Systematické opätovné vyrovnávanie syntaxových génov pre x-chromozóm pri poruche autistického spektra a schizofrénii | molekulárna psychiatria

Systematické opätovné vyrovnávanie syntaxových génov pre x-chromozóm pri poruche autistického spektra a schizofrénii | molekulárna psychiatria

Anonim

predmety

  • Zriedkavé varianty
  • schizofrénie
  • sekvenovania

abstraktné

Porucha autistického spektra (ASD) a schizofrénia (SCZ) sú dva spoločné neurodevelopmentálne syndrómy, ktoré sú výsledkom kombinovaných účinkov environmentálnych a genetických faktorov. Vydali sme sa na testovanie hypotézy, že zriedkavé varianty v mnohých rôznych génoch, vrátane de novo variantov, môžu predisponovať k týmto podmienkam v zlomku prípadov. Okrem toho, u obidvoch porúch sú muži výraznejšie alebo závažnejšie postihnutí ako ženy, čo možno čiastočne vysvetliť genetickými faktormi spojenými s X. Preto sme priamo sekvencovali 111 X-viazaných synaptických génov u jedincov s ASD ( n = 142; 122 mužov a 20 žien) alebo SCZ ( n = 143; 95 mužov a 48 žien). Identifikovali sme> 200 nesynonymných variantov s prebytkom zriedkavých škodlivých variantov, ktoré naznačujú prítomnosť mutácií spôsobujúcich ochorenie. Skrátené mutácie v génoch kódujúcich proteín IL1RAPL1 súvisiaci s vápnikom (už opísaný v Piton et al. Hum Mol Genet 2008) a enzým monoamín degradujúci monoaminooxidázu B sa našli v ASD, respektíve SCZ. Okrem toho bolo identifikovaných niekoľko sľubných nesynonymných zriedkavých variantov v génoch kódujúcich proteíny zapojené do regulácie vyrastania neuritov a ďalších rôznych synaptických funkcií ( MECP2 , TM4SF2 / TSPAN7 , PPP1R3F , PSMD10 , MCF2 , SLITRK2 , GPRASP2 a OPHN1 ).

úvod

Porucha autistického spektra (ASD) a schizofrénia (SCZ) sú dve bežné poruchy neurologického vývoja, ktoré sa zvyčajne objavujú počas detstva, dospievania alebo skorej dospelosti. Twin a epidemiologické štúdie silne podporujú funkciu genetických faktorov pri týchto chorobách. 1, 2, 3 V posledných desaťročiach sa uskutočnilo niekoľko väzobných a asociačných štúdií s obmedzeným úspechom. 3, 4, 5, 6, 7 Pozitívne väzbové signály sa získali v mnohých genómových oblastiach a niekoľko AS alebo SCZ bolo spojených s niekoľkými génmi alebo markermi; mnohé z týchto výsledkov sa však v nasledujúcich štúdiách nedokázali replikovať. Hypotéza implikujúca genetickú heterogenitu, v ktorej by zriedkavé vysoko prenikavé mutácie (z ktorých niektoré môžu byť de novo ) v rôznych génoch špecifických pre jednotlivé rodiny, boli náchylné na tieto poruchy, sú podporené nedávnymi zisteniami, že zriedkavé a de novo mutácie v NLGN4X , Synaptické gény NLGN3 a SHANK3 spôsobujú ASD v malom počte rodín. 8, 9, 10, 11, 12 Preto priame resekvovanie kompletných kódujúcich oblastí kandidátnych génov je najlepším prístupom na identifikáciu takýchto zriedkavých variantov.

Významná časť práce naznačuje, že ASD a SCZ sú synaptické poruchy. U neurónov týchto pacientov boli pozorované znížené dendritické chrbtice a takmer všetky gény spojené s týmito poruchami sa podieľajú na tvorbe, regulácii alebo normálnej funkcii synapsie. 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 Preto sme v rámci projektu Synapse-to-Disease (www.synapse2disease) skrínovali naše ASD a SCZ kohorty na varianty kandidátnych génov, ktoré kódujú proteíny zapojené do rôznych synaptických procesov. .sk). Zamerali sme sa na synaptické gény spojené s X, pretože niekoľko dôkazov implikovalo chromozóm X v ASD a SCZ. 20, 21 V porovnaní s autozomálnymi génmi je podiel génov spojených s X zapojených do vývoja mozgu a kognície vysoký. 22, 23, 24 Početné gény spojené s X sú zapojené do nesyndromómovej mentálnej retardácie (NS-MR) a do syndrómov spojených s autistickými rysmi. 23, 25, 26 Ďalej, väzbové a asociačné štúdie identifikovali niekoľko ASD a SCZ kandidátnych oblastí na chromozóme X. 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 Okrem toho sa prevalencia ASD alebo SCZ zvyšuje u jedincov s aneuploidiou pohlavných chromozómov, ako je to v prípade Turnerových a Klinefelterových syndrómov. 23, 37, 38, 39 Nakoniec je prevalencia ASD štyrikrát vyššia u mužov ako u žien. 40 Tento rozdiel v prevalencii chorôb súvisiaci s pohlavím sa netýka SCZ; Zdá sa však, že u schizofrenických mužov sa vyvinuli závažnejšie príznaky v skoršom veku ako u žien. 41

Na základe vyššie uvedených dôkazov sme skúmali X-viazané synaptické gény na výskyt zriedkavých škodlivých variantov v kohorte 142 jedincov ASD a 143 SCZ (obrázok 1a). Kohorta ASD zahŕňa pacientov s klasickým autizmom, Aspergerovým syndrómom a pervazívnou vývojovou poruchou inak nešpecifikovanou, zatiaľ čo kohorta SCZ zahŕňa pacientov s SCZ, schizoafektívnou poruchou (SCZaff) a schizofréniou s nástupom do detstva (COS).

Image

Stratégia použitá na výber a skríning synaptických kandidátnych génov. a ) Schematický prehľad celého projektu: od výberu kandidátnych génov po identifikáciu génov pravdepodobne zapojených do ASD a SCZ. ( b ) Reprezentácia počtu synaptických génov identifikovaných podľa troch rôznych zdrojov: proteomické štúdie, SynDB (Synapse Database) a manuálny dotaz na PubMed (pozri materiály a metódy; doplnkové metódy). Zoznam génov vybraných podľa rôznych zdrojov je uvedený v doplnkovej tabuľke 1. c ) Zoznam kritérií použitých na klasifikáciu a hodnotenie synaptických génov. Globálne skóre pre každý gén bolo súčtom všetkých bodov získaných pomocou rôznych kritérií. Ďalšie podrobnosti sú uvedené v doplnkových tabuľkách 2 a 3.

Obrázok v plnej veľkosti

  • Stiahnite si snímku aplikácie PowerPoint

výsledok

Výber a skríning kandidátnych génov

Z anotovaných génov spojených s 1125 X sme vytvorili zoznam 188 génov kódujúcich synaptické alebo potenciálne synaptické proteíny pomocou reštrikcií PubMed, publikovaných proteomických štúdií a SynDB (pozri obrázok 1b; materiál a metódy; doplnková tabuľka 1). To zodpovedá 17% z celkového počtu génov spojených s X, pričom sú zastúpené všetky kategórie synaptických funkcií. Tento zoznam sme zúžili na 111 génov použitím selektívnych kritérií a schémy stanovenia priorít (pozri obrázok 1c; materiál a metódy; doplnkové tabuľky 2 a 3). Na amplifikáciu exónov a intronických hraníc všetkých dostupných izoforiem každého génu sme navrhli 1324 PCR amplikónov a úspešne optimalizovali podmienky PCR pre 1263 fragmentov, ktoré pokrývajú 96% kódujúcich oblastí. Fragmenty boli amplifikované vo vzorkách 285 pacientov a produkty PCR boli sekvenované (jedno vlákno).

Identifikovali sme a potvrdili sme 533 variant kódovania a zostrihu (tabuľka 1; doplnková tabuľka 4), ktoré obsahovali 526 jednonukleotidových zmien a sedem inzercií / delécií (indely). Bolo nájdených veľké množstvo tichých (S) a missense (NS) variantov, ako aj dva nezmyslové varianty, jedna zmena zostrihu a jedna substitúcia prvého metionínu. Päť zo siedmich indlov (v génoch CACNA1F , PAK3 , GPR50 , GABRQ a ATP6AP1 ) bolo v rámci a pridalo / odstránilo jednu alebo niekoľko aminokyselín. Tieto indely sa nezameriavali na konzervované aminokyseliny, o ktorých sa predpokladá, že sa podieľajú na proteínovej funkcii, a preto neboli pravdepodobné, že budú patogénne (tabuľka 2). Dva ďalšie indely spôsobili posun rámcov a sú opísané v nasledujúcej časti.

Tabuľka v plnej veľkosti

Tabuľka v plnej veľkosti

Varianty, ktoré môžu spôsobiť skrátenie proteínov

Celkovo sa identifikovalo šesť potenciálne skrátených variantov, štyri jednonukleotidové substitúcie a dva indely (tabuľka 2). Nezmyselný variant nájdený v P2RY4 (c.1043G> A, p.W348X) bol zjavne polymorfizmus, ktorý sa označuje ako rs41310667. Variant posunu rámcov zistený v HS6ST2 (žena (F): c.23delT, p.V8AfsX26), u ktorého sa predpokladalo, že skráti veľkú časť proteínu, sa tiež zistil u jednej kontrolnej samice a jej otca a predpokladá sa, že je polymorfizmus, Varianty ovplyvňujúce konsenzuálne miesto zostrihu (F: c.3034-1G> A) a iniciačný metionín (2 muži (M): c.1A> G, 2 M) PCDH11X , respektíve PLXNB3 , neboli predpovedané, že majú silné poškodzujúci účinok z dôvodu ich relatívnej polohy v proteíne (pozri poznámky v tabuľke 2). Na rozdiel od toho, delécia 7 bp (F: c.1100-1106delTACTCTT) v géne IL1RAPL1 , ktorá spôsobila posun rámca p.I367fsX6 u jednej dievčatá s Aspergerovým syndrómom, viedla k strate funkcie IL1RAPL1, ako je opísané vyššie. 51 Skríning IL1RAPL1 u ďalších pacientov s ASD viedol k identifikácii nového variantu missense (M: 59A> G; p.K20R), ktorý nebol prítomný v kontrolnej populácii. Nakoniec bola u jedného chlapca v géne kódujúcom MAOB identifikovaná nukleotidová substitúcia (M: c.1342C> T) vedúca k predčasnému stop kodónu (p.R448X) (obrázok 2a). Tento pacient mal poruchu SCZaff s nástupom v ranom veku a variant R448X bol zdedený po matke, ktorá mala v anamnéze výraznú depresiu. Okrem toho existovala rodinná história SCZ na matkinej strane. Tento variant niesol brat pacienta, ktorý mal diagnózu SCZ. Proband však vykazoval inú diagnózu (SCZaff vs SCZ) a skorší vek nástupu (15 vs 22 rokov) ako jeho starší brat. Predpokladalo sa, že tento variant R448X odstráni posledných 73 aminokyselín MAOB proteínu, ktorý zahŕňa mitochondriálnu kotvu k vonkajšej membráne a intermembránových doménach; toto skrátenie by mohlo ovplyvniť zacielenie proteínu na mitochondrie. Sekvencovanie 190 ďalších SCZ pacientov viedlo k identifikácii troch nových missense variantov, c.326C> T (M: p.P109L), c.958G> A (M + F: p.E320K) a c.1003G> A (M: p.G335S), u troch chlapcov, všetci prenášaní heterozygotnou matkou bez ovplyvnenia (obrázok 2b; doplnková tabuľka 6). Variant E320K sa okrem toho našiel aj u jednej ďalšej dievčatá so SCZ. Všetky tieto varianty ovplyvňovali evolučne konzervované aminokyseliny nachádzajúce sa v cytoplazmatickej doméne proteínu a môžu ovplyvňovať funkciu proteínu, najmä variant P109L, ktorý modifikuje aminokyselinu zapojenú do väzby na mitochondriálnu membránu. 52 Exóny MAOB, ktoré obsahujú opísané varianty, boli sekvenované u 190 kontrolných jedincov a neboli identifikované žiadne zmeny NS.

Image

Varianty MAOB identifikované u jednotlivcov SCZ. Zodpovedajúci rodokmeň rodiny (proband je označený šípkou) a chromatogramy pre proband (P) a kontrolu (C), ako aj konzervácia aminokyselín, sú zobrazené pre každý variant. a ) Nezmyselný variant identifikovaný počas prvého skríningu 143 pacientov s SCZ. b ) Missense varianty identifikované počas skríningu 190 ďalších pacientov s SCZ.

Obrázok v plnej veľkosti

  • Stiahnite si snímku aplikácie PowerPoint

Analýza variantov identifikovaných génov na gén

Berúc do úvahy rôzne izoformy RefSeq všetkých sekvenovaných génov, v tejto štúdii sme skúmali odhadovaných 71 723 kodónov na pacienta (doplnková tabuľka 5), ​​čo zodpovedá celkom 76 Mb kódovacej sekvencie. Varianty S a NS sa našli v približne rovnakom pomere, čo je v súlade so zisteniami nedávnej analýzy celého exómu jedného jednotlivca 53 . Pre každý gén sme reprezentovali počet variantov S + NS ako funkciu dĺžky kódujúcej sekvencie (doplnková tabuľka 5; doplnkový obrázok la). Niektoré gény (napríklad USP9X ) mali podľa svojej dĺžky kódovacej sekvencie menej variantov, ako sa očakávalo, zatiaľ čo iné (napríklad SHROOM2 alebo HCFC1 ) vykazovali akumuláciu variantov; nemohli sme však zistiť koreláciu medzi týmito nálezmi a chromozomálnou polohou rôznych génov (údaje nie sú uvedené). Gény ako HCFC1 mali významne menej NS ako S varianty, čo naznačuje, že variácie v ich kódujúcej sekvencii nie sú dobre tolerované (doplnkový obrázok 1b). Naopak, v génoch ako PLXNB3 , GPR50 alebo HS6ST2 sa pozoroval nadbytok variantov NS. Pre každý gén sme vypočítali Ka, čo je počet variantov NS vydelený počtom miest NS. Analýza génov s vysokou Ka v našich kohortách neumožnila rozlíšenie medzi vysoko polymorfným génom (v ktorom je tolerovaná väčšia variácia kódovacej sekvencie) od génu obohateného o varianty spôsobujúce ochorenie.

Prebytok zriedkavých a škodlivých variantov NS

Varianty identifikované v našej štúdii sme klasifikovali buď ako zriedkavé varianty alebo polymorfizmy. Skupina „zriedkavých variantov“ zahŕňala všetky nové (neuvedené v žiadnej databáze) varianty identifikované iba u jedného jednotlivca alebo u jedincov zdieľajúcich rovnaké ochorenie, buď ASD alebo SCZ (keďže to mohli byť zriedkavé varianty zdieľané pacientmi s nedávnym spoločným predkom), Skupina „polymorfizmus“ zahrnovala všetky známe varianty alebo všetky varianty nešpecifické pre jedno ochorenie, ktoré pravdepodobne predstavujú neutrálne polymorfizmy.

Vzhľadom na to, že varianty NS majú pravdepodobnejší vplyv na funkciu génov, pretože spôsobujú zmenu aminokyselín a varianty S ako skupinu všeobecne neutrálnych variantov, identifikovali sme dva parametre, ktoré boli spojené s nerovnomerným rozdelením variantov NS a S., Iba 30% identifikovaných variantov bolo už známych (buď prítomných v databázach SNP (dbSNP a ExoSeq) alebo opísaných v literatúre). Distribúcia nových verzus známych variantov bola však významne odlišná medzi variantmi S a NS ( P = 0, 0004), pričom prebytok variantov NS bol nový (tabuľka 1). Možno dôležitejšie je, že zoskupenie variantov do zriedkavých variantov a polymorfizmov odhalilo významný rozdiel v distribúcii variantov S a NS ( P = 0, 0004) smerom k identifikácii viacerých zriedkavejších variantov NS, ako sa očakávalo. Analýza potenciálneho účinku variantov NS missense pomocou rôznych predikčných programov ukázala, že podľa najmenej dvoch z troch testovaných algoritmov boli zriedkavé varianty významne škodlivejšie ako polymorfizmy (doplnková tabuľka 4; obrázok 3), čo naznačuje, že môže zahŕňať mutácie spôsobujúce ochorenie pre ASD alebo SCZ. Aj keď sme sa v našej štúdii rozhodli zamerať na zmeny NS, sme si vedomí, že v niektorých prípadoch môžu mať určité S varianty vplyv na zostrih mRNA alebo stabilitu. 54, 55

Image

Potenciálny vplyv rôznych identifikovaných variantov missense na proteínovú funkciu bol identifikovaný podľa troch predikčných programov: PolyPhen, PANTHER a SIFT. Varianty boli rozdelené do skupín „ zriedkavý variant “ ( zriedkavý ) a „ polymorfizmus “ ( pol ). Percentuálny podiel variantov spojených s benígnymi (PolyPhen) alebo tolerovanými (SIFT) predpoveďami alebo so skóre> 5 (PANTHER) je vyjadrený zelenou farbou, zatiaľ čo varianty spojené s možným alebo pravdepodobne škodlivým účinkom (PolyPhen), ktoré ovplyvňujú predpoveď funkcie proteínu ( SIFT) alebo so skóre <−5 (PANTHER) sú zobrazené červenou farbou. Sivá časť predstavuje varianty, pre ktoré predikcia nebola známa (PolyPhen), daná s nízkou spoľahlivosťou (SIFT) alebo nie je k dispozícii (PANTHER).

Obrázok v plnej veľkosti

  • Stiahnite si snímku aplikácie PowerPoint

Gény, ktoré predstavujú nadbytok zriedkavých variantov NS

Niektoré gény mali vyššie Ka pre zriedkavé varianty ( zriedkavé Ka) ako ich Ka polymorfizmov (Ka pol ) (doplnková tabuľka 5; doplnkový obrázok 2). Z nich niektorí mali vyššiu Ka zriedkavejšie v jednej kohorte ako v druhej; medzi ne patrili gény ako TM4SF2 / TSPAN7 , HNRPH2 , PSMD10 a CACNA1F pre ASD a RBM3 , PNCK , SLITRK2 alebo KCND1 pre SCZ.

Na identifikáciu génov, ktoré vykazovali väčší počet zriedkavých zmien NS u pacientov, ako sa očakávalo od rýchlosti ich vývoja, sme vykonali McDonald-Kreitmanov test (doplnková tabuľka 5). Čo sa týka kohorty SCZ, získali sa významné rozdiely pre SLITRK2 ( P = 0, 0006), rodinu neuritálnych transmembránových proteínov SLITRK, ktorá ovplyvňuje vyrastanie neuritov. 56 V tomto géne sme identifikovali dva nové missense varianty c.265G> A a c.1646C> T (F: p.V89M a F: p.S549F) u dievčat s SCZ a ich postihnutých súrodencov. Významné výsledky sa získali aj pre SEPT6 ( P = 0, 004) a KCND1 ( P = 0, 004). Prekvapivo, MECP2 , hlavný gén Rettovho syndrómu, vykazoval akumuláciu zriedkavých variantov NS ( P = 0, 004) v kohorte SCZ. Významný prebytok zriedkavých variantov NS v kohorte ASD sa získal pre CACNA1F ( P = 0, 0011). Tento gén sa podieľa na vrodenej stacionárnej nočnej slepote typu 2. Missense mutácia (I745T) v CACNA1F bola opísaná vo veľkej rodine s vrodenou stacionárnou nočnou slepotou typu 2, v ktorej päť postihnutých mužov malo intelektuálne deficity a traja z nich piatim jedincom bola diagnostikovaná ASD. Je zaujímavé, že ďalší členovia tejto rodiny vápnikových kanálov boli spojení s ASD ( CACNA1C , 58 CACNA1H , 59 a CACNA1G 60 ). Aj keď dva varianty NS identifikované u dvoch pacientov s ASD (2 M: p.V635I a M + F: p.N746T) boli tiež nájdené v kontrolnej kohorte, štyri jedinečné missense varianty (M: p.L977F, M: p. D1966N, M: p.Q1625R a M: p.G1684R) chýbali v kontrolnej populácii; analýza predpovedí cosegregácie a funkčných efektov však nepodporila ich implikáciu v ASD. CDKL5 , ktorý spôsobuje Rettov syndróm, 61 a PLXNB3 , plexín pôsobiaci ako receptor pre semaforín 5A, tiež vykazoval akumuláciu zriedkavých variantov NS ( P = 0, 0068, respektíve P = 0, 0012), ale to nebolo významné pre ASD alebo SCZ. oddelene. Na riešenie problému štruktúry populácie sme opäť vykonali analýzu s vylúčením zriedkavých variantov od pacientov s neeurópskym a belošským pôvodom (10 ASD a 10 SCZ) a získali sme podobné výsledky.

Prenos, pohlavie a distribúcia chorôb zriedkavých variantov

Na vyhodnotenie spôsobu prenosu každého vzácneho variantu sme znovu amplifikovali príslušné genomické fragmenty a resekvenovali ich v probande a jeho rodičoch. Keďže veľká väčšina rodičov nebola ovplyvnená, môžeme rozoznať spôsoby prenosu, ktoré uprednostňujú implikáciu zriedkavých variantov choroby, tj de novo dedičnosť alebo prenos z heterozygotnej matky na hemizygálneho chlapca. Musíme byť zvlášť opatrní pri variantoch de novo , pretože sme zistili, že nezanedbateľnou časťou identifikovaných variantov de novo boli artefakty spojené s použitím DNA extrahovanej z lymfoblastoidných bunkových línií a nedalo sa potvrdiť v zodpovedajúcej krvnej DNA., Spomedzi ôsmich de novo variantov pôvodne identifikovaných v tejto štúdii bola ako bona fide de novo variantov potvrdená iba delécia v IL1RAPL1 a missense v MECP2 . Dva z týchto variantov boli varianty bunkových línií a štyri neboli testované, pretože krvná DNA nebola dostupná, ale pravdepodobne ide o artefakty bunkových línií, pretože u väčšiny z nich sa u mužov našli ako heterozygotné varianty.

Na základe počtu testovaných chromozómov sme nepozorovali významné rozdiely v počte zriedkavých variantov NS u mužov a žien. Iba jeden variant NS (F: c.175G> A; p.D59N v géne TRO ) bol homozygotný u jedného dievčaťa z pakistanskej rodiny. Predpokladalo sa, že tento variant bude mať benígny účinok na funkciu proteínu a nebude segregovať s SCZ v rodine. Niektoré zriedkavé varianty NS identifikované u heterozygotných žien však môžu byť tiež príčinné. V skutočnosti, v prípade variantov prenášaných neovplyvnenou matkou, by to mohol byť rozdiel v modeloch inaktivácie X, ktoré spôsobujú fenotyp u niektorých nosných žien a nie u iných. Rozhodli sme sa však, že sa nebude systematicky testovať vzorec X-inaktivácie pre všetky zriedkavé varianty NS identifikované u žien, keďže extrapolácia vzoru X-inaktivácie vedie k tomu, že DNA lymfoblastoidných bunkových línií alebo dokonca v krvi môže byť nesprávne odhadnúť. čo sa deje v mozgových tkanivách. Nepozorovali sme žiadny významný rozdiel v počte zriedkavých variantov NS medzi kohortami ASD a SCZ. Avšak medzi jedincami európskeho belošského pôvodu viac SCZ ako u pacientov s ASD (14 oproti 7) akumuluje niekoľko zriedkavých variantov NS (doplnkový obrázok 4).

Najsľubnejšie zriedkavé varianty NS

Na identifikáciu variantov, u ktorých je väčšia pravdepodobnosť mutácií spôsobujúcich náchylnosť na ochorenie alebo ktoré spôsobujú ochorenie, boli všetky zriedkavé varianty NS zoradené podľa ich potenciálne škodlivého účinku na funkciu proteínu a spôsobu prenosu a / alebo ksegregácie medzi variantmi a chorobou. (Doplnková tabuľka 7). Najsľubnejšie varianty sú uvedené v tabuľke 3 a je tu opísaných niekoľko príkladov.

Tabuľka v plnej veľkosti

Identifikovali sme jeden potenciálne škodlivý variant c.733T> C (M: p.F245L) v PPP1R3F , ktorý kóduje regulačnú podjednotku proteínovej fosfatázy 1, u jedného chlapca s diagnostikou a záchvaty Aspergerovho syndrómu (doplnkový obrázok 3a). Tento variant odovzdala matka, ktorá trpela poruchami učenia a záchvatmi. Proteín fosfatáza 1 je serín / treonín fosfatáza, ktorá pozostáva z katalytickej podjednotky, ktorá môže interagovať s viac ako 50 regulačnými alebo lešenárskymi proteínmi a je zapojená do mnohých bunkových procesov. V neurónoch ovplyvňuje proteínová fosfatáza 1 rast neuritov, tvorbu synapsií a je rozhodujúca pre synaptickú plasticitu a učenie a pamäť. 62

Tiež sme identifikovali missense variant, c.385G> A (M: p.G129R), v géne 26S proteazómovej non- ATPázovej regulačnej podjednotky ( PSMD10 ) u jedného chlapca s klasickým autizmom. Tento variant bol zdedený po svojej heterozygotnej matke (doplnkový obrázok 3b). Zvyšok Gly129 je medzi druhmi dokonale konzervovaný a nachádza sa v doméne ANK3 (ankyrin) PSMD10 (ktorý je tiež známy ako gankyrin). Početné synaptické proteíny, vrátane proteínov lešenia alebo receptorov neurotransmiterov, sú regulované degradačnými mechanizmami prostredníctvom ubikvitín-proteazómovej dráhy, čo je jav, ktorý je zvlášť dôležitý pre synaptickú plasticitu. 63 Okrem toho niekoľko proteínov tejto dráhy, ako je ubikvitín ligáza UBE3A, bolo spojených s poruchami podobnými autizmu a MR. 64, 65 Neexistuje žiadny priamy dôkaz, že PSMD10 sa podieľa na degradácii synaptických proteínov; jej synaptická lokalizácia však naznačuje túto funkciu. Nekonzervatívna substitúcia aminokyseliny v jednej doméne ANK tohto proteínu by mohla zmeniť jeho väzbu na proteínových partnerov a zhoršiť jeho funkciu.

Missense variant c.1845C> A (F + M: p.F555L) bol identifikovaný v géne kódujúcom proteín MCF2 / DBL, ktorý je členom veľkej rodiny výmenných faktorov GDP-GTP pre malé GTPázy rodiny Rho. (Doplnkový obrázok 3c). Variant F555L bol nájdený u jednej heterozygotnej dievčatá SCZaff, jej najmladšieho brata SCZaff a jej nedotknutej matky. Tento variant ovplyvňuje vysoko konzervovanú aminokyselinu a predpokladá sa, že podľa rôznych programov poškodzuje funkciu proteínov (doplnková tabuľka 4). Zvyšok Phe555 sa nachádza v motíve DBL, ktorý je rozhodujúci pre reguláciu Rho-GTPáz. V tomto géne boli pozorované ďalšie zriedkavé varianty alebo polymorfizmy, ale nezahŕňali vysoko konzervované zvyšky. Myši s vyradeným Dbl údajne vykazujú kratšie dendrity v odlišných populáciách Dbl- null kortikálnych pyramidálnych neurónov, čo naznačuje funkciu pre MCF2 / Dbl v predĺžení dendritu. 66 V prefrontálnom kortexe schizofrenických jedincov bolo pozorovaných 66 znížených dendritických tŕňov, čo naznačuje možné zapojenie RhoGTPázy. 18, 19

Ďalšie sľubné varianty boli identifikované v génoch kódujúcich proteíny zapojené do bunkovej adhézie (SLITRK2, PCDH11X, PCDH19, TM4SF2 / TSPAN7), serotonínovej dráhy (MAOA, HTR2C), transportu mRNA alebo proteínu (HNRPH2, GPRASP2), homeostázy vápnika (ATP2B3) alebo Regulácia RhoGTPázy (OPHN1). Boli identifikované aj varianty v niekoľkých neurotransmiterových receptoroch (GLRA2, GABRE, HTR2C). Nakoniec sme identifikovali varianty v génoch kódujúcich proteíny zapojené do rôznych bunkových funkcií menej špecifických pre synapsiu (WNK3, CXCR3, IDH3G, HCFC1 alebo SLC9A6), ako aj proteíny vysoko exprimované v mozgu s neznámou alebo nejasnou funkciou (PDZD4, FRMPD4, BEX2).,

Skríning MR génov

Sekvenčná analýza génu TM4SF2 / TSPAN7 viedla k identifikácii variantu missense P172H, ktorý bol predtým asociovaný s MR v dvoch rodinách. 67, 68 V prvej štúdii nebola kogenerácia tohto variantu dokonalá, pričom jeden neovplyvnený muž nesie variant. Tento variant bol tiež identifikovaný iným tímom, ktorý sledoval pacientov s MR a nebol prítomný u 77 pacientov s ASD 68 a 420 testovaných kontrolných chromozómov. Variant P172H sme našli u jedného chlapca s ASD s MR; tento variant bol zdedený po jeho matke (doplnkový obrázok 3d). Sekvenovali sme ďalších 285 pacientov s ASD pre fragment kódujúci túto aminokyselinu a našli sme ten istý variant u iného chlapca, u ktorého bola diagnostikovaná pervazívna vývojová porucha, ktorá nie je inak špecifikovaná bez MR (doplnková tabuľka 5). Tento variant nebol prítomný v 143 SCZ ani v 190 etnicky zhodných kontrolných jedincoch. Celkovo naše a predchádzajúce správy odhalili, že variant P172H nebol nájdený v 697 kontrolných chromozómoch X. Naše výsledky pridávajú dôkazy o funkcii substitúcie P172H v TM4SF2 / TSPAN7 nielen v MR, ale aj v ASD. TM4SF2 / TSPAN7 kóduje glykoproteín bunkového povrchu z rodiny tetraspanínov, triedy proteínov, ktoré majú funkciu pri regulácii vývoja, aktivácie, rastu a pohyblivosti buniek. Zvyšok Pro172 je umiestnený v extracelulárnej slučke, oblasti, ktorá môže byť zapojená do interakcie s inými adhéznymi proteínmi.

Skríning génu RTT MECP2 odhalil de novo missense variant (F: p.R309W) u dievčaťa s ASD. Vyskytuje sa v nej dôležitá psychomotorická retardácia a od dospievania sa u nej vyskytli závažné epileptické záchvaty. Nespĺňa však kritériá pre klasický ani atypický RTT. Tento variant, už opísaný u jedného chlapca s NS-MR, 69, ovplyvňuje konzervovanú aminokyselinu umiestnenú v doméne zodpovednej za interakciu s cyklín-dependentnou kinázou podobnou CDKL5 a predpokladá sa, že bude škodlivá.

Tiež sme identifikovali dva zriedkavé missense varianty v OPHN1 : c.1381A> G (M: p.M461V) u jedného pacienta s COS a c.2114A> G (M: p.H705R) u jedného pacienta s ASD (doplnkový obrázok 3e). Predpokladalo sa, že tieto dva varianty ovplyvňujú funkciu proteínov podľa rôznych programov a zameriavajú sa na aminokyseliny, ktoré sú medzi druhmi dobre konzervované. Na rozdiel od toho sa predpokladá, že polymorfizmy a varianty OPHN1 nájdené v kontrolnej kohorte (doplnková tabuľka 5) majú priaznivý vplyv na funkciu proteínu. OPHN1 kóduje proteín aktivujúci RhoGTPázu, ktorý interaguje s RhoA, Rac, cdc42, aktínovými vláknami a s proteínom HOMER. Je exprimovaný v neuronálnych aj gliových bunkách a zúčastňuje sa na regulácii elongácie dendritov. U pacientov s MR a cerebelárnou hypopláziou bolo pre tento gén opísaných 70 nezmyslových, zostrihových, snímkových posunov a missense mutácií. 71 Je zaujímavé, že mozgové abnormality boli tiež opísané u pacientov s COS a ASD. 72, 73

Z ďalších génov, o ktorých je známe, že sa podieľajú na chorobách súvisiacich s NS-MR, ASD alebo ASD, podskupina nevykazovala žiadne variácie vo svojich kódujúcich sekvenciách, vrátane AP1S2 , ARHGEF9 , DCX , GDI1 a SLC6A8 . U CASK a SYP neboli pozorované žiadne varianty NS, dva gény, ktoré nedávno uviedli Tarpey et al. 50 spôsobuje NS-MR. Okrem toho neboli počas skríningu ARHGEF6 , ATP6AP2 , ARX , JARID1C a FMR1 identifikované žiadne nové varianty NS. To sa týkalo aj RPL10 , v ktorom boli varianty nedávno opísané u pacientov s ASD. 74 Niekoľko nových variantov NS bolo identifikovaných v CDKL5 , DLG3 , NLGN3 , PAK3 , AFF2 a RPS6KA3 ; analýza rodokmeňov a predpokladaného účinku týchto variantov na funkciu proteínov však naznačuje, že žiadny z nich sa pravdepodobne nebude podieľať na ASD.

diskusia

Naša štúdia uvádza systematické resekvovanie kódujúcich oblastí 111 X-viazaných kandidátnych génov v kohorte 285 pacientov s ASD a SCZ zameraných na identifikáciu génov potenciálne zapojených do týchto porúch. Pomocou rôznych metód sme uprednostnili tieto gény z väčšej skupiny 1125 X-viazaných génov a asi 5 000 potenciálne synaptických génov. Pokiaľ ide o chromozóm X, iba 28 génov bolo zdieľaných medzi zoznamom génov od SynDB a génom odvodeným z proteomických štúdií. Túto nezhodu možno vysvetliť tromi hlavnými dôvodmi: (1) niektoré synaptické proteíny, ako sú membránové receptory, sa ťažko čistia a mohli by byť vynechané proteomickými štúdiami, (2) prítomnosť väčšieho počtu falošne pozitívnych výsledkov v SynDB kvôli zahrnutiu génov založených na štrukturálnych predikciách a (3) frakcia proteínov nájdených prostredníctvom proteomických štúdií môže tiež predstavovať falošne pozitívne výsledky, pretože by to mohlo byť spôsobené kontamináciou synaptickej frakcie počas prípravy. Tieto výsledky nás presvedčili, aby sme použili komplementárnosť týchto dvoch typov zdrojov. Zoznamy génov extrahované zo SynDB a z proteomických štúdií celkovo obsahovali 65% génov identifikovaných pomocou nášho manuálneho vyhľadávania PubMed. Kombinácia týchto troch zdrojov viedla k komplexnému zoznamu chromozómov X potenciálne synaptických génov. Tento zoznam tiež poskytuje dobré kandidátske gény na skríning iných psychiatrických a neurologických porúch, ako je bipolárna porucha alebo Tourettov syndróm.

Tu sme identifikovali niekoľko stoviek variantov, z ktorých väčšina nebola opísaná v žiadnej verejnej databáze. Tarpey a kol. , 50, ktorí nedávno uverejnili zoznam variantov X-chromozómov nájdených u pacientov s MR, identifikovali 134 tu uvedených variantov, ktoré zodpovedali hlavne kategórii polymorfizmu. Ich kohorta však nie je pre našu štúdiu relevantnou kontrolou, pretože MR a ASD sú geneticky príbuzné a sú často klinicky komorbidné. Skrínovali sme trikrát menej nukleotidov (75 954 657 bp oproti 000 200 000 000 bp) ako Tarpey a kol. a našli približne trikrát menej variantov v kódujúcich oblastiach (533 vs. 1858). Zistili sme však výrazne menej skrátených variantov (6 oproti 40). Tento výsledok nie je prekvapujúci, pretože ich skupina zahŕňala iba rodiny s MR s X väzbou. V súlade s ich výsledkami sme pozorovali, že skrátené varianty v dvoch génoch ( P2RY4 a HS6ST2 ) sa zdajú byť dobre tolerované u mužov a nevedú k zjavnému fenotypu. Na rozdiel od variantu v P2RY4 , ktorý odstraňuje iba C-terminálny koniec proteínu, variant v HS6ST2 odstraňuje takmer všetok proteín. Možná funkčná redundancia s inými subtypmi heparan sulfátu 6-O-sulfotransferázy, ako sú HS6ST1 a HS6ST3, môže vysvetliť skutočnosť, že skrátenie HS6ST2 je tolerované u mužov.

Napriek pravdepodobnej funkcii zriedkavých variantov s nedávnym pôvodom v ASD a SCZ sme identifikovali a potvrdili iba dva de novo škodlivé varianty, ktoré sa našli v IL1RAPL1 a MECP2 u dvoch ASD dievčat. Avšak kvôli špecifickosti X-viazaného prenosu sme si vedomí, že X-viazané gény nie sú ideálne na testovanie de novo hypotézy. U pacientov s SCZ bol v géne MAOB identifikovaný jeden nezmysel a niekoľko chýbajúcich variantov. MAOB katalyzuje oxidačnú deamináciu xenobiotických a biogénnych amínov, ako je neurotransmiter dopamín alebo neuromodulátorový fenyletylamín. 75 Fenylethylamín sa podieľa na modulácii nálady, a keďže je štruktúrne blízky amfetamínu, môže spôsobiť, ak je vyjadrený vo vysokých hladinách, podobný typ psychózy. 76 Navyše u pacientov s SCZ bola predtým opísaná nízka aktivita MAOB a zvýšený fenyletylamín v moči. 77 Niekoľko štúdií nedokázalo žiadnu súvislosť medzi polymorfizmami v MAOB a SCZ; v Španielsku sa však nedávno našlo jedno pozitívne združenie. 78 Nonetheless, one would not expect positive associations if disease-predisposing mutations are different rare mutations. Although no evident neurological phenotype was found in two boys who carry a deletion of a fragment of MAOB and of the Norrie disease gene, 79 MAOB knockout mice present elevated phenylethylamine in urine and an increased reactivity to stress. 80 Regarding the possible implication of MAOB in SCZ, the identification of one nonsense mutation in this gene in one SCZaff patient is potentially relevant, even if the cosegregation was not perfect. Further studies are needed to determine the effect of the three missense variants found in the four additional families on MAOB function.

The NS rare variants identified in this study were predicted to be more damaging than the NS polymorphisms, which suggests that they may include disease-causing mutations responsible for ASD or SCZ. The genetic follow-up on these variants is challenging, as most of our patients are sporadic cases. Moreover, because of the genetic complexity of ASD and SCZ, we do not expect to find a perfect segregation of variants with the disease, which hampers the interpretation of the results. Several genes in which we identified potentially damaging variants have a function in structural modulation of the synapse. The involvement of the IL1RAPL1, OPHN1, and MCF2 proteins in neurite outgrowth is well documented 66, 70, 81 and evidence suggests that SLITRK2 and TM4SF2/TSPAN7 may also be implicated in this process. 56, 67 We also highlighted variants in genes involved in serotonin function ( HTR2C ) and degradation ( MAOB ) in SCZ patients.

Our gene scoring system aimed at selecting the best candidate genes seems to have performed well. MAOB was selected with a score equal to 6, which was the maximum score. Several of the genes in which we found potentially relevant variants in ASD (for example IL1RAPL1 , OPHN1 , TM4SF2 / TSPAN7 , or MECP2 ) were selected because of their involvement in NS-MR. Interestingly, most of our ASD individuals who carried mutations in these genes did not have MR. These results support a genetic link between MR and ASD, suggesting that the same genes and mutations may predispose to these two diseases, as was shown earlier for NLGN4. 12 Therefore, the screening of genes involved in MR in ASD patients is warranted, even if the patients do not have MR. The study of factors (environmental or genetic) that modulate these phenotypes will be critical to understand the molecular pathways that underlie MR, ASD, or both.

The identification of two damaging variants in OPHN1 in one male with ASD and in another with COS suggests a genetic link between these two diseases. The COS patient was also diagnosed with pervasive developmental disorder as one-third of the individuals with COS. The hypothesis of the existence of common genes between ASD and SCZ is emerging 82 and has been shown by the discovery that copy number variants of the NRXN1 synaptic gene are associated with these two diseases. 83 Similarly, the SCZ-associated DISC-1 gene was also found to be involved in ASD. 84 Interestingly, in concordance with our results, a recent study showed that several copy number variants are common between MR, ASD, and SCZ, supporting the existence of shared biologic pathways in these neurodevelopmental disorders. 85, 86

In conclusion, our results indicate that large-scale direct resequencing of synaptic candidate genes constitutes a promising approach to dissect the genetic heterogeneity of SCZ and ASD and to explore the hypothesis that a number of distinct individually rare penetrant variants are involved in the pathogenesis of these two syndromes. Indeed, the identification of an excess of potentially damaging rare variants in ASD and SCZ patients validated the usefulness of this approach. However, with the exception of mutations in IL1RAPL1 , MECP2 and maybe TM4SF2/TSPAN7 in ASD, it is difficult to make a definitive claim that the damaging variants identified here are disease causing. The truncating mutation in MAO B, as well as other missense variants in different genes are promising, but further work involving functional testing will be needed to confirm the implication of these rare variants in SCZ and ASD. If the hypothesis of rare variants with classical Mendelian inheritance does not seem to entirely explain the complexity of the genetic factors involved in ASD, we succeeded, at least, in the identification of causative mutations in some ASD patients. However, the story seems to be more complicated for SCZ. The excess of patients accumulating several NS rare variants in the SCZ cohort in comparison with the ASD cohort and the lack of identification of a clear segregating damaging mutation in SCZ in our study suggest that SCZ may involve more an interaction between rare variants with moderate effects in different synaptic genes rather than addition of Mendelian inheritances. Interestingly, a recent genome-wide association study on SCZ reported that common polygenic variants could also contribute to the risk of SCZ. 7 These common variants may work in concert with rare variants to manifest SCZ. However, we are limited in this conclusion because we analyzed only variants on the X chromosome. A similar approach targeting autosomal genes is needed to examine whether autosomal rare variants provide a similar picture to that of our X-chromosome study. More generally, for these diseases, the 'rare variant with penetrant effect' vs the 'common variant with low effect' hypotheses should not be viewed as exclusive hypotheses, but more as a continuum including also variants with rare frequency and having moderate effect. That is why direct resequencing of candidate genes, as well as copy number variants or genome-wide association study analyses, could be viewed as complementary approaches to dissect the genetic susceptibilities to SCZ and ASD.

Doplnková informácia

Obrázkové súbory

  1. 1.

    Doplnkový obrázok 1

  2. 2.

    Doplnkový obrázok 2

  3. 3.

    Doplnkový obrázok 3

  4. 4.

    Doplnkový obrázok 4

Word dokumenty

  1. 1.

    Legenda o doplnkových obrázkoch

  2. 2.

    Doplnkové metódy

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplnkové tabuľky

    Doplňujúce informácie sprevádzajú dokument na webovej stránke Molecular Psychiatry (//www.nature.com/mp)