnej orientácii vetvy nad všetkými neurónmi v každej vrstve (šípky vo farebnej mape) a hladkou interpoláciou. b, Hĺbka axonálneho tŕňa neurónu T4 v doske lobuly koreluje s dominantnou orientáciou dendritických vetiev v drene (metódy). Na osi hĺbky sú označené štyri vrstvy a neuróny v každej vrstve sú zafarbené ako na obrázku 4e. Dominantné orientácie neurónov s axónmi, ktoré nie sú sledované k doske lobuly, sú vynesené na osi x (1: T4-5, 2: T4-4, 3: T4-14) a sú zafarbené farbou zhluku na do ktorého pravdepodobne patria (doplnkový obrázok 5). c, Transformácia dominantnej dendritickej orientácie (± sem) z priestoru definovaného radom stĺpcov medully (vo vrstve M10) do smerov vo vizuálnom priestore. Mierka, 5 μm.

Obrázok v plnej veľkosti

  • Stiahnite si snímku aplikácie PowerPoint

diskusia

Táto správa zaviedla nový vysoko výkonný poloautomatizovaný plynovod na rekonštrukciu elektrónovej mikroskopie a použila ho na rekonštrukciu komplexného modulu komplexne v medulle, neuropilu, ktorý už dlho takýmto pokusom odolával. Ďalej sme pomocou connectomiky identifikovali vstupy Mi1 a Tm3 do neurónov T4 ako dve ramená kandidátskeho pohybového detektora pohybu. Aj keď anatómia sama osebe neumožňuje snímať nelineárnu operáciu alebo časové oneskorenie, a teda rozlišovať medzi rôznymi modelmi založenými na korelácii 5, 6, 40, boli sme schopní predpovedať, ktorý typ bunky by mal vzhľadom na svoju synaptickú polaritu zavádzať dlhšie oneskorenie. (Obr. La, b).

Podobne ako v našom navrhovanom obvode za L1, spojenia v rámci našej rekonštrukcie elektrónovou mikroskopiou nám umožňujú navrhnúť typy vhodných buniek - Tm1, Tm2 a Tm4 -, ktoré môžu tvoriť obvod detekcie pohybu za L2. Potvrdenie tohto návrhu musí samozrejme počkať na hustú rekonštrukciu spojení na neurónoch T5 v lobule.

Táto správa obsahuje niekoľko zaujímavých paralel s výsledkami sietníc stavovcov. Po prvé, existencia štyroch podtypov buniek T4 reagujúcich na štyri hlavné smery pohybu pripomína štyri podtypy smerovo selektívnych gangliových buniek ON-OFF (DSGC) v králičej sietnici 41 . Po druhé, naše zistenie, že smerová selektivita T4 buniek je zladená s ich dendritickou orientáciou, pripomína reminiscenciu gangliových buniek 42 JAM-B a amakrinných buniek hviezdicovitých (SAC) 43 v myšacej sietnici. Na rozdiel od buniek JAM-B a SAC je však preferovaný smer buniek T4 vzdialený od špičky dendritov a na rozdiel od buniek SAC, ale podobne ako buniek JAM-B, všetky dendrity v jednom T4 smerujú rovnakým smerom. Po tretie, vysoko špecifické spojenia medzi SAC a DSGC, ktoré sú zodpovedné za smerovú selektivitu týchto systémov, sa tiež predtým preukázali pomocou rozsiahlych pripojovacích systémov 44 . Na rozdiel od obvodu SAC-DSGC však obvod, ktorý uvádzame, môže vypočítať smerovo selektívne odpovede z nesmerových vstupov.

Naša identifikácia kandidátnej dráhy detekcie pohybu za L1 bola značne podporená komplexnosťou rekonštrukcie našej elektrónovej mikroskopie. Vo vzťahu k pripojeniam odhadnutým prekrývaním tŕňov 26, ktoré majú presné synaptické počty, nám umožňujú jednoznačne vytvárať spojenia (doplnkový obrázok 6). Týmto spôsobom sme identifikovali Tm3 ako primárnu súčasť obvodu detekcie pohybu, čo je skutočnosť, ktorá unikla predchádzajúcim výskumníkom kvôli jeho minimálnej arborizácii v M10. Okrem toho, vzhľadom na riedke rekonštrukcie v iných systémoch, napríklad synaptické spojenia medzi SAC a DSGC 44, nám komplexnosť umožňuje argumentovať tak neexistenciu alternatívnych ciest, ako aj numerickú dôležitosť navrhovanej cesty.

Dôležitosť hustého medulárneho konektómu siaha aj ďaleko za lokálny detektor pohybu, ktorý sa vzťahuje na mnoho ďalších vizuálnych výpočtov. Aj keď je potrebné urobiť ešte veľa, najmä na úplné začlenenie tangenciálnych a infraperiodických buniek, náš konektóm obsahuje stĺpcové neuróny nachádzajúce sa v každom stĺpci, a preto odstraňuje dlhodobý blok na porozumenie videnia hmyzu. Všeobecnejšie povedané, naše výsledky ukazujú, že v spojení s bohatou zbierkou experimentálnych a teoretických výsledkov môžu konektómy prostredníctvom identifikácie základných obvodov poskytnúť kľúčové informácie o výpočte neurónov.

Zhrnutie metód

Mozog muchy bol pripravený na elektrónovú mikroskopiu vysokotlakovou substitúciou zmrazenia / zmrazenia, nasledovalo vloženie a rozdelenie. Rezy boli zobrazené pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie. Elektrónové mikrografy boli zostavené do trojrozmerného zväzku, ktorý správne reprezentoval relatívne polohy zobrazovaných štruktúr pomocou nelineárnej registrácie. Zarovnaný zväzok obrázkov v odtieňoch sivej bol pomocou algoritmov strojového učenia rozdelený do podskupín pixelov, z ktorých každý patril iba do jedného neurónu (pozri //bitbucket.org/shivnaga/sstem). Táto nadsegmentovaná oblasť bola manuálne skontrolovaná a aglomerovaná do jednotlivých neurónov („korektúra“). Presynaptické terminály a postsynaptické hustoty sa potom anotovali rukou a priradili sa k neurónom (doplňujúce údaje 1). Tieto manuálne kroky si vyžadovali 14 400 osôb-hodín (vrátane 2 500 odborných hodín). Typy rekonštruovaného neurónu boli určené porovnaním ich tvarov s príkladmi zo svetelnej mikroskopie. Celý konektóm sa skondenzoval do konektomového modulu, ktorý sa rozdelil na cesty pomocou algoritmov rozloženia grafov a zoskupovania. Počítaním počtu synaptických kontaktov medzi bunkami L1, Mi1, Tm3 a T4 sme vypočítali relatívne posunutie vstupných komponentov. Tento posun sme krížovo overili oproti smerovej preferencii buniek T4 zistených sledovaním ich axónov do platničky lobuly.

Metódy online

Príprava tkanív, elektrónová mikroskopia a zobrazovanie

Pravá časť mozgu samičieho mušky divokého typu Oregon R sa sériovo rozdelila na plátky 40 nm. Celkovo bolo zobrazených 1 769 rezov prechádzajúcich driekom a dolnými neuropilami (obrázok 1c) pri zväčšení × 5 000. Tento proces je podrobne opísaný v doplnkových metódach.

Poloautomatizovaný rekonštrukčný plynovod

Na získanie hustej elektrónovej mikroskopickej rekonštrukcie referenčného stĺpca sme použili postupnosť krokov automatického zarovnania a segmentácie, po ktorých nasledovalo manuálne korektúry a rekonštrukcie, ktoré sme opísali ako poloautomatizovaný rekonštrukčný plynovod 19 .

Zarovnanie obrázka

Najprv sme našli hrubé zarovnanie celého súboru obrázkov, ignorujúc artefakty, ako sú záhyby, trhliny a oklúzie špiny, pomocou rigidnej registrácie 48 TrakEM2 na zarovnanie blokov obrázkov pozostávajúcich z 20 sekcií mozaík 9 × 9 a potom zarovnaním blokov automatizovaným spôsobom. prehľadajte obrázky v strede každej mozaiky. Toto hrubé zarovnanie slúži na určenie, ktoré snímky sa prekrývajú, čo umožňuje presnejšiu analýzu tkanív s artefaktmi, a najmä veľké záhyby. Predpokladalo sa, že pixely oveľa tmavšie ako priemer zodpovedajú záhybom a boli použité na rozdelenie každého obrázka na dve alebo viac pripojených komponentov, ktoré sa nazývajú záplaty. Pre každú dvojicu prekrývajúcich sa záplat, a to ako v úseku (pozdĺž hranice), tak aj v sekciách, boli korelačné body nájdené korelačné body (~ 1 na 500 000 prekrývajúcich sa pixelov). Najmenšie štvorce týchto bodov s regularizáciou pre mierku a skosenie sa potom použili na vytvorenie globálneho afinného zarovnania všetkých záplat. Skúmanie chýb z tohto prispôsobenia identifikovalo obrázky, pre ktoré bolo automatické rozdelenie na záplaty nepresné, a tieto rozdelenia boli opravené manuálne. Akonáhle bolo dosiahnuté uspokojivé prispôsobenie, každá záplata každého obrazu bola potom mierne zdeformovaná, aby poskytovala čo najlepšiu zhodu svojmu susedovi (susedom), pričom stále zostala blízko globálnej afinity. Viac informácií je k dispozícii v ref. 49.

Automatická segmentácia obrazu

V ďalšom kroku sme rozdelili záujmovú oblasť v rámci zarovnaného zväzku obrázkov v odtieňoch šedej na podmnožiny pixelov patriacich jednotlivým neurónom. Vzhľadom na to, že rozlíšenie údajov z transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM) je anizotropné, vyvinuli sme dvojkrokový proces zahŕňajúci 2D segmentáciu na identifikáciu prierezov neurónov s následným prepojením týchto segmentov v 3D. Na všetky údaje sa nepoužil žiaden algoritmus, pretože sa s pokusmi o korektúru vyskúšalo veľa rôznych techník segmentácie a bolo protiproduktívne opraviť už segmentované časti. Typický krok 2D segmentácie zahŕňal vytvorenie máp hraničných pravdepodobností s použitím morfologických znakov 50, 51, 52, po ktorých nasledovalo zosilnené učenie hrany 53, detekcia mitochondrií na zníženie falošných hraníc 54, nasledovaná segmentáciou povodia 55 a aglomeračným zoskupením 56 s použitím stredných a stredných hraničných hodnôt na vytvorenie stredných a stredných hraničných hodnôt 2D segmenty. Krok 3D spojenia zostavil spojovací graf po sebe idúcich 2D segmentov v susedných sekciách. Opäť sa použilo niekoľko techník, vrátane jednoduchých metrík, ako je prekrývanie a prístupy strojového učenia, ktoré vypočítali príslušné váhy funkcií z predtým korigovaných údajov. Ďalšie podrobnosti o niektorých našich prístupoch k automatickej segmentácii nájdete v predchádzajúcich publikáciách 19, 57 . Vzhľadom na to, že všetky algoritmy segmentácie robia chyby v dôsledku zobrazovacích artefaktov a nízkej z- evolúcie, a pretože manuálna korekcia nadmerných segmentácií je jednoduchšia ako pri nedostatočných segmentáciách, vyladili sme naše automatické algoritmy tak, aby sme vytvorili objem segmentov nadmerne segmentovaných. Ďalej sme zachovali oblasti povodia nazývané super-pixely, aby sme uľahčili manuálnu korekciu nadmernej segmentácie v ďalšom kroku. Vydali sme najnovšiu (a veríme najlepšiu) verziu segmentačného kódu, ktorý sme použili (//bitbucket.org/shivnaga/sstem), ale upozorňujeme čitateľa, že aj naša najlepšia automatická segmentácia vyžaduje rozsiahle manuálne korektúry, korekcie a anotácie. (pozri nižšie), čím získate výsledky, ktoré uvádzame v tomto dokumente.

Korektúry a rekonštrukcie

Ďalej sme skontrolovali výsledky automatickej segmentácie, opravili sme zostávajúce chyby a priradili sme synapsie k korytám buniek. Pretože to bolo časovo náročné, vyškolili sme skupinu profesionálnych editorov, označovaných ako korektori, na ktorých prácu dohliadali traja skúsení elektrónoví mikroskopovia (Sh.T., Sa.T. a PKR) (odborníci). Korektori a experti vykonávali svoje úlohy pomocou špecializovaného softvérového nástroja na mieru Raveler (DJO et al. , Pripravuje sa rukopis). Celkovo tieto korektívne kroky trvali 12 940 osôb za hodinu (z toho 900 odborníkov za hodinu prispeli naši odborníci). V rámci postupu rekonštrukcie sa uskutočnilo päť kľúčových krokov: (1) korektúra objemu, (2) anotácia synapsie, (3) postsynaptické sledovanie, (4) vylepšenie tela kotvy a (5) selektívne riedke sledovanie, podrobne opísané v doplnkových metódach.

Spoľahlivosť schémy zapojenia

Ako sme uviedli vyššie, ku každej synapsii sme priradili dva korektory, aby sme zvýšili spoľahlivosť korektúry. Charakterizujúc to, v 48, 2% prípadov nemohli obaja korektori identifikovať rodičovskú bunku buď preto, že nemohli s istotou vystopovať tento proces, alebo preto, že opustili záujmovú oblasť. V 44, 0% prípadov obaja korektori vystopovali PSD k rovnakému kotevnému telu a v 7, 5% prípadov jeden korektor nemohol dokončiť sledovanie, zatiaľ čo druhý sledoval PSD k kotviacemu telu (čísla extrahované z doplnkovej tabuľky 1). Avšak len vo veľmi malom počte prípadov (0, 23%) sa obaja korektori dostali k rôznym telesám kotiev. Tieto čísla naznačujú, že po procese dohody o dvoch korektoroch bude zmeškaná veľká časť spojení; všetky identifikované spojenia však majú veľmi vysokú pravdepodobnosť správnosti.

Aby sme mohli ďalej posúdiť našu kvalitu rekonštrukcie, vygenerovali sme dva výsledky z výsledkov duálneho korektora - komplexnú verziu, ktorá obsahovala spojenia nájdené jedným z korektorov, a konsenzuálnu verziu, v ktorej boli spojenia akceptované iba vtedy, keď sa obaja korektori dohodli. Porovnanie týchto dvoch konektómov bolo vo všeobecnosti upokojujúce. Hoci inkluzívny konektor má o 16% viac spojení, všetky ďalšie pripojenia mali iba jeden synaptický kontakt. Všetky spojenia s dvoma alebo viacerými synapsiami sú prítomné v oboch konektoroch (doplnková tabuľka 1). Pri všetkých našich analýzach sme použili konsenzusový konektóm. Závery však zostávajú nezmenené pri použití inkluzívneho konektora.

Vo všeobecnosti bola vysoká miera zmeškaných synaptických kontaktov v našom korektúre pre náš projekt tolerovateľná, pretože naším zámerom bolo študovať spojenia s niekoľkými paralelnými synaptickými kontaktmi. Mohli by sme potvrdiť, že konektóm obsahuje veľkú časť takýchto silných spojení vynesením distribúcie počtu kontaktov medzi spojenými pármi buniek.

Našli sme silne ťažké chvostové rozdelenie celkového počtu kontaktov pre každý spojený pár tak v celom konektóme (vložka na obr. 3b), ako aj v podskupine riedko vysledovaných typov buniek zapojených do detekcie pohybu (doplnkový obr. 3). Vzhľadom na to, že veľkosť T-tyčiniek v drôte je pomerne jednotná (A. McGregor a kol. , Nepublikované pozorovania), a veľkosť synaptických štruktúr je považovaná za koreláciu s ich fyziologickou silou 58, videli sme počet paralelných synaptických kontaktov medzi dva neuróny ako proxy synaptickej hmotnosti. Ďalej, pri predpoklade, že pravdepodobnosť chýbania synaptického kontaktu počas korektúry je na všetkých postsynaptických miestach jednotná, môžeme odhadnúť, že konsenzuálny konektóm obsahuje všetky spojenia s> 5 synapsiami s úrovňou spoľahlivosti> 95% (doplnkové metódy). Preto sme presvedčení, že náš konsenzusový konektóm je presný a komplexný pre silné spojenia.

Konštrukcia modulu pre pripojenie

Pri konštrukcii opakujúceho sa modulu v medulárnom konjomeome boli identifikované všetky členy každej triedy neurónov v referenčnom stĺpci a počet synapsií z týchto neurónov do všetkých ostatných neurónov postsynaptickej triedy bol spriemerovaný cez presynaptické bunky. Pre typy ultraperiodických buniek, napríklad Tm3, by to mohlo mať za následok zlomkovú hmotnosť. Ďalej, pretože je v priemere 1, 5 Tm3 buniek na stĺpec, vypočítali sme synaptickú hmotnosť vynásobením 1, 5. Tieto zlomkové hmotnosti poskytujú priemernú pevnosť spojenia v rôznych stĺpcoch, pretože niektoré stĺpce majú iba jeden Tm3, zatiaľ čo iné majú dva.

Smerová sumácia, ktorá sa tu použila, bola vybraná, pretože sme sa pri našej rekonštrukcii pokúsili korigovať každý postsynaptický prvok k pridruženému neurónu. Nepokúsili sme sa však korigovať každé presynaptické miesto späť do svojho rodičovského neurónu (pretože niektoré také prvky môžu pochádzať z ne referenčných stĺpcov, ktoré neboli husto rekonštruované).

Táto metóda bola modifikovaná pre štyri spojenia v obvode detekcie pohybu: L1 až Mi1, L1 až Tm3, Mi1 až T4 a Tm3 až T4. V týchto prípadoch bol počet synaptických kontaktov z husto zrekonštruovaného medulárneho kondomu nahradený počtom synaptických kontaktov identifikovaných počas riedkeho sledovania týchto špecifických spojení (doplnková tabuľka 3).

Výpočet komponentov poľa Mi1 a Tm3

Vypočítali sme zložky Mi1 a Tm3 v receptívnom poli pre každý T4 vynásobením počtu synaptických kontaktov z každého neurónu L1 na jeden medziprodukt Mi1 alebo neurón Tm3 počtom kontaktov z tejto medziľahlej bunky do T4 a potom sčítaním. cez všetky neuróny Mi1 a Tm3, ktoré prijímajú vstup od rovnakého L1 (obr. 4e). Táto multiplikácia je ekvivalentná k počítaniu počtu nezávislých synaptických trás z každého L1 do každého T4, v ktorých musí každá trasa používať odlišný pár synaptických kontaktov medzi L1 a medziľahlými cieľovými bunkami a medziľahlými cieľmi a T4.

Odhad chyby Monte Carlo

Výsledkom našej korektívnej metodológie je veľmi málo falošných pozitívnych chýb, ale mnoho falošných negatívnych chýb medzi pármi neurónov (pozri vyššie). Preto je vysoko pravdepodobné, že pozorovaný počet synaptických kontaktov ( m ) je podskupinou vyššieho, skutočného počtu synaptických kontaktov medzi dvoma neurónmi ( n ). Za predpokladu, že pre každý spojený pár neurónov mal každý synaptický kontakt rovnakú falošnú negatívnu pravdepodobnosť a pomocou tejto pravdepodobnosti v binomickom rozdelení, naším cieľom bolo odhadnúť zadnú pravdepodobnosť, P ( n | m ) (to znamená pravdepodobnosť skutočné n dané pozorované m ) pre rôzne hodnoty n . Aby sme to dosiahli, pretože predchádzajúce rozdelenie na n nie je známe, aproximovali sme túto pravdepodobnosť zadnú časť pravdepodobnosťou, P ( m | n ) (to znamená pravdepodobnosť pozorovania m vzhľadom na nejakú hodnotu skutočného n ) pre rôzne hodnoty n , Vygenerovali sme 1 000 rôznych odhadov skutočnej hmotnosti spojenia pre každý pripojený neurónový pár vzorkovaním zo súboru možných n hodnôt s vypočítanou pravdepodobnosťou pri každej hodnote n . Neurónové páry, ktoré boli odpojené kvôli vysokej miere falošne negatívnych chýb, sa tiež mohli spojiť, ak sa ich neuritové profily prekrývali v 3D. Počet kontaktov sa odhadol pomocou rovnakej metódy vzorkovania ako predtým (ale s m rovným nule). Týmto spôsobom sme vygenerovali 1 000 rôznych matíc pripojenia. Posun bol potom vypočítaný pre každú maticu. Vypočítali sa vlastné hodnoty a vlastné vektory kovariančnej matice vo všetkých vektoroch vytesnenia a použili sa na vykreslenie elipsy pozdĺž osi vlastného vektora s 2 a intervalmi spoľahlivosti (obr. 5a). Aby sa táto konštrukcia rozšírila na stredný posun v skupine neurónov, vypočítalo sa 1000 variácií priemeru tak, že sa najprv odobrali vzorky z posunov generovaných pre každý neurón a potom sa vypočítala stredná hodnota pre každú sadu vzoriek. Elipsy sa potom vypočítali rovnakým spôsobom ako predtým, z tejto sady 1 000 stredných hodnôt (obr. 5b, hore).

Účinok obmedzenej veľkosti rekonštrukcie

Pretože šírenie dendritických tŕňov buniek Tm3 pripojených k danému T4 je väčšie ako šírenie buniek Mi1, je pravdepodobnejšie, že bunky Tm3 budú čiastočne rekonštruované, a preto chýbajú vstupy L1 blízko okrajov rekonštrukcie 19 stĺpcov., Aby sa poskytla miera účinku tohto obmedzenia na každý T4, najskôr sme vizuálne skontrolovali každý neurón Tm3 a klasifikovali ho do jednej zo štyroch tried v závislosti od percentuálneho podielu tŕňa, ktorý pri rekonštrukcii stĺpca 19 chýba. Bunky Tm3, ktoré boli rekonštruované, dostali úplne vstup od priemerne šiestich neurónov L1. Naopak, bunky Tm3 vo štvrtej triede, ktoré mali väčšinu svojho tŕňa mimo nášho záujmového regiónu, dostali vstup od priemeru iba dvoch neurónov L1. Sčítaním zlomku chýbajúcich vstupov L1, váženého pomerom vstupov poskytnutých každou triedou Tm3 k danému T4, sme získali odhad váženého podielu chýbajúcich vstupov L1 (cez kanál Tm3) pre každý T4 ( x os na obr. 5b, spodná časť). Túto metriku sme tiež použili na zdôvodnenie odstránenia chýbajúcich buniek T4> 15% ich vážených vstupov L1 (cez kanál Tm3), pri konštrukcii priemerných odoziev pre bunky T4 s rovnakými preferenciami smeru výstupu (obrázok 5b, hore).

Orientácia dendritu

Po korektúre boli arborizácie T4 v M10 skeletizované, počínajúc od stredu najhrubšej vetvy, a prispôsobili metódu ref. 59 so zmenenou váhovou funkciou. Bod axonálnej vetvy bol určený pomocou Sh.T. tak, aby sa dendritická časť artrizácie medully presne identifikovala. Vypočítala sa lokálna orientácia okolo každého dendritického uzla (s použitím troch uzlov v oboch smeroch okolo každého uzla a ignorovanie všetkých uzlov s menej ako tromi susednými uzlami v oboch smeroch). Dominantná orientácia dendritickej vetvy pre každý T4 (obr. 6b) sa vypočítala rýchlou Fourierovou transformáciou (MATLAB a Statistics Toolbox, verzia R2012b) distribúcie orientácií cez uzly a definovala sa ako fáza základného režimu. súčasť transformácie. Za predpokladu normálnej distribúcie pre dominantnú orientáciu buniek priradených k vrstve (prostredníctvom ich hĺbky axonového tŕňa), sme vypočítali pravdepodobnosť každého nevysledovaného T4 ležiaceho v každom zoskupení buniek vzhľadom na jeho nameranú dominantnú orientáciu. Priradenie bunky T4-4 k vrstve 1 bolo významné ( P <0, 05), ale priradenie ďalších dvoch buniek nebolo. Farebná mapa pre dendritické tŕne (obrázok 6a a doplnkový obrázok 5) bola vybraná centrovaním farieb na priemere orientácie dendritických vetiev pre každý zoskupenie (obrázok 6b) a kontinuálnou zmenou farby medzi zoskupeniami.

Prístup k údajom

Pri zverejnení budú kostry všetkých buniek nahraté na //neuromorpho.org. Budeme hostiť webovú stránku (//openwiki.janelia.org/wiki/display/flyem/Medulla+TEM+Reconstruction), ktorá umožní divákovi vyhľadávať v konsenzuálnom konjome spojené neurónové páry. Poskytneme tiež celú segmentáciu s anotáciami synapse a spolu s Ravelerom otvoríme na požiadanie súbor údajov. Žiadajúca strana bude musieť dodať pevný disk.

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplnková informácia

    Tento súbor obsahuje doplnkové obrázky 1-6, doplnkové metódy, doplnkové tabuľky 1-3, úplnú legendu, ktorá je priložená k súboru doplnkových údajov, úplnú video legendu a doplnkové referencie.

  2. 2.

    Doplnkový obrázok

    Tento súbor obsahuje plnú verziu doplnkového obrázka 1 (úplnú legendu nájdete v súbore doplnkových informácií s. 1).

Excel súbory

  1. 1.

    Doplnková tabuľka 1

    Tento súbor obsahuje úplnú verziu doplnkovej tabuľky 1 (legenda pozri v súbore doplnkových informácií na str. 16).

Súbory ZIP

  1. 1.

    Doplňujúce údaje

    Tento súbor so zipsom obsahuje doplnkové údaje 1 - legenda nájdete v súbore doplnkových informácií na strane 23).

videá

  1. 1.

    Rekonštrukcie neurónov

    Toto video ukazuje EM obrazový zväzok požadovanej oblasti drene (obr. 1c). Obrazy zo stohu sa postupne odstraňujú (smerujú do hlbších vrstiev) a postupne sa pridávajú rekonštrukcie 379 neurónov v náhodne zvolených farbách. Neuróny sú zoskupené do šiestich tried, pričom text opisujúci triedu sa pridáva súčasne s neurónmi z každej triedy: (1) Fotoreceptorové terminály, z sietnice a neuróny z laminy, ktoré inervujú referenčný stĺpec v medulle. (2) Neuróny, ktoré dostávajú priamy vstup z neurónov sietnice a laminy. (3) Neuróny, ktoré dostávajú priamy vstup od neurónov v triede (2). (4) Neuróny, ktoré sú zborované v referenčnom stĺpci, ale sú rozložené na viacerých stĺpcoch. (5) Tangenciálne neuróny, z ktorých sa často rekonštruoval iba fragment prechádzajúci záujmovou oblasťou. (6) Dodatočné neuróny, často rovnakej triedy ako neuróny v triedach (1) - (5), ale zo susedných stĺpcov.

Komentáre

Odoslaním komentára súhlasíte s tým, že budete dodržiavať naše zmluvné podmienky a pokyny pre komunitu. Ak zistíte, že je niečo urážlivé alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte ho ako nevhodné.