Štruktúrna charakterizácia syntáz proteínových proteínov beta-ketoacyl-acylového nosiča, fabf a fabh, z yersinia pestis | vedecké správy

Štruktúrna charakterizácia syntáz proteínových proteínov beta-ketoacyl-acylového nosiča, fabf a fabh, z yersinia pestis | vedecké správy

Anonim

predmety

  • Mastné kyseliny
  • Rôntgenová kryštalografia

abstraktné

Yersinia pestis , pôvodca moru búriky, zápalu pľúc a septikémie, zostáva hlavnou hrozbou pre verejné zdravie, pričom v posledných piatich rokoch sa v Číne, na Madagaskare a Peru objavili ohniská choroby. Existencia multidrogovo rezistentného Y. pestis a potenciál tejto baktérie ako prostriedku na bioterorizmus ilustruje potrebu nových antimikrobiálnych látok. Syntázy ß-ketoacyl-acylových nosných proteínov, FabB, FabF a FabH, katalyzujú predĺženie mastných kyselín ako súčasť systému biosyntézy mastných kyselín typu II (FASII), aby sa syntetizovali zložky lipoproteínov, fosfolipidov a lipopolysacharidov nevyhnutných pre bakteriálne rast a prežitie. Tieto enzýmy ako také sú sľubnými cieľmi pre vývoj nových terapeutických činidiel. Stanovili sme kryštalické štruktúry syntázy β-ketoacyl-acylových proteínových proteínov Y. pestis FabF a FabH a porovnali sme ich s nepublikovanou uloženou štruktúrou FabB Y. pestis . Porovnanie FabB, FabF a FabH poskytuje pohľad na substrátové špecificity týchto enzýmov a skúmanie možných interakcií so známymi inhibítormi syntázy proteínov P-ketoacyl-acylového nosiča naznačuje, že FabB, FabF a FabH môžu byť zacielené súčasne, aby sa zabránilo syntéze mastných kyselín. kyseliny potrebné pre rast a prežitie.

úvod

Gravitačná negatívna baktéria Yersinia pestis , pôvodca moru bubnovitých, pneumonických a septikemických chorôb zostáva hlavnou hrozbou pre verejné zdravie. Zodpovedný za tri ľudské pandémie; Justiánsky mor (od šiesteho do ôsmeho storočia), Čierna smrť (od štrnásteho do devätnásteho storočia) a moderný mor (od 19. storočia do súčasnosti), Y. pestis zostáva endemický v mnohých častiach Severnej Ameriky, Južnej Ameriky, juhovýchodnej Ázie. a Afrika 1, pričom v posledných piatich rokoch sa vyskytli ohniská v Číne 2, na Madagaskare 3 av Peru 4 .

Ako pneumonický mor je Y. pestis vysoko nákazlivý a je schopný šírenia sa z človeka na človeka cez respiračné kvapky, čím odvracia normálnu zoonotickú cestu infekcie, pri ktorej sa mor šíri kontaktom s infikovanými blchami 5, 6 . Y. pestis môže tiež zostať životaschopný v pôde najmenej 24 dní 7 a v balenej vode 72 až 160 dní v závislosti od kmeňa 8 . Ak sa nelieči, infekcie Y. pestis sú zvyčajne fatálne, čo vedie k smrti už za 24 hodín po objavení sa príznakov 5, 9, 10 . Tieto charakteristiky ilustrujú potenciál Y. pestis ako biologickej zbrane, pričom Centrum pre kontrolu a prevenciu chorôb USA klasifikovalo túto baktériu ako hrozbu bioterorizmu kategórie A.

V tejto súvislosti sú správy o antimikrobiálnej rezistencii u Y. pestis alarmujúce, pričom existujú dôkazy o dvoch kmeňoch odolných voči viacerým liečivám (MDR), ktoré vykazujú vysokú hladinu rezistencie na ampicilín, chlóramfenikol, kanamycín, streptomycín, spektinomycín, sulfónamidy, tetracyklín a minocyklín. používa sa na liečenie alebo profylaxiu 11, 12 . Smrteľnosť neliečených infekcií, vysoko nákazlivý charakter pneumonického moru a potenciál Y. pestis ako biologickej zbrane spolu s výskytom kmeňov MDR dokazujú, že Y. pestis predstavuje veľké riziko pre verejné zdravie a potrebu pre nové antimikrobiálne látky na liečbu kmeňov rezistentných na liečivá.

Biosyntéza mastných kyselín typu II (FASII) baktérií, vyžadovaná mnohými baktériami pre syntézu esenciálnych lipoproteínov, fosfolipidov a lipopolysacharidov, je atraktívnym cieľom pre objavovanie liečiv. Na rozdiel od komplexu syntázy mastných kyselín cicavcov typu I (FASI) s viacerými doménami, je každá reakcia dráhy FASII katalyzovaná diskrétnym enzýmom (pozri Zhang a kol . 13, Cronan a Thomas 14 a Parsons a Rock 15 pre komplexné recenzie). Syntázy P-ketoacyl-acylového nosičového proteínu (ACP), FabB, FabF a FabH, katalyzujú Claisenovu kondenzáciu mastných acyltioesterov a malonyl-ACP za vzniku medziproduktu p-ketoacyl-ACP predlženého dvoma atómami uhlíka. Počiatočný cyklus predĺženia je katalyzovaný pomocou FabH, zahŕňajúci kondenzáciu malonyl-ACP a acetyl-CoA, zatiaľ čo následné cykly predĺženia sú uskutočňované pomocou FabB alebo FabF. Je zaujímavé, že zatiaľ čo FabB a FabF majú prekrývajúce sa substrátové špecificity, zdá sa, že FabB je potrebný v Escherichia coli na predĺženie 10-uhlíkového nenasýteného medziproduktu cis -3-decenoyl-ACP vytvoreného pomocou FabA, kľúčovú úlohu pri syntéze nenasýtených mastných kyselín, s E. coli. FabF nie je schopný vykonať túto reakciu. Na druhej strane sa zdá, že FabF je potrebný na tepelnú reguláciu tekutosti membrány a na predĺženie palmitoleátu (C16: 1) na cis- vakcinát (C18: 1). Enzýmy FabF z baktérií, ktoré nemajú homológ FabB, sú však schopné plniť úlohu FabB, čo znamená, že vývoj týchto enzýmov zahŕňa obe aktivity 16, 17, 18 .

Napriek katalyzácii rôznych reakcií dráhy FASII, všetky FabB, FabF a FabH zdieľajú podobnú architektúru aktívneho miesta a reakčný mechanizmus. Aktívne miesto všetkých troch enzýmov pozostáva z katalytickej triády sústredenej okolo cysteínového zvyšku, pričom enzýmy FabB a FabF majú katalytickú triádu Cys / His / His 19, 20, zatiaľ čo FabH má katalytickú triádu Cys / His / Asn 21, 22 . Dôležité je, že tieto štrukturálne podobnosti môžu umožniť navrhnutie nových antimikrobiálnych látok schopných súčasne zacieľovať na viac ß-ketoacyl-AKT syntáz, ako bolo pozorované pri platencíne, platensimycíne a tiolaktomycíne, o ktorých bolo preukázané, že inhibujú kondenzačné enzýmy FASII E. coli. , Mycobacterium tuberculosis a Staphylococcus aureus s rôznymi stupňami úspechu 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 . Ukázalo sa tiež, že cerulenín inhibuje enzýmy FabB a FabF, ale je slabým inhibítorom FabH 23, 29, 31, 32 . Inhibítor zameraný súčasne na všetky tri p-ketoacyl-AKT syntázy by účinne eliminoval syntézu mastných kyselín nevyhnutnú pre rast a prežitie.

Tu opisujeme kryštalické štruktúry β-ketoacyl-ACP syntáz Yersinia pestis FabF a FabH a porovnávame ich s nepublikovanou deponovanou štruktúrou FabB, ktorá predstavuje tri sľubné ciele pre vývoj nových antimikrobiálnych látok na boj proti kmeňom MDR Y. pestis .

Materiály a metódy

klonovanie

Gény kódujúce Yp FabF (prístupové č. YP_002346612.1) a Yp FabH (prístupové č. YP_002346608.1) sa amplifikovali z genómovej DNA pomocou PCR s použitím HotStarTaq PCR Master Mix (Qiagen) a klonovali sa do expresného vektora pMCSG21, kódujúceho N - terminálna hexahistidínová značka s miestom štiepenia proteázy vírusu tabakového etchového vírusu (TEV) proteázou prostredníctvom klonovania nezávislého od ligácie, ako je opísané skôr 33, 34 .

Vyjadrenie a čistenie

Rekombinantné Yp FabH a Yp FabF sa exprimovali ako fúzne proteíny značené His v bunkách E. coli BL21 (DE3) pLysS. Stručne, 5 ml média Luria-Bertani (LB) doplneného spektinomycínom (100 μg ml -1 ) a chloramfenikolom (34 μg ml -1 ) sa naočkovalo a inkubovalo sa cez noc pri 310 K a 220 ot.min -1 . Táto kultúra sa použila na naočkovanie autoindukčného média (Studier, 2005) obsahujúceho spektinomycín (100 μg ml -1 ) a chloramfenikol (34 μg ml -1 ), ktoré sa inkubovali cez noc pri ~ 298, 15 K a 90 ot min -1 . Bunky boli zozbierané centrifugáciou a resuspendované v His pufri A (50 mM fosfátový pufor pH 8, 0, 300 mM NaCI, 20 mM imidazol). Proteíny His-značené boli purifikované afinitnou chromatografiou (kolóna HisTrap HP, GE Healthcare), neviazané proteíny boli odstránené extenzívnym premytím His tlmivým roztokom A a rekombinantný proteín bol eluovaný pomocou zvyšujúceho sa koncentračného gradientu His tlmivého roztoku B (50 mM fosfátový tlmivý roztok) pH 8, 0, 300 mM NaCI, 500 mM imidazol). Po elúcii proteínu sa frakcie obsahujúce rekombinantný Yp FabF alebo Yp FabH inkubovali s TEV proteázou (~ 0, 1 mg ml- 1 ) počas 14 hodín pri -277 K, aby sa štiepil His-tag. Cieľové proteíny boli ďalej purifikované pomocou vylučovacej chromatografie (kolóna S-200, GE Healthcare) a eluované v 50 mM Tris pH 8, 0, 125 mM NaCI. Frakcie obsahujúce purifikovaný proteín boli koncentrované pomocou ultracentrifugálneho zariadenia Amicon (Millipore) s medznou molekulovou hmotnosťou 10 kDa. Koncentrované proteíny boli vyhodnotené pomocou SDS-PAGE ako čisté> 90% a skladované pri 193, 15 K.

kryštalizácie

Počiatočné kryštalizačné obrazovky sa uskutočňovali s použitím radu komerčne dostupných kryštalických obrazoviek (Crystal Screen, Crystal Screen 2, PEG / ION a PEG / ION 2 od Hampton Research; PACT Premier a Proplex od Molecular Dimensions). Kryštálové obrazovky sa uskutočňovali na 48-jamkových doštičkách VDX (Hampton Research) technikou difúzie parných kvapiek pomocou 1, 5 μl rekombinantného roztoku Yp FabH alebo Yp FabF kombinovaného s 1, 5 μl zásobného roztoku, suspendovali sa nad 300 μl rezervného roztoku a inkubovali sa pri 296 K.

Kryštály Yp FabH z peria sa pozorovali v podmienkach Hampton Research Crystal Screen 41 (10% propan-2-ol, 0, 1 M HEPES sodná soľ pH 7, 5, 20% PEG4000). Kryštály Yp FabF sa získali vo viacerých podmienkach z premývacej kryštalizačnej obrazovky Molecular Dimensions PACT (podmienky 19, 20, 21, 32, 33, 43). Na získanie kryštálov s jednoduchou difrakciou boli kryštalizačné podmienky optimalizované okolo rôznych molekulových hmotností a koncentrácií PEG a meniacimi sa koncentráciami solí a prísad. Difrakčná kvalita Yp FabH kryštály sa vytvorili v 10% propan-2-ole, 0, 1 M sodnej soli HEPES, pH 7, 5, 15% glycerole, 24% PEG4000, s použitím proteínovej koncentrácie 20 mg ml- 1 . Acetylované Yp FabH kryštály boli vyrobené kokryštalizáciou s acetyl-CoA v molárnom pomere ~ 5 molov acetyl-CoA a ~ 5 molov malonyl-CoA na jeden mól Yp FabH, použitím vyššie uvedených podmienok a koncentrácie proteínu. 10 mg ml- 1 . Difrakčná kvalita Yp FabF kryštály boli získané v 0, 2 M chloridu lítnom, 0, 1 M HEPES sodnej soli pH 7, 0, 24% PEG6000, s použitím proteínovej koncentrácie 21 mg ml- 1 .

Zber údajov a určenie štruktúry

Pred zberom údajov sa kryštály Yp FabH a Yp FabF kryoochránili v 20% glycerole a bleskovo sa ochladili v tekutom dusíku pri 100 K. Difrakčné údaje sa zbierali v austrálskom synchrotróne. Surové údaje sa indexovali a integrovali pomocou XDS ( Yp FabH / acetylovaný Yp FabH) 35 alebo iMosflm ( Yp FabF) 36 a škálovali sa v Aimless 37 zo súboru CCP4 38, 39 . Štruktúry Yp FabH a Yp FabF sa riešili molekulovou substitúciou s použitím Phaser 40 a monoméru E. coli FabH (PDB: 1HN9) a E. coli FabF (PDB: 1KAS) ako rešeršných modelov pre Yp FabH a Yp FabF. V Coot 41 sa uskutočňovali ďalšie kola budovania modelu a vylepšili sa pomocou Phenix 42 . Zhrnutie kryštalografických a zušľachťovacích štatistík pre ap- Yp FabH, acetylovaný Yp FabH a Yp FabF sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka v plnej veľkosti

Dokovacie simulácie, usporiadanie sekvencií a analýza proteínového rozhrania

Dokovanie platencínu, platensimycínu a tiolaktomycínu na Yp FabH sa uskutočňovalo pomocou webovej služby SwissDock (//www.swissdock.ch/) 43 . Zarovnania sekvencií FabH a FabF boli generované s použitím webových služieb T-Coffee (// tcoffee.crg.cat/) 44, 45 a ESPript (//espript.ibcp.fr/) 46 . Interakcie proteínov a interakcie monomérov a monomérov sa hodnotili pomocou služby proteínových rozhraní, povrchov a zostáv (PISA) v Európskom bioinformatickom inštitúte (//www.ebi.ac.uk/pdbe/prot_int/pistart.html) 47 .

Výsledky a diskusia

Difrakčné dáta a riešenie štruktúry

Yp FabH a Yp FabF boli klonované, rekombinantne exprimované ako fúzne proteíny značené 6xHis v E. coli , purifikované dvojstupňovým čistením zahŕňajúcim afinitnú a veľkosťovo vylučovaciu chromatografiu a kryštalizované. Yp FabH, acetylované Yp FabH a Yp FabF difrakčné dáta boli integrované pomocou XDS a iMosflm a škálované v Aimless na rozlíšenie 2, 20 Á, 1, 80 Á, respektíve 2, 70 Á.

Apo- Yp FabH kryštály vykazovali symetriu C222 1, s jednotkovými parametrami buniek a = 91, 35, b = 120, 02, c = 49, 30 Á, a bolo odhadnuté, že obsahujú jednu Yp FabH molekulu v asymetrickej jednotke, s obsahom rozpúšťadla 38, 5% a a Matthewsov koeficient 2, 00 Á 3 Da −1 . Acetylované kryštály Yp FabH vykazovali rovnakú symetriu ako kryštály apHP FabH a podobné rozmery jednotkových buniek (pozri tabuľku 1). Kryštály Yp FabF vykazovali symetriu P12 1 1, s parametrami jednotkovej bunky a = 74, 67, b = 63, 91, c = 89, 29 Á, a   = 90, p   = 107, 14, c   = 90 °. Na základe molekulovej hmotnosti 45 500 Da sa odhadovalo, že asymetrická jednotka obsahuje dve molekuly Yp FabF, s obsahom rozpúšťadla 45, 09% a Matthewsovým koeficientom 2, 24 Á 3 Da- 1 .

Kryštalické štruktúry Yp FabH a Yp FabF boli riešené molekulárnou náhradou s použitím monoméru E. coli FabH (PDB: 1HN9) a E. coli FabF (PDB: 1KAS) ako vyhľadávacích modelov. Konečná štruktúra ap- Yp FabH sa upravila na R prácu 17, 2% a R bez 22, 1%, acetylovaný Yp FabH na R prácu 14, 8% a R bez 17, 9% a Yp FabF na R prácu 19, 9 % a R bez 24, 5%.

Celková štruktúra Fab Yersinia pestis

Konečný model Yp FabH obsahuje monomér v asymetrickej jednotke s 10 a-helixmi a 14 p-vláknami. N-terminálne a C-terminálne polovice Yp FabH zdieľajú vysoký stupeň symetrie, pričom tieto dve polovice sú usporiadané tak, aby vytvorili tiolázový násobný motív charakteristický pre FASII kondenzujúce enzýmy 19, 20, 48 . Tiolázový záhyb sa skladá z dvoch päťvláknových zmiešaných p-listov lemovaných z oboch strán dvoma a-helixmi s topológiou a-β-α-β-a, v ktorých každé a predstavuje dve a-helixy a každé p predstavuje päťvláknové zmiešaný p-list (obr. 1). Na základe analýzy pomocou PISA sa predpovedá, že biologická jednotka Yp FabH je dimér, ktorý je konzistentný s tým, ktorý sa pozoroval v bakteriálnych homológoch. Dimérna zostava je spojená operátorom symetrie x, -y, -z, pričom dve podjednotky tvoria rozhranie diméru zahrabávajúce približne 15, 6% (~ 1 965 Á2) celkovej povrchovej plochy. Najrozsiahlejšie interakcie medzi monomérmi a monomérmi sa tvoria medzi ß5 každej podjednotky, ktorá usporiada antiparalelne, vytvára 10-vláknový ß-list, ktorý preklenuje dimér, a sieť vodíkových väzieb vytvorených medzi β5 a α5 (zvyšky 105 - 130). a ekvivalentné zvyšky opačného monoméru a helix a4, ktorý interaguje s p8, p9 a P10 (zvyšky 180 - 200) opačného monoméru (obr. 2A, B).

Image

(A ) Kreslené znázornenie Yp FabH ako diméru a monoméru pri rotácii 0 °, 90 ° a 180 ° okolo horizontálnej osi, pričom motív tiolázového záhybu je zvýraznený čiernym štvorcom. β-hárky sú zobrazené azúrovo, a-helixy sú zobrazené oranžovo. ( B ) Zarovnanie sekvencií Yp FabH s FabH z E. coli (PDB: 1HN9), M. tuberculosis (PDB: 1HZP), N. meningitidis (PDB: 4QAV), S. aureus (PDB: 2GQD) a T. thermophilus (PDB: 1J3N). Prísne konzervované zvyšky sú zvýraznené modrou farbou s bielym textom, podobné zvyšky sú zvýraznené azúrovo, zvyšky katalytickej trojice aktívneho miesta sú označené trojuholníkmi, zvyšok Phe303, o ktorom sa predpokladá, že hrá úlohu v substrátovej špecifickosti, je označený čiernou hviezdou, Vlastnosti sekundárnej štruktúry Yp FabH, vrátane a-helixov, p-listov a 3-10 helixov (n) sú zobrazené nad zarovnaním sekvencií čiernou farbou.

Obrázok v plnej veľkosti

Image

Charakteristiky sekundárnej štruktúry rozhrania diméru Yp FabH pri 0 ° (A) a 90 ° (B) rotácie okolo vertikálnej osi. Najvýznamnejšie interakcie dimérneho rozhrania Yp FabH sa vyskytujú medzi p5 a a5, ktoré sa zbalia proti svojim náprotivkom opačného monoméru, čím sa vytvorí 10-vláknový p-list, ktorý pokrýva dva monoméry, a a4, ktorý sa zbalí proti p8, P9, P10, a priľahlé oblasti slučky opačného monoméru. Rozhranie diméru Yp FabF pri 0 ° C a 90 ° (D) rotácie okolo vertikálnej osi. Najvýznamnejšie interakcie rozhrania diméru Yp FabF sa vyskytujú medzi reťazcom β5, skrutkovicou α7 a spojovacími slučkami (zvyšky ~ 160–180) každého monoméru, so skrutkovnicou α7 (zvyšky ~ 170–180) a vláknom β5 (zvyšky 157– 158) interakciu s touto slučkou a ich náprotivkami protiľahlého monoméru. Medzi a7 a a10 sa tvoria ďalšie interakcie; a4 a a6, ktoré ležia proti oblasti slučky spájajúcej p8 a a10 opačného monoméru, a a5, ktorý sa zbalí proti helixom a5 a a8 opačného monoméru. Zvyšky rozhraní sú zvýraznené červenou farbou, protichodné znaky sekundárnej štruktúry monoméru sú označené hviezdičkami (*).

Obrázok v plnej veľkosti

Celková štruktúra Fab Yersinia pestis

Rafinovaná štruktúra Yp FabF obsahuje dimér v asymetrickej jednotke, pričom monomér Yp FabF obsahuje 13 a-helixov a 14 p-vlákien (obr. 3). Podobne ako štruktúry Yp FabH a Yp FabB (PDB: 3OYT, Anderson a kol ., Nepublikované), základný motív Yp FabF obsahuje charakteristický násobok tiolázy, ktorý vykazuje rovnakú a-β-α-β-α topológiu, ako bola pozorovaná v Yp FabH. Okrem toho Yp FabF vykazuje podobný model dimerizácie, pričom vlákno p5 každého monoméru je usporiadané antiparalelne, avšak tieto p-vlákna nie sú umiestnené tak, aby tvorili súvislú 10-vláknovú P-fóliu, ako je pozorované v Yp FabH (obr. 3). ). Monoméry Yp FabF sú spojené dvojnásobnou kryštalografickou osou, pričom najvýznamnejšie interakcie sa vyskytujú medzi reťazcom ß5, helixom a7 a susednými oblasťami slučiek (zvyšky ~ 160 - 170) každého monoméru, so špirálou a7 (zvyšky ~ 170– 180) a vlákno P5 (zvyšky 157 až 158) interagujúce s touto slučkou a ich náprotivkami na protiľahlom monoméri. Medzi a7 a a10, a4 a a6 sa vytvárajú ďalšie interakcie, ktoré sa zbalia proti oblasti slučky spájajúcej p8 a a10 a a5, ktoré sa zbalia proti helixom a5 a a8 opačného monoméru. Celkovo toto dimérové ​​rozhranie ukladá približne 18% (~ 2 890 Á2) povrchovej plochy prístupnej pre rozpúšťadlo (obr. 2C, D).

Image

( A ) Kreslené znázornenie Yp FabF ako diméru a monoméru pri rotácii 0 °, 90 ° a 180 ° okolo horizontálnej osi, pričom motív tiolázového záhybu je zvýraznený čiernym štvorcom. P-listy sú zobrazené žltou farbou, a-helixy sú zobrazené azúrovo. ( B ) Zarovnanie sekvencií Yp FabF s FabF z E. coli (PDB: 2GDW), M. tuberculosis (PDB: 2GP6), N. meningitidis (PDB: 4QAV), S. pneumoniae (PDB: 2ALM), S. aureus. (PDB: 2GQD) a T. thermophilus (PDB: 1J3N). Prísne konzervované zvyšky sú zvýraznené modrou farbou s bielym textom, podobné zvyšky sú zvýraznené azúrovo, zvyšky katalytickej trojice aktívneho miesta sú označené trojuholníkmi, zvyšky Ile109 a Gly199, o ktorých sa predpokladá, že smerujú mastný acylový substrát, sú označené čiernymi kruhmi, zvyšok vrátnika Phe401 je označený čiernou hviezdou. Vlastnosti sekundárnej štruktúry Yp FabF, vrátane a-helixov, p-listov a 3-10 helixov (n) sú zobrazené nad zarovnaním sekvencií čiernou farbou.

Obrázok v plnej veľkosti

Aktívna architektúra lokalít Yersinia pestis FabH a FabF

Ako aktívne miesta, tak reakčné mechanizmy kondenzačných enzýmov FASII boli dobre charakterizované, s enzýmami FabB a FabF, ktoré majú Cys / His / His katalytickú triádu, a enzýmami FabH, ktoré majú katalytickú trojicu Cys / His / Asn. Na základe štrukturálnej homológie so súvisiacimi enzýmami Fab budú pravdepodobne mechanizmy reakcie Yp FabH a Yp FabF nasledovať dvojstupňový mechanizmus. Aktívne miesto cysteínu, Cys112 a Cys164 v Yp FabH (obr. 4) a Yp FabF (obr. 5), poháňané dipólovým okamihom, atakuje acylovú skupinu donora mastnej acylovej skupiny a prenáša acylovú skupinu na enzým. Naviazaná donorová mastná acylová molekula je nahradená a prijímajúca molekula alebo mastný acyltioester, ktorý sa má predĺžiť, sa viaže, čím sa iniciuje prenos acylovej skupiny z kondenzujúceho enzýmu na príjemcu. Zvyšné zvyšky katalytickej triády, His243 a Asn273 z Yp FabH (obr. 4) a His304 a His341 z Yp FabF (obr. 5) sa považujú za stabilizátory mastného acylového medziproduktu počas prechodných stavov 20, 22, 49 .

Image

(A) Superpozícia CoA (zelená) z E. coli FabH (PDB: 1HND) na Yp FabH. Arg151 z Yp FabH sa zráža s adenínovým kruhom CoA a pravdepodobne prijíma konformáciu podobnú tej, ktorá bola pozorovaná v E. coli (azúrová) na umiestnenie substrátu. (B) Superpozícia CoA (zelená) tiež ukazuje fosfopantetínové rameno CoA predlžujúce dĺžku väzobného vrecka Yp FabH na dosiahnutie aktívneho miesta cysteínu. ( C ) Dokovanie platencínu (zelená) a platensimycínu (fialová) na Yp FabH naznačuje vysoko podobné väzobné miesto ako v homológoch FabF (PDB: 3HO2, žltá; PDB: 3HNZ, modrá). (D ) Superpozícia tiolaktomycínu naviazaného na FabB (PDB: 1FJ4, purpurová) a homológu Mycobacterium (PDB: 2WGE, azúrová) ukazuje, že konformácia inhibítora je nekompatibilná s väzobným vreckom Yp FabH. Ukotvenie tiolaktomycínu (svetlo modrá) na Yp FabH naznačuje, že inhibítor sa otáča približne o 90 °, pričom cyklický motív si udržuje podobné miesto v rámci aktívneho miesta.

Obrázok v plnej veľkosti

Image

( A ) Superpozícia predpokladaných aktívnych miest Yp FabH (oranžová), Yp FabF (azúrová) a Yp FabB (purpurová). ( B ) Superpozícia cerulenínu (PDB: 1B3N, striebro), platencínu (PDB: 3HO2, žltá), platensimycínu (PDB: 3HNZ, modrá) a tiolaktomycínu (PDB: 1FJ4, zelená) z bakteriálnych homológov FabF / FabB do aktívnej látky miesta Yp FabB (purpurová) a Yp FabF (azúrová) neodhalili žiadne stérické zrážky alebo modifikácie, ktoré by zabránili inhibícii, s výnimkou Phe401, o ktorom sa predpokladá, že sa po väzbe so substrátom alebo inhibítorom zmení na otvorenú konformáciu. ( C ) Superpozícia E. coli FabB (PDB: 1FJ8, striebro) a FabF (PDB: 1B3N, zelená) vykazujúca odlišné konformácie acylového reťazca a zvyšky Ile108 z FabF (azúrová) a Met198 z FabB (purpurová) ), ktoré riadia acylový reťazec inhibítora (azúrový zvyšok pôsobí na zelený inhibítor, purpurový zvyšok pôsobí na inhibítor striebra) a prípadne mastné acylové substráty. ( D ) Pohľad zvnútra Yp FabF ukazujúci prístup k časti kapsy na viazanie substrátu Yp FabF (azúrový) je pomocou Phe401 uzavretý. Konformácia Phe401 v FabF / FabB štruktúrach viazaných na cerulenín (PDB: 1FJ8, striebro), platencín (PDB: 3HO2, svetlo modrá), platensimycín (PDB 3HNZ, modrá) a tiolaktomycín (PDB: 1FJ4, zelená) úzko napodobňujú, že FabF v komplexe s lauroyl-CoA (PDB: 2GFY, žltá). Superpozícia aktívnych miest pre Yp FabB (purpurová), Yp FabF (azúrová) a N. meningitidis FabF (PDB: 4QAV, tmavomodrá) a cerulenín z Fabulínu E. coli FabB (PDB: 1FJ8, striebro) a FabF (PDB: 1B3N, zelené) štruktúry pri rotácii 0 ° ( E ) a 90 ° ( F ) okolo vertikálnej osi. Zvyšky aj povrch aktívnych miest Yp FabB a Yp FabF a vrecká na viazanie substrátu sú veľmi podobné. Zdá sa, že jediným významným rozdielom je nahradenie Ile109 a Gly199 (Ile108 a Gly199 v E. coli ) FabF, s Gly108 a Met198 z FabB (purpurová) a zvyšky 138 - 140 oboch enzýmov, bez zjavných rozdielov medzi Yp. FabF a FabF z N. meningitidis , ktorý nemá homológ FabB . Yp FabF zvyšky označené hviezdičkami (*), Yp FabB a zvyšky spoločné pre Yp FabB aj Yp FabF nie sú označené.

Obrázok v plnej veľkosti

Poradie viazania substrátu, a teda reakčné poradie v FabF a FabB sa považuje za kontrolované zvyškom Phe401 ( Yp FabF číslovanie), ktorý pôsobí ako „vrátnik“, otáčajúci sa po acylácii cysteínu na aktívnom mieste, aby sa rozšírila kapsa viazania substrátu a umožnilo sa mastný acyltioester, malonyl-ACP, ktorý má byť predĺžený (Obr. 5D) 20, 49 . Zatiaľ čo ako FabB, tak FabF obsahujú podobné zvyšky fenylalanínu „gatekeeper“ na aktívnom mieste, nie sú známe štruktúrne prvky, ktoré spôsobujú rozdielne substrátové špecificity FabB a FabF. Na základe kontroly FabB a FabF štruktúr E. coli v komplexe s cerulenínom, Price, et al . 23 naznačujú, že Gly107 a Met197 z E. coli FabB (Gly108 a Met198 z Yp FabB) nasmerujú koniec acylového reťazca k vláknu P4, zatiaľ čo ekvivalentné zvyšky v E. coli FabF, Ile108 a Gly198 (Ile109 a Gly199 z Yp FabF ), nasmerujte koniec acylového reťazca od p4. Preto sa predpokladá, že Gly107 / Ile108 a Met198 / Gly199 vyvolávajú väzbové vreckové konformácie vhodné pre zalomenú štruktúru nenasýteného medziproduktu cis -3-decenoyl-ACP predĺženého pomocou FabB (obr. 5C, E, F). Zvyšky Gly107 / Ile108 a Met198 / Gly199 sú konzervované v Yp FabB a Yp FabF, ale Ile108 je tiež konzervovaný v FabF enzýmoch Neisseria meningitidis, S. aureus a Streptococcus pneumoniae , ktoré nemajú FabB homológy a spoliehajú sa na FabF ako jediný predlžujúci enzým. Gly199 je tiež konzervovaný v N. meningitidis , zatiaľ čo tento zvyšok je nahradený alanínom v S. aureus a S. pneumoniae . To, že Ile108 a Gly198 sú konzervované alebo nahradené podobným zvyškom v enzýmoch FabF, ktoré nahradia úlohu FabB, naznačuje, že zvyšky Gly107 / Ile108 alebo Met198 / Gly199 nezodpovedajú výlučne za neschopnosť E. coli FabF predlžovať nenasýtenú cis dvojitú väzba obsahujúca medziprodukty produkované FabA.

Navrhlo sa, že molekulárny základ pre špecifickosť substrátu FabH vychádza z rôznych rotamérových konformácií vo vnútri kapsy na viazanie substrátu. Gajiwala a kol . 50 navrhuje, aby rôzne konformácie rotaméru namiesto substitúcií alebo inzercií aminokyselín pozorovaných vo väzbovej kapse enzýmov FabH zodpovedali za rôzne substrátové špecificity FabH, pričom enzýmy, ktoré využívajú mastné kyseliny s rozvetveným reťazcom, majú konzervatívnu rotamérovú konformáciu, ktorá je ekvivalentná konformácii Phe298 v S aureus FabH, Phe312 v Enterococcus faecalis FabH a Tyr304 v M. tuberculosis FabH (Obr. 1B), kde sa aromatický kruh Phe / Tyr otáča smerom dovnútra smerom k aktívnemu miestu, čo spôsobuje zníženie veľkosti hydrofóbnej kapsy. Rotácia ekvivalentného zvyšku v Yp FabH (Phe303) sa odvráti od aktívneho miesta napodobňujúceho to E. coli , čo by naznačovalo podobnú substrátovú špecificitu ako v E. coli FabH. Relevantnosť úlohy tejto rotamérovej konformácie v špecifickosti Yp FabH substrátu, ak vôbec, ešte nebola stanovená.

Aby sme ďalej charakterizovali interakcie aktívneho miesta a substrátu Yp FabH, pokúsili sme sa kokryštalizovať Yp FabH s acetyl-CoA. Na rozdiel od štruktúry ApHP FabH je cysteín aktívneho miesta (Cys112) tohto komplexu acetylovaný, pričom v štruktúre nie je viditeľná žiadna CoA fosfopantetínová skupina. Na základe porovnania so štruktúrami E. coli FabH v komplexe s CoA (PDB: 1HND, 1HNH) sa zdá, že neprítomnosť CoA v našej acetylovanej Yp FabH štruktúre je spôsobená zhustením kryštálov, pričom kryštálové kontakty sa prekrývajú s 3'- fosforečnan ribózy a ribózová skupina CoA, čo naznačuje prvý stupeň reakcie, a molekula CoA sa vytesnila z väzobného vrecka v očakávaní mastného acylového príjemcu pred kryštalizáciou. Napriek acetylácii cysteínu v aktívnom mieste sa zdá, že aktívne miesto je do značnej miery nezmenené, nie sú pozorované žiadne zjavné konformačné zmeny a keďže CoA fosfopantetínová skupina chýba, nie je možné určiť interakcie medzi týmto enzýmom a substrátom. Avšak superpozícia CoA viazaných E. coli FabH štruktúr (PDB: 1HND, 1HNH) na štruktúru Yp FabH (Obr. 4A, B) naznačuje, že fosfopantetínová skupina CoA je stabilizovaná vodíkovými väzbami s Arg36, Asn209 a Asn246, zatiaľ čo sa zdá, že adenínová skupina tvorí vodíkovú väzbu s Thr28 a aromatické stohovacie interakcie s Trp32. Superpozícia týchto modelov tiež naznačuje, že Arg151, ktorý sa zráža s adenínovou časťou CoA, sa pohybuje tak, aby vyhovoval substrátu, s adenínovým kruhom usporiadaným medzi Trp32 a Arg151 rovinným spôsobom (obr. 4A, B).

Potenciálne inhibičné interakcie cerulenínu, platencínu, platensimycínu a tiolaktomycínu s Yersinia pestis FabB, FabF a FabH

Napriek relatívne nízkej sekvenčnej identite (~ 30 - 40%) sú celkové štruktúry Yp FabB, Yp FabF a Yp FabH veľmi podobné (obr. 5A, B), s RMSD ~ 2, 3 Á nad ~ 240 zvyškov medzi Yp FabB a Yp FabF a Yp FabH a RMSD 1, 24 Á cez 388 zvyškov medzi Yp FabB a Yp FabF. Štrukturálna podobnosť týchto enzýmov sa rozširuje na ich aktívne miesta, pričom sa ukázalo, že inhibítory cerulenín, platencín, platensimycín a tiolaktomycín inhibujú viac kondenzujúcich enzýmov FASII 23, 24, 25. Dokovanie platencínu, platensimycínu a tiolaktomycínu na ap- Yp FabH (obr. 4C, D) odhaľuje podobné konformácie ako tie pozorované v kryštálových štruktúrach Fab coli E. coli naviazaných na tieto inhibítory (obr. 5B), zdá sa však, že tiolaktomycín rotuje. aby sa zabránilo stérickým zrážkam so zvyškami aktívneho miesta. Predpokladá sa, že cerulenín, platencín, platensimycín a tiolaktomycín napodobňujú mastný acyltioesterový substrát kondenzačných enzýmov FASII. To je do istej miery zrejmé rotáciou Fabf / FabB zvyšku „gatekeeper“ Phe401 v komplexoch naviazaných na inhibítor na konformáciu ekvivalentnú konformácii pozorovanej v štruktúre FabF E. coli naviazanej na lauroyl-CoA (obr. 5D).

Zatiaľ čo platencín, platensimycín a tiolaktomycín všetky inhibujú FabH, tak platensimycín, ako aj tiolaktomycín inhibujú FabH slabo (hodnoty IC50 67 uM a ~ 100 uM) a cerulenín vykazuje malú až žiadnu inhibíciu FabH. Platencín vykazuje asi 4-násobne vyššiu inhibičnú aktivitu (IC50   = 16, 2 μM) v porovnaní s platensimycínom 23, 24, 25, 51, s dokovaním platencínu a platensimycínu do aktívneho miesta Yp FabF a Yp FabH, čo ukazuje, že terminálne karboxylové kyseliny platencínu a platensimycínu tvoria vodíkové väzby so zvyškami His243 a Asn273 z Yp FabH a His304 a His341 Yp FabF. To je v súlade s dokovacími štúdiami E. coli FabH, ktoré uskutočnili Jayasuriya a kol . 52, ktorí naznačujú, že rozdiel v inhibičnej aktivite medzi platencínom a platensimycínom je spôsobený interakciami medzi FabH a ketolidovými motívmi týchto inhibítorov. Nepolárne zvyšky Ile155, Ile156 a Trp32, umiestnené pri vstupe do väzobného miesta E. coli FabH, obklopujú atóm polárneho éteru kyslíka pentacyklického ketolidového motívu platensimycínu. V Yp FabH je podobné prostredie tvorené zvyškami Ile154, Ile155, Leu156 a Trp32. Éterový kyslík platensimycínu v našich dokovaných modeloch leží blízko nepolárnych zvyškov Met206 a Gly208 (obr. 6), avšak tu uvádzané konformácie a tie, ktoré navrhol Jayasuriya a kol . 52 naznačujú nepriaznivé interakcie. Na rozdiel od platensimycínu nemá tetracyklický ketolid platencínu polárny atóm kyslíka, čo mu umožňuje vytvárať priaznivé hydrofóbne interakcie so zvyškami Trp32, Ile154, Ile155 a Leu156 alebo Met206, Ala207 a Gly208 (obr. 6G, H).

Image

2D reprezentácie interakcií medzi platensimycínom a E. coli FabF ( A ) a interakcií platensimycínu zakotveného v Yp FabH ( B ) naznačujú, že medzi platensimycínom a Yp FabH sa vytvorí podstatne menej väzieb v porovnaní s väzbami E. coli FabF (PDB: 2GFX), and the non-polar residues Met206 and Gly208, which may repel the ether oxygen in the ketolide moiety of platensimycin. Hydrogen bonds are represented by green dashed lines, hydrophobic contacts are shown as red circular arcs. ( C ) A 3D diagram of the interactions between platensimycin and Yp FabH identified in Fig. 6B, showing potential hydrogen bonds (blue lines) and hydrophobic interactions (silver clouds). 2D representations of the interactions between thiolactomycin and E. coli FabB (PDB:1FJ4) ( D ), and that of thiolactomycin docked to Y pFabH ( E ), suggests the rotation of thiolactomycin to fit into the Yp FabH binding pocket, and the loss of dual histidine residues in the catalytic triad reduces the number of bonds which would stabilise thiolactomycin when bound to Yp FabH, compared to E. coli FabB/FabF. ( F ) A 3D diagram of the interactions between thiolactomycin and Yp FabH identified in Fig. 6E, showing potential hydrogen bonds (blue lines) and hydrophobic interactions (silver clouds). ( G ) A cut-away view of the Yp FabH (orange) active site surface showing residues that may interact with platencin (green), platensimycin (purple), and thiolactomycin (light blue). ( H ) Superposition of cerulenin (PDB:1FJ8, silver) into the active site of Yp FabH suggests the active site is too small to accommodate the inhibitor, which may partially account for the poor inhibition of FabH exhibited by cerulenin. ( I ) Superposition of Yp FabH (orange), Yp FabF (cyan), and cerulenin from cerulenin bound E. coli FabB (PDB:1FJ8, silver) and FabF (PDB:1B3N, green) structures suggests that the Yp FabH substrate binding pocket is shorter than that of Yp FabF, at least partly due to hydrophobic residues that lie near the catalytic triad, thus any future drug design efforts should accommodate for the differences in depth between the substrate binding pockets of FabB, FabF and FabH 2D representations were generated using LigPlot + 55 .

Obrázok v plnej veľkosti

The weak inhibitory activity of thiolactomycin and cerulenin against FabH, compared to that against FabF and FabB, is believed to stem from differences in the catalytic triad of these enzymes, with mutation of the Cys/His/His triad of E. coli FabB to a Cys/His/Asn triad similar to that observed in FabH shown to reduce the sensitivity of FabB to cerulenin by 10 fold and thiolactomycin by 14 fold 23 . Furthermore, the rotation of thiolactomycin to avoid steric clashes with the FabH active site, as evident in our docked model, may reduce the number of residues able to bind the inhibitor (Fig. 6D, F). Additionally, the substrate binding pockets of E. coli and S. aureus FabH enzymes are too short to accommodate the acyl chain of cerulenin, resulting in unfavourable steric clashes 23, 29 (Fig. 6H, I).

While cerulenin, platencin, platensimycin, and thiolactomycin have been shown to inhibit the FASII condensing enzymes, these molecules are not necessarily well suited for use as antimicrobials, with cerulenin, platensimycin, and thiolactomycin analogues also shown to inhibit the mammalian fatty acid synthase complex 23, 53, 54 . However, the use of these molecules as lead compounds for structure based drug design has the potential to yield new antimicrobials to combat MDR Y. pestis .

Ďalšie informácie

How to cite this article : Nanson, JD et al . Structural Characterisation of the Beta-Ketoacyl-Acyl Carrier Protein Synthases, FabF and FabH, of Yersinia pestis . Sci. Rep . 5, 14797; doi: 10.1038/srep14797 (2015).

Komentáre

Odoslaním komentára súhlasíte s tým, že budete dodržiavať naše zmluvné podmienky a pokyny pre komunitu. Ak zistíte, že je niečo urážlivé alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte ho ako nevhodné.