Ultrasenzitívna kvantifikácia igg s použitím nanopyramidov | npg materiály pre Áziu

Ultrasenzitívna kvantifikácia igg s použitím nanopyramidov | npg materiály pre Áziu

Anonim

predmety

  • biomateriály
  • DNA nanoštruktúry
  • Senzory a biosenzory

abstraktné

Okrem toho, že je úložiskom genetických informácií, DNA je biopolymér, ktorý sa môže formovať do rôznych nanoštruktúr. Táto hlboká schopnosť navrhnúť rôzne skupiny rozšírila svoju úlohu od ukladania údajov po štrukturálne biomateriály pre snímacie aplikácie. V tejto štúdii sme ukotvili DNA-nanopyramidy (DP) k zlatým elektródam pre elektrochemické snímanie imunoglobulínu G (IgG), dôležitej protilátky produkovanej v reakcii na infekciu. Štruktúra pyramídovej DNA nielen zamedzuje zapleteniu so susednými sondami prostredníctvom použitia priestorovo oddelených závesných sond, ale tiež redukuje miestny efekt preplnenia s celkovým zlepšeným balením cieľov. Výsledky meraní elektrochemickou impedančnou spektroskopiou tiež ukazujú, že vrstva DP má lepšiu vodivosť, pričom dutá štruktúra ďalej uľahčuje prenos elektrónov a zvyšuje citlivosť elektrochemickej detekcie. Sme schopní selektívne detegovať IgG v prítomnosti iných proteínov v analytickom roztoku. Limit detekcie bol 2, 8 pg ml −1 . Náš ferocén-značený sendvičový imunotest funguje pri 37 ° C v prostredí s neutrálnym pH. Vytvára tiež stabilné a reprodukovateľné signály aj po skladovaní počas 1 týždňa pri 4 ° C, čo ďalej demonštruje potenciál tohto snímacieho systému pre klinické aplikácie.

úvod

Diagnostické testy sú neoddeliteľnou súčasťou každého lekárskeho vyšetrenia. Súčasné množstvo dostupných diagnostických testov môže klinickým lekárom pomôcť určiť alebo vylúčiť konkrétne ochorenie (najmä na začiatku liečby), štádium daného ochorenia a dokonca posúdiť vhodnosť rôznych terapií. Niektoré choroby centrálneho nervového systému, ako sú bakteriálne a vírusové infekcie mozgu a zápalová roztrúsená skleróza, si vyžadujú ultracitlivé merania imunoglobulínu G (IgG) v krvi a mozgovomiechovom moku. 1, 2 IgG sú produkované diferencovanými B bunkami. Tieto protilátky regulujú infekcie tým, že sa špecificky viažu na antigény na cudzích mikróboch alebo parazitoch a inaktivujú ich. V prípade skoršej infekcie poskytuje citlivá detekcia prírastkových množstiev IgG veľkú klinickú výhodu tým, že umožňuje možnosť podávať antibiotiká na začiatku procesu infekcie. Často je však ťažké dosiahnuť rýchly a spoľahlivý test na IgG, pretože sa v počiatočných štádiách infekcie často vyskytujú na ultranízkych hladinách. Veľa úsilia sa venovalo maximalizácii signálu a realizácii ultrasenzitívnej diagnózy pomocou rôznych stratégií amplifikácie signálu pomocou enzýmov, nanočastíc a polymerizácie. 3, 4, 5, 6, 7 Bola opísaná nedávna stratégia ultrasenzitívnej detekcie proteínov IgG použitím metódy dvojitého signálu amplifikácie pozostávajúcej z polymérov a kvantových bodov označených tyramidom a priniesla takmer 10-násobné zvýšenie v porovnaní s neplifikovanými metódami. a mohli by dosiahnuť limity detekcie na úrovni pikogramov. 8

Je známe, že DNA uchováva genetické informácie dôležité pre život. Na DNA sa však dá pozerať aj ako na biopolymér alebo biomateriál, pretože má určitú predvídateľnosť propagácie reťazca a materialistické vlastnosti. 9 V spojení s klasickými pravidlami párovania báz Watsons-Crick je možné navrhnúť a vyladiť zaujímavé a užitočné nanoštruktúry. 10, 11, 12, 13, 14, 15 Niekoľko príkladov aplikácií zahŕňa biotempláty na nanofabrikáciu rôznych materiálov, 12, 16 nanomachinov na reverzibilnú konverziu štruktúr, 17, 18 platforiem na biosenzorovanie, 19, 20 nanoklietok na dodávanie liečiv 21, 22 a nástroje na zobrazovanie in vivo a bunkovú biológiu. 23, 24 V posledných rokoch bola vyvinutá najmä elegantná trojrozmerná (3D) architektúra na vybudovanie dobre definovanej tetrahedrálnej štruktúry DNA so vzperami zloženými výlučne z dvojvláknovej DNA. 14 Zistilo sa tiež, že rovnaká štruktúra DNA sa dá modifikovať laditeľnou stechiometriou. 15 Tetraedrická štruktúra DNA sa dá považovať za jednu z najpraktickejších nanostruktur DNA a bola svedkom rýchleho rozvoja tetraedru DNA na biosenzorizáciu. 25, 26, 27, 28, 29, 30

Jednou z hlavných výziev v biosenzoroch, ktorá výrazne znižuje citlivosť zariadenia, je obmedzený prístup cieľových molekúl k imobilizovaným väzbovým skupinám na aktívnom povrchu senzora. Kvôli nevyhnutnému krížovému maskovaniu väzbových skupín bolo ťažké udržať stabilný, neobmedzený prístup k cieľovým molekulám (obrázok 1). Skôr sme popísali DNA nano-pyramídu (DP), ktorá sa používa ako kotviace lešenie pre elektrochemický senzorový systém, ktorý bol schopný detegovať až 1 pM DNA cieľa. 25 Tieto povrchy zdobené DNA nanoštruktúrou sú vhodné pre biologické testy z niekoľkých dôvodov. DP sa môže syntetizovať rýchlym a nákladovo efektívnym spôsobom pomocou vlastného zostavenia oligonukleotidov pri rôznych teplotách a je kompatibilný s existujúcimi biologickými testami. Nanoštruktúra tiež stabilizuje zameriavacie skupiny a umožňuje priestorové oddelenie jednej zameriavacej skupiny od jej susedov vo vzdialenosti najmenej 4 nm, čo maximalizuje prístup k molekulám antigénu zameriavacou časťou a obchádza potrebu povrchovej pasivácie. 26 Kovalentné väzby medzi Au elektródou a tiolovanými vrcholmi DNA umožňujú silnú kotvu, ktorá odolá prísnemu premývaniu, čo ďalej znižuje signály pozadia. Tuhosť dvojzávitnicovej štruktúry obsahujúcej vzpery DP tiež znižuje bočné ohýbanie celkovej štruktúry, čo ďalej zvyšuje stabilitu.

Image

Schematické znázornenie ľahkosti použitia Ab1 na imobilizáciu na povrchu elektródy pri použití DP oproti ukotveniu molekuly MUA s dlhým reťazcom. Táto ľahká prístupnosť vedie k celkovému zlepšeniu tvorby sendvičového komplexu na detekciu antigénu IgG (nie je na tomto diagrame znázornené).

Obrázok v plnej veľkosti

V tejto štúdii používame DP na detekciu proteínových molekúl konvenčnou sendvičovou imunoreakciou. Anti-lgG sa kovalentne kopuloval s voľne stojacou karboxylovou skupinou v hornom vrchole pyramídy a na generovanie elektrochemických signálov sa použila kyselina ferocénkarboxylová. Redoxne aktívne druhy na báze ferocénu a detekcia získali väčšiu pozornosť pri elektrochemickej biosenzii kvôli svojim jedinečným katalytickým vlastnostiam, pozoruhodným elektrochemickým reakciám a kontrolovateľnej a ľahkej príprave. 31, 32, 33 Použitím tohto systému sme detegovali až 2, 8 pg ml -1 IgG a demonštrovali sme selektívny a stabilný snímací systém po týždni skladovania. Naša štúdia zameraná na preukázanie koncepcie ukazuje, že táto metóda sa môže vyvinúť na biokompatibilnú, citlivú a selektívnu analytickú metódu založenú na DP pre klinickú diagnostiku.

Výsledky a diskusia

Charakteristiky konjugátu FeC-anti-IgG (FeC-Ab2)

Schéma syntézy FeC-Ab2 je znázornená na obrázku 2a. Obidva kondenzačné činidlá, EDC a NHS, sa použili na katalyzovanie tvorby amidovej väzby medzi amínovou skupinou anti-lgG s karboxylovou skupinou FeC-COOH. UV-vis absorpčné spektrá rôznych zložiek pred a po vytvorení FeC-anti-IgG sú znázornené na obrázku 2a. Čistý FeC-COOH vykazoval dva absorpčné píky pri 310 a 450 nm (krivka 1, obrázok 2a), zatiaľ čo charakteristický pík pri 250 nm sa pozoroval v dôsledku anti-IgG protilátky (krivka 2, obrázok 2a). Po vytvorení amidovej väzby však UV-vis spektrá vykazovali iba jeden absorpčný pík pri 265 nm (krivka 3, obrázok 2a), čo možno pripísať zrúteniu FeC-COOH (310 nm) a anti-IgG (250) nm) píky do jedného piku. To naznačuje, že molekula FeC bola úspešne imobilizovaná na anti-lgG (Ab2).

Image

Tvorba a charakterizácia RP a pridružených elektrochemických zostáv. a ) UV-vis absorpčné spektrá (1) kyseliny ferocénkarboxylovej, (2) anti-IgG a (3) FeC-anti-IgG. b ) gélová elektroforetická analýza tvorby DNA štvorstena. Dráha 1 predstavuje tetrahedrón zakončený COOH. Kontrolný experiment pre jednovláknovú (ss-) DNA (dráhy 12, 13, 14, 15) a ďalšie kombinácie, ktorým chýba jeden reťazec (dráhy 2, 3, 4, 5) alebo dva reťazce (dráhy 6, 7, 8, 9 10, 11). c ) Typické Nyquistove grafy tej istej zlatej elektródy v PBS-10 (pH 7, 4), ktoré obsahujú 5 mM [Fe (CN) 6 ] 3– / [Fe (CN) 6 ] 4– a 0, 1 M KCl v rôznych fázach: (1) holá elektróda Au, (2) DP zostavila Au-DP elektródu, (3) elektróda Au-DP aktivovaná EDC / NHS, (4) elektróda Au-DP-Ab1 imobilizovaná anti-IgG, (5) elektródou Au-DP-Abl-Atg imobilizovanou IgG a (6) Au-DP-Abl-Atg- (FeC-Ab2) anti-IgG imobilizovanou ferrocénom. Vsadenie: zväčšené v Nyquistovom diagrame holej Au elektródy. d ) Schematické znázornenie sendvičového imunotestu pomocou Au-elektródy modifikovanej DP.

Obrázok v plnej veľkosti

Naviazanie FeC na anti-lgG (Ab2) bolo tiež dokázané rôntgenovým fotoelektrónovým spektrom (doplnkový obrázok S1). Fe spektrum FeC vykazovalo vrcholový signál Fe 2p pri väzbovej energii 704, 8 eV (doplnkový obrázok SI, krivka a). Slabší pík Ns sa objavil pri 397, 4 eV kvôli možnej skupine NH z rozpúšťadla HEPES. Ako sa očakávalo, XPS spektrum anti-lgG vykazovalo zrejmý vrchol Ns pri 396, 8 eV a žiadny rozpoznateľný vrchol Fe 2p. Po ďalšej kopulácii s FeC však spektrá XPS konjugátu FeC-Ab2 vykazovali dva významné píky N1 a jeden širší pík Fe 2p pri rovnakej väzbovej energii ako anti-IgG a FeC. Vznik nového píku N môže byť spôsobený zvyškovým NHS. Prítomnosť oboch týchto prvkov potvrdila, že malé molekuly FeC boli úspešne konjugované s protilátkou. Následne by sa tento konjugát použil ako ultracitlivá signálna značka pre elektrochemickú detekciu.

Charakteristika RP

DP možno považovať za jednu z najjednoduchších 3D DNA štruktúr. 25, 26 DP sa skonštruovalo aneláciou štyroch reťazcov DNA oligonukleotidov. Výsledný produkt sa analyzoval pomocou 12, 5% polyakryamidovej gélovej elektroforézy (obrázok 2b). Ako je znázornené na obrázku 2d, sekvencie rovnakej farby boli hybridizované za vzniku šiestich okrajov alebo vzpier pyramídy. DP (obrázok 2b, dráha 1) migrovali pomalšie ako rôzne jednotlivé jednovláknové pásy DNA (obrázok 2b, dráhy 12–15) a ďalšie rôzne kombinácie (ktorým chýbala jedna alebo dve jednotlivé skupiny vlákien - obrázok 2b, dráhy 2– 11). Naše výsledky sa porovnali s relatívnou veľkosťou rôznych druhov. Zvýšená hmotnosť a zložitosť priestorovej štruktúry DP bránili pohybom cez póry polyakrylamidového gélu, zatiaľ čo iné štruktúry s kompaktnejšími alebo lineárnymi štruktúrami mohli ľahšie prechádzať. To potvrdilo úspešné zostavenie komplexnej nanostruktúry DNA. 15, 25

Príprava imunosenzora na báze DP

Ako je znázornené na obrázku 2d, tri oligonukleotidové vlákna boli ukončené strategicky umiestnenými tiolovými skupinami v troch zo štyroch vrcholov DP. Tiolová skupina potom kovalentne naviazala DP na Au elektródu presne na týchto bázach. Pred imobilizáciou sa do hybridizačného roztoku pridal TCEP na aktiváciu tiolovanej DNA a zníženie akýchkoľvek disulfidových väzieb. Prítomnosť TCEP neinterferovala so zostavením, takže získaný produkt sa mohol použiť na následné experimenty bez akéhokoľvek čistenia. Aj keď sa očakáva, že žiadna reakcia nemôže byť dokonale stechiometrická, akýkoľvek prebytok nerozložených prameňov by neovplyvňoval spojenie zostaveného DP. 35 Zvyšný netiolovaný vrchol na vrchole DP umožnil chemickú väzbu s rôznymi závesnými sondami na uskutočnenie biodetekcie (obrázok 2d). V tejto štúdii sme použili karboxylovú skupinu ako voľne stojaciu skupinu na vrchu a netiolovaný vrchol bol kovalentne spojený s anti-IgG (Ab1). Vďaka imunobiazaniu Ab2 na Atg táto konvenčná sendvičová imunoreakcia umožnila mobilizáciu elektroaktívnych príveskov (tj FeC) cez Ab2 v blízkosti povrchu elektródy, aby sa generovali významné elektrochemické signály.

Na preukázanie každého konkrétneho kroku v procese montáže senzora sme použili elektrochemickú impedančnú spektroskopiu. Ako sa očakávalo, vysokofrekvenčná oblasť impedančného grafu vykazuje polkruhový obrazec. Znázornené signály redoxnej sondy [Fe (CN) 6 ] 3 - / 4 - s priemerom v polkruhu predstavovali odpor prenosu elektrónov ( R a ). Randlesov ekvivalentný obvod (vložený do doplnkového obrázka S2) bol vybraný tak, aby odrážal skutočný elektrochemický proces a určoval hodnoty montážnej impedancie, ktoré opisujú náš špecifický systém. Tento odpor riadil kinetiku elektrónového prenosu redoxnej sondy na elektródovom rozhraní. Preto sa hodnota R et ( R2 vo vložke doplnkového obrázku S2) mení, keď sú na elektródu imobilizované rôzne látky.

Nyquistove grafy sú znázornené na obrázku 2c. Holá Au elektróda podľa očakávania odhalila veľmi malú polkruhovú doménu ( R et = 56, 4 Ω, krivka 1), čo naznačuje relatívne nízky odpor voči redoxnej sonde. Po úprave elektródy pomocou DPs sa odpor značne zvýšil ( R et = 470, 2 Ω, krivka 2) v porovnaní s holou Au elektródou kvôli relatívne nízkej zlej vodivosti DP. Toto je ďalej potvrdené, keď bol vrcholový vrchol DP aktivovaný roztokom EDC / NHS, čo spôsobilo zníženie rezistencie ( R et = 284, 1 Ω, krivka 3) v dôsledku neutralizácie záporného náboja DP počas aktivačného procesu. To umožnilo vodivým [Fe (CN) 6 ] 3 - / 4 - druhom priblížiť sa k aktivovanému povrchu Au-DP a urýchliť prenos elektrónov medzi redoxnými skupinami a elektródou. Následne bol aktivovaný Au-DP inkubovaný v roztoku Ab1 a rezistencia sa opäť zvýšila ( R a = 708, 4 Ω, krivka 4) kvôli izolácii proteínového obalu Ab1. Ďalšia kopulácia protilátky značenej antigénom a ferrocénom by vytvorila postupne silnejšiu izolačnú vrstvu a progresívne sa zvyšujúce hodnoty rezistencie (podrobné zobrazenie na doplnkovom obrázku S2). Tieto výsledky potvrdili, že výroba elektródy pomocou sendvičových imunoreakcií bola úspešne dosiahnutá. Je zaujímavé, že sme tiež poznamenali, že zmena v odpore spôsobená väzbou FeC-Ab2 (ΔR (6, 5) = 284, 5 Ω) bola menšia ako u Ab1 (ΔR (43) = 624, 3 Ω). Okrem mierne zníženého počtu väzobných miest na antigénom imobilizovanej elektróde (Au-DP-Ab1-Atg) v porovnaní s Au-DP- (EDC / NHS) elektródou je to pravdepodobne dôsledok použitia ferocénu ako mediátora elektrónov, čo by mohlo uprednostniť prenos [Fe (CN) 6 ] 3− / 4- druhov medzi roztokom a elektródou. Na potvrdenie tohto predpokladu sa priamo na povrchu elektród Au-DP-Ab1-Atg zachytil čistý anti-IgG bez FeC-COOH. Nyquistove diagramy týchto dvoch elektród ukazujú, že pomocou ferocénu sa odpor modifikovanej elektródy zreteľne znižuje (krivka a, doplnkový obrázok S3). Tento výsledok však tiež potvrdzuje úspešné kovalentné spojenie ferocénu s protilátkami.

Voltametrické charakteristiky imunosenzora založeného na DP

Kľúčové komponenty v biosenzore zahrnovali nanoštruktúru pyramidálnej DNA, ktorá ukotvila rozpoznávacie jednotky na povrchu elektródy a FeC-značenú protilátku na generovanie signálu. Elektrochemické vlastnosti FeC-Ab2 v roztoku elektrolytu na elektróde na báze DP sa skúmali pomocou voltametrických meraní. Obrázok 3a zobrazuje cyklické voltamogramy rôznych modifikovaných elektród v PBS-10. Keď bola reakcia sendvičového formátu ukončená, bolo možné na Au-DP-Abl-Atg- (FeC-Ab2) modifikovanej elektróde pozorovať pár stabilných a dobre definovaných redoxných píkov (krivka 5, obrázok 3a), čo naznačuje efektívnu elektrochemická aktivita biokonjugátových značiek FeC – anti-IgG. Štruktúra DP neinterferovala s elektrónovou komunikáciou medzi ferocénovými skupinami a podložnou elektródou. Na holej Au elektróde sa však nenašli žiadne vrcholy (krivka 1, obrázok 3a), Au-DP elektróda zostavená pomocou DP (krivka 2, obrázok 3a) alebo na Au-DP-Ab1elektróde viazanej na zachytenú protilátku (krivka 3, obrázok 3a)., Aby sa zabezpečil zdroj signálu, uskutočnil sa kontrolný experiment s použitím anti-IgG bez značenia FeC imobilizovaného na elektróde. Neprítomnosť akýchkoľvek rozpoznateľných cyklických voltametrických píkov z elektródy Au-DP-Abl-Atg-Ab2 (krivka 4, obrázok 3a) potvrdila, že predtým pozorované píky boli spôsobené prítomnosťou FeC, ako aj preukázala úspešnú a úplnú imunoanalýzu., Využitím jedinečnej štruktúry a elektronických vlastností ferocénu môže byť senzitívne detekovaný špecifický cieľový antigén. Cyklické voltamogramy z pripraveného imunosenzora sa okrem toho menili rôznymi rýchlosťami skenovania (doplnkový obrázok S4), čo zodpovedalo oxidácii ferocénu priviazaného protilátkou na ferricíniový katión. 36 Anodické aj katodické špičkové prúdy sa okrem toho lineárne zvýšili s druhou odmocninou rýchlosti skenovania v rozsahu od 50 do 500 mV s −1 (vložka doplnkového obrázka S4), čo potvrdilo difúzne kontrolovanú povahu redox v tomto procese. 36 Napriek predchádzajúcej práci, ktorá naznačuje, že jednotlivé FeC zostavené v hornom vrchole DP by priniesli slabé súčasné signály, špekulovali sme o mechanizme prenosu náboja v našom súčasnom systéme, že ferocénové skupiny na Ab1-Atg- (FeC-Ab2) Komplexy sú dostatočne flexibilné, aby fyzicky narážali na povrch elektródy a udržiavali dostatočne vysoký prúdový signál. 37

Image

Senzor na báze DP vykazoval vysokú špecificitu pre IgG a nízke signály pozadia aj v prítomnosti nešpecifických proteínov. a ) Cyklické voltamogramy rôznych povrchovo funkcionalizovaných Au elektród: (1) holá Au elektróda, (2) DP zostavila Au-DP elektródu, (3) Au-DP-Ab1 elektróda, (4) Au- elektróda Elektróda DP-Ab1-Atg-Ab2 a (5) ferocén-značená Au-DP-Ab1-Atg- (FeC-Ab2) elektróda pri skenovacej rýchlosti 100 mv s −1 s PBS-10 podporujúcim elektrolyt (pH) 7, 4). ( b ) SWV súčasná reakcia imunosenznačného systému založeného na nanoštruktúre DP po vystavení rôznym proteínom v PBS-1 (pH 7, 4). Koncentrácia každého proteínu je 1 ng ml -1 .

Obrázok v plnej veľkosti

SWV sa potom použil na charakterizáciu výkonu imunosenzora. Kontrolné experimenty sa uskutočňovali so senzorom na báze DP v rôznych proteínových roztokoch. Keď bola Au-DP-Abl elektróda inkubovaná v 1 ng ml -1 IgG antigénu počas 40 minút, nasledovaná inkubáciou v FeC-Ab2 suspenzii počas ďalších 40 minút, bol získaný pozoruhodný vrchol SWV odozvy 2, 48 μA (krivka a, doplnkový) Obrázok S5). Na rozdiel od toho, po inkubácii v analytovom roztoku bez proteínu, ale s následnou inkubáciou FeC-Ab2, nebola pozorovaná žiadna rozpoznateľná SWV odpoveď a bol zistený maximálny prúd iba 0, 034μA (prúd pozadia, obrázok 3b). Ultratenký signál môže byť spôsobený nešpecifickou, ale nevyhnutnou adsorpciou. Ďalej sa na testovanie selektivity imunosenzora pridali do testovacích systémov necieľový hovädzí sérový albumín a fibronektín v 1 ng ml- 1 . Výsledky ukázali extrémne nízke signály, podobné pozadiu (obrázok 3b). Súčasne, keď bol imunosenzor stimulovaný rôznymi kombináciami zmesí obsahujúcich dva alebo tri proteíny, boli variácie maximálneho prúdu vyplývajúce z prítomnosti interferujúcich proteínov <10%. To ukázalo vysokú špecifickosť nášho imunosenzora na báze DP voči nášmu cieľovému antigénu.

Aby sa ďalej zdôvodnili výhody použitia DP ako povrchovo stabilizovaných nanoštruktúr, testovala sa negatívna kontrola s použitím MUA priamo ukotvenej k Au elektróde prostredníctvom tej istej väzbovej chémie tio-Au. Podobne ako u senzora založeného na DP, karboxylová skupina na MUA poskytla reakčné miesta schopné kombinovať so zachytenou protilátkou (Ab1) a tiež s protilátkou značenou IgG a ferrocénom na povrch elektródy prostredníctvom podobných sendvičových imunoreakcií. Imobilizované značky FeC však generovali elektrochemickú SWV reakciu, ktorá bola oveľa nižšia ako odozva imunosenzora na báze DP (obrázok 4a). Zlý výkon senzora založeného na MUA bol s najväčšou pravdepodobnosťou výsledkom poruchy a nestabilnej samoskladanej monovrstvy MUA. Ďalej sme predpokladali, že táto samostatne zostavená monovrstva MUA tvorí na povrchu elektródy náhodný odporový film, ktorý bráni voľnému toku elektrónov na povrch (obrázok 4a). Boli uskutočnené ďalšie kontrolné experimenty, aby sa preskúmali rozdiely medzi týmito dvoma typmi štruktúr na povrchu elektród. Obrázok 4c zobrazuje impedancie Au elektród DP a MUA modifikovaných Au a bez prítomnosti imunotestu. Ako bolo pozorované, odpor elektródy zakotvenej elektródy MUA bol oveľa vyšší ako odpor elektródy zakotvenej DP. Je zaujímavé, že rovnaký výsledok sa získal dokonca aj po dokončení sendvičového testu. Tento výrazný rozdiel naznačoval, že Au-DP elektróda mala vynikajúce elektrochemické transdukčné schopnosti využitím dutej štruktúry spojenej s pyramidálnou DNA zostavou. Pretože táto otvorená štruktúra umožňuje zhlukovanie elektrónov medzi povrchom elektródy a roztokom, elektroaktívne skupiny by mohli ľahšie prenikať do zostavenej vrstvy. 26 Signál pozadia sa navyše významne zvýšil na približne 0, 19 μA v porovnaní s 0, 034 μA z imunosenzora založeného na DP. Prúd SWV bol 1, 24 μA pre 1 ng ml -1 IgG s pomerom signálu k šumu iba ∼ 6, 5, čo dokazuje väčšiu citlivosť pyramidálneho DNA senzora. Pripisovali sme to schopnosti DP odpudzovať proteíny a uľahčovať lepšiu orientáciu a prístupnosť pre väzbu protilátok, ako aj minimalizáciu nešpecifickej adsorpcie. Po imunoteste vykazovala elektróda navrstvená MUA tiež vyššiu impedanciu ako elektróda modifikovaná DP, ktorá ďalej podporovala vyššie uvedené hľadisko (obrázok 4c).

Image

Prítomnosť DP zvýšila elektrochemický signál a citlivosť na detekciu IgG. a ) Porovnanie DP-modifikovaných a tiolovaných MUA-modifikovaných elektród v imunoanalýze IgG. ( b ) reakčné prúdy SWV z imunosenzora založeného na DP pri rôznych pomeroch DP a f-DP a konštantnej celkovej koncentrácii nanoštruktúry DNA. ( c ) Typické Nyquistove grafy pre rôzne modifikované Au elektródy v PBS-10 (pH 7, 4) obsahujúce 5 m M [Fe (CN) 6 ] 3− / [Fe (CN) 6 ] 4 a 0, 1 M KCl: (1) Au-DP, (2) Au-MUA, (3) Au-DP-Abl-Atg- (FeC-Ab2) a (4) Au-MUA-Abl-Atg- (FeC-Ab2). ( d ) krivky prúdu SWV imunosenzačného systému založeného na nanostrukturách DP pri rôznych koncentráciách IgG 0, 01, 0, 02, 0, 03, 0, 04, 0, 05, 0, 1, 0, 5, 1, 5, 10, 100 a 1 000 ng ml -1 . ( e ) Spiknutie špičkového prúdu SWV oproti IgG v inkubačnom roztoku pomocou tohto imunosenzačného systému. Začiatok: lineárny vzťah medzi zmenou v súčasnej odpovedi a logom koncentrácie IgG.

Obrázok v plnej veľkosti

Predchádzajúce štúdie používali riedidlá, ako je 11-merkapto-l-undekanol alebo merkaptohexanol, aby sa znížilo zhlukovanie povrchu a zlepšila celková citlivosť elektrochemických senzorov. Ostatné stratégie však môžu na dosiahnutie rovnakého účinku využiť aj bezplatné RP. 28 Skúmali sme vplyv riedenia na tiolovaný DP bez funkčnej skupiny -COOH (f-DP) (doplnkový obrázok S6). Obrázok 4b ukazuje, že SWV reakcie z rôznych povrchových hustôt DP ladením pomeru DP / f-DP. Ako sa očakávalo, nebolo možné pozorovať žiadne významné súčasné zlepšenie z riedenia. Možným dôvodom je to, že rigidné a objemné DP vedie k nízkému zhlukovaniu povrchu a anti-lgG je priamo spojený s povrchom zakotveným COOH bez akejkoľvek predĺženej DNA ako mostíka na spojenie proteínov po hybridizácii. Najmä vyššie zrieďovacie pomery DP / f-DP viedli k nižším signálom, ktoré sú výsledkom rastúcej straty povrchovo ukotvených cieľov a testovacích sond. Preto sa platforma DP mohla priamo použiť na detekciu proteínov bez akýchkoľvek ďalších stratégií povrchovej mikro- / nanomodifikácie. Na základe týchto výhod sa potvrdilo, že imunosenzor na báze DP môže poskytnúť citlivý a špecifický prístup na spoľahlivé kvantitatívne zisťovanie cieľových proteínov.

Optimalizácia analytických podmienok imunosenzora

PH pracovného tlmivého roztoku ovplyvňuje elektrochemickú reakciu imunosenzora. Tvorba imunokomplexu na povrchu elektródy závisí tiež od inkubačnej doby a teploty. Preto je potrebné skúmať všetky tieto parametre, aby sa optimalizovali reakcie špecifické pre antigén. Aby sa našlo optimálne reakčné pH, bola pripravená séria roztokov elektrolytového pufra s pH v rozmedzí od 5, 0 do 10, 0 na vykonanie imunosenzorických testov (doplnkový obrázok S7A). Výsledky ukázali, že odozvy SWV sa zvýšili v rozsahu pH od 5, 0 do 7, 0, ale klesali, keď sa pH ďalej zvyšovalo. Zistilo sa, že extrémne podmienky pH poškodzujú imobilizované proteíny, najmä v alkalických podmienkach. Optimálne pH pre tento detekčný systém je 7, 4, čo je bežná hladina pH v oblasti imunológie.

Kineticky sa očakávalo, že antigény zachytené z roztoku vzorky závisia od inkubačného času pred dosiahnutím termodynamickej rovnováhy. Doplnkový obrázok S7B ilustruje variáciu SWV signálu testu s reakčným časom po dobu do 60 minút. Intenzita špičkového prúdu sa zvýšila s inkubačnou dobou až 40 minút pred dosiahnutím plató, čo naznačuje, že interakcie medzi IgG a jeho príbuznou anti-IgG protilátkou dosiahli saturáciu. Ako výsledok bol pre tento imunosenzor upravený inkubačný čas 40 minút.

Doplnkový obrázok S7C odhalil vplyv testovacej teploty na výkon biosenzora v rozmedzí 20 - 50 ° C. Variácia prúdu SWV vykázala postupné zvyšovanie až na 35 ° C až 37 ° C, ale pri vyšších teplotách sa však prudko znížila. Pretože maximálny analytický signál sa vyskytuje pri 37 ° C, všetky ďalšie imunologické testy sa uskutočňovali pri 37 ° C.

Detekcia IgG pomocou SWV

Imunosenzor na báze DP sa potom vystavil rôznym koncentráciám roztoku IgG. Zaznamenali sa zodpovedajúce elektrochemické prúdy. Obrázok 4d ukazuje SWV krivky imunosenzora po inkubácii so sériou koncentrácií IgG pokrývajúcich rozsah piatich rádov (od 10 pg ml -1 do 1 000 ng ml -1 ) za rovnakých optimálnych podmienok. Vrcholové prúdy sa monotónne zvyšovali s koncentráciou roztoku IgG, čo demonštruje schopnosť nášho imunosenzora kvantifikovať rôzne koncentrácie cieľového IgG. Je dôležité, že vzhľadom na nevyhnutnú nešpecifickú adsorpciu sa signál pozadia 0, 034 μA získal z negatívnej kontroly použitím roztoku PBS-1 bez prítomnosti IgG. To neovplyvnilo imunosenzor na ultrasenzitívnu detekciu IgG, pretože súčasná odpoveď generovaná detekciou najnižšej koncentrácie 10 pg ml -1 IgG bola vyššia ako v slepej vzorke PBS-1. Inými slovami, signál z 10 pg ml -1 IgG (0, 6 μA) sa dá ľahko rozlíšiť od hluku pozadia. Kalibračné grafy ukázali dobrý lineárny vzťah medzi špičkovými prúdmi SWV a logaritmom koncentrácií analytu v lineárnom rozsahu od 10 pg ml -1 do 10 ng ml -1 IgG. Lineárna krivka bola prispôsobená regresnej rovnici I p / μA=2, 516+0, 9564 log (c / ng ml −1 ) s koeficientom stanovenia R2 = 0, 996, kde Ip je oxidačný prúd ac je koncentrácia IgG v inkubačnom roztoku (vložka na obrázku 4e). Hranica detekcie 2, 8 pg ml- 1, založená na pomere signál-šum 3 z tejto práce, bola nižšia ako tá, ktorá bola predtým uvedená pri použití imunosenzorov na detekciu IgG. 7, 38, 39 Napriek tomu, že do nášho systému nie je zabudovaná chemická metóda zosilnenia signálu, dokázali sme dosiahnuť limit detekcie, ktorý je porovnateľný s ostatnými systémami, ktoré využívali stratégie amplifikácie signálu. 8, 39, 40

Reprodukovateľnosť a stabilita imunosenzora

Tento imunosenzor pre IgG je vysoko reprodukovateľný, ako bolo pozorované z vysokej presnosti medzi testami a medzi testami. Presnosť v rámci testu sa stanovila testovaním spoločnej koncentrácie IgG s piatimi nezávisle pripravenými meraniami replikácie imunosenzorov, zatiaľ čo presnosť v rámci stanovenia sa stanovila detekciou bežných koncentrácií IgG s použitím piatich imunosenzorov na tej istej elektróde. Relatívne s.ds. 9, 23% a 8, 55% sa získali pre intra-a inter-test, v uvedenom poradí, čo naznačuje dobrú presnosť a reprodukovateľnosť. Ďalej sme skúmali stabilitu pri skladovaní elektródy Au-DP-Ab1-Atg- (FeC-Ab2) po uložení modifikovanej elektródy v PBS-1 pri 4 ° C počas 1 týždňa. Žiadna významná variácia signálu SWV sa nepozorovala, keď sa pomocou uložených a čerstvo modifikovaných elektród detegoval 1 ng ml -1 roztoku IgG, čo naznačuje, že pripravené imunosenzory majú vysokú stabilitu pri skladovaní a sú sľubné pre praktické aplikácie.

závery

V tejto práci sme úspešne navrhli univerzálnu stratégiu pre vývoj vysoko citlivých imunoanalýz IgG pomocou nových sendvičových imunotestov 3D DP – FeC na Au elektródach. Vrcholy týchto DP sú chemicky modifikované tak, aby poskytovali flexibilné skupiny pre stabilné povrchové ukotvenie a ľahké spojenie závesným senzorom. Na generovanie vynikajúcich elektrochemických signálov sa použilo nastavenie protilátok označených ferrocénom. Najmä pyramidálna štruktúra poskytla povrchu substrátu menšie preplnenie a priamo zvýšila prístupnosť analytu. Zistilo sa tiež, že riedenie povrchovej hustoty ďalšími činidlami je zanedbateľné. Vyššia rigidita DP a jeho schopnosť odpudzovať proteíny produkovali jednotné a orientačné povrchové súbory, ako aj nižšie rušenie pozadia. Dutá štruktúra pyramídy navyše prispieva k ľahkému prenosu elektrónov medzi elektroaktívnymi druhmi a povrchom elektród, čo umožňuje tomuto imunotestu dosiahnuť ultrasenzitívnu detekciu proteínov. Vzhľadom na dobrú biokompatibilitu a flexibilnú chemickú modifikáciu DP táto štúdia konceptu dôkazu IgG detekuje, že táto stratégia ponúka citlivú a sľubnú metódu pre budúci výskum v oblasti klinickej diagnostiky a mohla by sa použiť na vývoj biosenzorov na posunutie hraníc detekcie iných biologických cieľov.

Doplnková informácia

Word dokumenty

  1. 1.

    Doplnková informácia

    Doplňujúce informácie sprevádzajú dokument na webovej stránke NPG Asia Materials (//www.nature.com/am)