Niektoré aspekty korelácie chemického posunu / štruktúry nmr v štruktúrnej charakterizácii polymérov a biopolymérov polymérový denník

Niektoré aspekty korelácie chemického posunu / štruktúry nmr v štruktúrnej charakterizácii polymérov a biopolymérov polymérový denník

Anonim

predmety

  • biopolyméry
  • NMR spektroskopia
  • Charakterizácia polyméru

abstraktné

Preskúmali sa štúdie metodológie NMR na charakterizáciu štruktúry polymérov a biopolymérov založené na pochopení korelácie chemického posunu / štruktúry NMR pomocou experimentov NMR v roztoku a v tuhom skupenstve, vývoja teórie chemického posunu NMR a ich kombinácie.,

Hlavné

Prvé pozorovanie, podľa najlepších poznatkov, vysokorozlišovacieho 17, 735-MHz1H NMR spektra nevytvrdenej gumy Heva v roztoku CS2 uskutočnil v roku 1957 Gutowsky a kol. , 1, ktorý pozoroval signály CH3, CH2 a CH, aby sa objavili samostatne v rôznych pozíciách chemického posunu. Ukázalo sa, že chemický posun NMR poskytuje informácie o chemickej štruktúre polymérov a môže sa účinne použiť pri analýze chemickej štruktúry a pri analýze organických zlúčenín. 1, 2 Ďalej, v roku 1960, Bovey a Tiers, 3 Nishioka a kol. 4 a Johnsen a Tessmar 5 nezávisle uviedli veľmi dôležitý objav pre vedu o polyméroch: a- CH3 signály v1H NMR spektre poly (metylmetakrylátov) s rôznymi taktikami v roztoku chloroformu sa objavujú v rôznych pozíciách chemického posunu, v ktorých tri štiepiace signály sa priradili k trojici rr , mr a mm z horného poľa na základe sofistikovaných a primeraných experimentov, kde m a r sú mezo a racemické dyady. Od tej doby bola NMR spektroskopia považovaná za najúčinnejšiu dostupnú metódu na charakterizáciu štruktúr polymérov. To znamená, že chemický posun (chemické tienenie), ako jeden z dôležitých parametrov NMR6, sa môže zmysluplne použiť na štruktúrnu charakterizáciu polymérov.

S takýmto základom sa ako jeden z našich výskumných programov realizovalo sofistikované porozumenie a vývoj korelácie chemického posunu / štruktúry NMR pre štruktúrnu charakterizáciu polymérov a biopolymérov. V tomto prehľade autor a jeho kolegovia ukazujú, že pochopenie korelácie chemického posunu / štruktúry NMR poskytuje výkonnú metodológiu štruktúrnej charakterizácie polymérov a biopolymérov založenú na sofistikovanom vývoji experimentov NMR v roztoku a v tuhom stave, vývoj teórie chemického posunu NMR a ich kombinácie. 7, 8

Koncept korelácie chemického posunu / štruktúry NMR

Polymérny reťazec má obrovské množstvo chemických väzieb. V stave roztoku sú chemické posuny polymérov NMR vo všeobecnosti priemernými hodnotami pre všetky možné konformácie z dôvodu rýchlych interkonverzií rotáciou okolo chemických väzieb. Avšak v tuhých látkach sú chemické posuny často charakteristické pre špecifické konformácie kvôli silne obmedzenej rotácii okolo väzieb. 7, 8 Chemický posun NMR je ovplyvnený zmenou v elektronickej štruktúre spôsobenou zmenou konformácie. Chemické posuny NMR v tuhom stave preto poskytujú užitočné informácie o elektronickej štruktúre polymérneho reťazca a viacerých polymérnych reťazcov s pevnou štruktúrou. Ďalej je možné často určiť úplné tenzorové zložky chemického posunu, pretože chemický posun je v zásade druhostupňové množstvo tenzora. Kompletné tenzorové zložky chemického posunu (anizotropia chemického posunu) polymérov a biopolymérov poskytujú informácie o lokálnej symetrii elektrónového oblaku okolo jadra, a preto poskytujú oveľa podrobnejšie znalosti o konformácii spojenej s elektronickou štruktúrou v porovnaní s priemerovanou chemikáliou. posunúť. Na úplné pochopenie korelácie chemického posunu / štruktúry polymérov a biopolymérov NMR bol zavedený sofistikovaný prístup, ktorý kombinuje NMR experimenty v roztoku a v tuhom stave a teóriu chemického posunu NMR.

Stručný popis chemického posunu NMR

Chemické posuny atómov v polymérnom reťazci alebo vo viacerých polymérnych reťazcoch vrátane biopolymérov závisia od elektronického a molekulárneho prostredia jadier. Chemický posun pre atóm A ( σ A ) sa dá presne odhadnúť ako súčet nasledujúcich výrazov podľa teórie chemického posunu. 9, 10, 11, 12, 13

Image

kde σ d a σ p sú diamagnetický člen a paramagnetický člen. V prípade jadier s elektrónmi 2 p , ako je 13C, 15N, 17O atď., Sa tu uvažuje relatívny chemický posun prevažne paramagnetickým termínom. 6, 7, 8 V prípade 1 H chemického posunu sa k rovnici (1) pridá ďalší výraz σ ′, ktorý môže vyplývať z významných príspevkov k chemickému posunu od účinku magnetickej anizotropie, polárneho účinku a kruhového prúdu účinok. Tu je potrebné poznamenať, že symbol σ sa používa na vypočítaný chemický posun, symbol δ sa používa na experimentálny chemický posun a že kladné znamienko pre σ znamená tienenie a kladné znamenie pre ô značí odtienenie.

Predtým, ako sa opíšu podrobnosti protokolu na vyhodnotenie diamagnetických a paramagnetických príspevkov, je potrebné poznamenať, že vo vzorke izotropnej kvapaliny alebo roztoku je chemický posun NMR σ pozorovaný ako skalárne množstvo σ iso, izotropný chemický posun v dôsledku rýchleho omieľanie molekúl a polymérov. Avšak v tuhých alebo orientovaných molekulách a polyméroch (ako sú kvapalné kryštalické alebo monokryštalické vzorky) chemický posun nie je izotropným parametrom, ale tenzorom druhej triedy. Zložky tenzora chemického posunu v týchto vzorkách môžu byť špecifikované ako ij, kde i, j = x, y alebo z v referenčnom rámci fixovanom na jadre v molekule a polyméri. Pozorovanie zložiek tenzora chemického posunu teda v zásade vedie k plodnejším informáciám o štruktúre v porovnaní s pozorovaním σ iso . Experiment s magickým uhlom odstreďovania (MAS) tuhej látky poskytuje σ iso ako izotropný priemer troch hlavných komponentov tenzora, ako je dané ( σ 11 + σ 22 + σ 33 ) / 3. Šírka čiary NMR signálu je preto veľmi úzka.

Tu sa zaoberáme protokolom na vyhodnotenie diamagnetického pojmu σd αβ a paramagnetického pojmu σp αβ pre malé alebo stredne veľké modelové molekuly polymérov a biopolymérov. Vlnová funkcia ψ m pre elektrón m je vyjadrená ako

Image

a

Image

použitím metódy sčítacích stavov (SOS) 6, kde indexy a a β označujú karteziánske zložky (x, y, z), μ 0 je priepustnosť voľného priestoru, m e je hmotnosť elektrónu a L α je operátor orbitálneho momentu hybnosti.

Image

a

Image

sú súčtom obsadených a neobsadených molekulárnych orbitálov. Termín ( 1 E n m - 1 E 0 ) je elektronická singlet-singletová excitačná energia od m- tého do n- tého orbitálu.

Dva prístupy pre výpočty chemického posunu NMR polymérov a biopolymérov

Boli vyvinuté dva sofistikované prístupy na výpočet chemického posunu polymérov a biopolymérov NMR, aby sa pochopila korelácia chemického posunu / štruktúry NMR. Prvý prístup (1) je pre polyméry a biopolyméry v roztoku. Jeden polymérny reťazec v roztoku môže mať obrovské množstvo konformačných konfigurácií kvôli rýchlej rotácii okolo chemických väzieb. Ak je teda rotácia okolo väzieb veľmi rýchla v časovom harmonograme NMR, pozoruje sa chemický posun pre ktorýkoľvek špecifikovaný atóm A ako priemerný pre možné výhodné konformácie ( A < A ' ). 〈 Σ A 〉 je uvedené ako

Image

, kde číselné indexy odkazujú na výhodné konformácie a P i a σ i sú pravdepodobnosť výskytu a chemický posun uprednostňovanej konformácie i . V prístupe (1) modelovajte molekuly, ako sú diméry, triméry atď. sa používajú ako lokálne štruktúry polymérnych reťazcov a informácie o konformačnej konfigurácii polymérneho reťazca v roztoku boli získané kombináciou teórie chemického posunu a štatistickej mechaniky polyméru. Takýto prístup bol starostlivo aplikovaný na charakterizáciu stereochemických štruktúr niektorých polymérnych systémov v stave roztoku. 7, 8 Napríklad stereochemická štruktúra (ako je dyad, triáda a tetrad taktika) poly (vinylchloridu) bola úspešne charakterizovaná pozorovaním1H a13C NMR spektier v roztoku a výpočtom chemického posunu pomocou prístupu (1), 14, 15, 16 Tento prístup ďalej viedol k zavedeniu použitia mapy chemického posunu (obrysu) na charakterizáciu štruktúry druhého poriadku polypeptidov a použitia štruktúry viazanej na vodík na analýzu rôznych typov aminokyselinových zvyškov peptidov a polypeptidov. Malo by sa uznať, že výpočty chemického posunu na modelových molekulách nie sú vždy ľahko aplikovateľné na polyméry v kryštalickom stave z dôvodu existencie interchainových a interchainových interakcií na veľké vzdialenosti. Elektróny sú v malých molekulách obmedzené na konečnú oblasť vesmíru, zatiaľ čo to nie je nevyhnutne prípad polymérov, a preto je potrebný iný prístup. Druhým prístupom (2) je použitie teórie pevne sa viažucich molekulárnych orbitálov (TB MO), ktorá je dobre známa v oblasti fyziky tuhých látok, na opis elektronických štruktúr lineárnych polymérov s periodickou štruktúrou v rámci lineárna kombinácia aproximácie atómových orbitálov pre elektronické vlastné funkcie. 17, 18, 19 Teória chemického posunu bola teda kombinovaná s teóriou TB MO, ktorá môže brať do úvahy interakcie medzi reťazcami vnútri reťazca a medzi reťazcami v polymérnych systémoch. Takýto prístup je užitočný na získanie primeraných znalostí o vzťahu medzi elektronickou štruktúrou a chemickými posunmi13C NMR pevných polymérov. 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33

Pri aproximácii TB je vlnová funkcia ψ ( k ) pre elektrón v polohe r, ktorá patrí k okružnej dráhe n- tého kryštálu ( CO ), vyjadrená Blochovou teóriou takto:

Image

kde ν je index atómového orbitálu, N je celkový počet jednotkových buniek, k je vlnový vektor vyjadrený kx + ky + kz a R je mriežkový vektor. Symbol i označuje imaginárne číslo a C νν ( k ) je expanzný koeficient pre atómový orbitál φ ν ( r - R ). Použitím získaných koeficientov expanzie C ( k ) je možné chemický posun 13C NMR vyjadriť ako A ( k ) ako funkciu k . 22, 23

Odvodil sa protokol na výpočet chemického posunu NMR metódou SOS v rámci lineárnej kombinácie atómovej orbitálnej aproximácie so zanedbaním integrálov zahŕňajúcich viac ako dve centrá. Ak integrály zahŕňajú súčin atómových orbitálov na rôznych atómoch, diamagnetický člen σd A ( k ) sa môže vyjadriť pomocou

Image

kde hviezdička označuje komplexný konjugát a < v R | je ómy atómový orbitál v bunke Rth Unit. Paramagnetický výraz σ p A (k) možno vyjadriť pomocou

Image

kde integrál uhlovej hybnosti má nenulovú hodnotu iba medzi orbitálmi s rovnakým kvantovým číslom hybnej hybnosti z dôvodu orbitálnej ortogonality. Podrobná derivácia týchto rovníc na vyhodnotenie σ A ( k ) = σd A ( k ) + σP A ( k ) bola už uvedená. 22, 23

Na porovnanie vypočítaného chemického posunu σ A s experimentálnym chemickým posunom je potrebné integrovať sa cez prvú Brillouinovu zónu vyjadrenú

Image

kde Ω je objem primitívnej bunky. Takýmto spracovaním A ( k ) v porovnaní s k je teda možné chemický posun A A NMR porovnávať s experimentálnym chemickým posunom.

Prístupy s jednoduchým polymérnym reťazcom a s viacerými polymérnymi reťazcami

Chemické posuny rôznych typov 13C závislé od konformácie sa systematicky študovali pre jeden polymérny reťazec, ako je polyetylén, cis- a trans -polyacetylény, polyoxymetylén, polypyrrol, polyoxyetylén a polypeptidy, ako je polyglycín, poly (L-alanín), poly ( P- benzyl L-izo-nátyl) a poly (L-prolin). 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 Ukázalo sa, že koncept korelácie chemický posun / štruktúra 13 C, ktorý bol objasnený experimentálnymi a vypočítanými výsledkami, je: veľmi užitočný prostriedok na štruktúrnu charakterizáciu polymérnych a biopolymérnych systémov. Napríklad sa overilo, že experimentálne chemické posuny13C pre a -helix, co -helix a p -listové formy polypeptidov v tuhom stave závisia od konformácie. 24, 25

Ďalej sa zaoberáme kryštalografickými účinkami na chemické posuny polyetylénu 13C, ktorý je v ortorombickej forme, keď sa získa za bežných podmienok, a monoklinickej formy, keď sa získa za špeciálnych podmienok. Je dobre známe, že ortorombická forma je stabilnejšia ako monoklinická forma. V prvom prípade sú rovinné kľukaté roviny navzájom kolmé, ale v druhom sú rovnobežné. Výpočty polyetylénu s chemickým posunom o 13 ° C sa uskutočňovali s použitím metódy TB CNDO / 2 SOS použitím troch nekonečných polyetylénových reťazcov v ortorombických a monoklinických formách zmenou vzdialenosti medzi reťazcami R. Použila sa závislosť vypočítaného chemického posunu 13C ( σ ) uhlíkov CH2 v centrálnom polyetylénovom reťazci v ortorombických a monoklinických polyetylénoch od vzdialenosti medzi reťazcami R. Výpočty sa uskutočňovali zmenou R od 3 do 5 Á. Pre ortorombickú formu sa chemický posun 13 C ( orto ) posúva smerom hore, keď sa R zvyšuje z 3 na 4, 5 Á a smerom dole, keď sa R zvyšuje nad 4, 5 Á. V prípade monoklinickej formy je celková tendencia R závislosti na chemickom posune 13 C ( σ mono ) blízka tendencii pre ortorombickú formu s tým rozdielom, že hodnota R, v ktorej nastáva posun dole, je približne 4, 0 Á. Z rôntgenovej difrakcie sa stanovilo, že hodnota R pre ortorombickú formu je 4, 0 Á a pre monoklinickú formu je 4, 08 Á. Pri týchto hodnotách R sú hodnoty 13C chemického posunu ( σ ) pre ortorombické a monoklinické formy −58, 6 a −56, 7 ppm, kde záporné znamienko označuje deshielding. Preto, keďže experimentálny chemický posun ( δ ) je deshielding, relatívny rozdiel vo vypočítanom chemickom posunu ( σ ) by sa mal porovnať s pozorovaným δ . To znamená, že očakávaný chemický posun 13C ortorombického polyetylénu sa objaví na vyššom poli o 1, 9 ppm ako monoklinický polyetylén. Pretože experimentálny chemický posun ortorombického polyetylénu o 13 ° C sa objavuje vo vyššom poli o 1, 2 ppm ako monoklinický polyetylén, výpočty primerane vysvetľujú experimentálne výsledky. Z tohto výsledku je zrejmé, že taký posun chemického posunu je spôsobený lokálnou zmenou intermolekulárnych interakcií pri prechode z ortorombickej formy na monoklinickú formu. Okrem toho sa pomocou metódy TB INDO / S SOS študovali chemické posuny 13C a elektronická štruktúra siedmich polyetylénových reťazcov s ortorombickými a monoklinickými formami. 30 Výpočty chemického posunu 13 C primerane vysvetľujú experimentálne výsledky. Z týchto výsledkov bol stanovený uhol ϕ medzi osou b v ortorombickom mriežkovom systéme a rovinou kľukatej plochy all-trans 25 ° - 42 °. Celková energia pre jednotkovú bunku bola stanovená na -95, 997 eV pre ortorombický polyetylén a -95, 1989 eV pre monoklinický polyetylén. Tieto vypočítané výsledky súhlasia s experimentálnymi výsledkami, že ortorombická forma je stabilnejšia ako monoklinická forma.

Trojrozmerné (3D) polymérne kryštály

Bol odvodený protokol na výpočet chemického posunu NMR trojrozmerného polymérneho kryštálu kombináciou teórie ab initio TB MO a metódy SOS v teórii chemického posunu. 32 To má potenciál pochopiť a vyvinúť NMR chemické korelácie / štruktúrne korelácie pre štruktúrnu charakterizáciu 3D polymérových kryštálov, organických kryštálov atď.

Tento protokol sa použil na výpočet chemických posunov 13C NMR trojrozmerných polyetylénových kryštálov s ortorombickými a monoklinickými formami pomocou minimálnej sady báz STO-3G. Poznamenáva sa, že poloha chemického posunu 13C polyetylénu s ortorombickou formou sa objavuje na vyššom poli približne o 1 ppm ako v monoklinickej forme. Je veľmi dôležité objasniť, či taký rozdiel chemického posunu pochádza z rozdielu v elektronickej štruktúre medzi kryštalografickými formami. Použitím troch a siedmich nekonečných polyetylénových reťazcov ako ortorombických a monoklinických modelov v polo-empirickom MO rámci sa aproximovalo, že rozdiel chemického posunu vychádza z efektu balenia vyplývajúceho z rôznych kryštalografických foriem. Pre túto analýzu boli účinky interchainových a vnútroreťazcových interakcií na chemický posun 13C NMR a štruktúru pásov dôkladne vyhodnotené zmenou mriežkových konštánt osi a , b a c v polymémom kryštáli.

Ďalej sa tento prístup AB initio MO pre polymérny kryštál použil na objasnenie účinku vnútroreťazcových a medzifázových interakcií na 13C chemické posuny cis- a trans -polyacetylénov v pevnom stave. 33 Pred rozšírením prístupu k 3D polyacetylénovému kryštálu je užitočné preskúmať jeden polyacetylénový reťazec s trans - a cis- formami, aby sa objasnil účinok intermolekulárnej interakcie elektronickej štruktúry na správanie chemického posunu NMR. Celková energia na monomérnu jednotku a NMR chemické tienenie pre jediný polyacetylénový reťazec s cis- a trans- formami sa získajú použitím metódy ab initio TB MO v rámci minimálnej sady báz STO-3G. Ukázalo sa, že celková energia na monomérnu jednotku pre trans -polyacetylén je nižšia ako energia pre cis -polyacetylén o 0, 0069 au. To znamená, že trans- forma je stabilnejšia ako cis- forma. Trendy vo vypočítaných výsledkoch kvalitatívne vysvetľujú experimentálne zistenie, že nedopovaný trans- polyacetylén je tepelne stabilnejší ako cis- polyacetylén. Ďalej sa zaoberáme vypočítanými chemickými tieneniami pre cis- a trans- polyacetylény. Experimentálny chemický posun 13C cis- formy sa objavuje na vyššom poli o 10 ppm ako v transforme . Výpočet však ukazuje, že chemický posun cis- formy 13C je o niečo vyššie pole o 0, 1 ppm ako pole transformy . V porovnaní s experimentálnymi výsledkami je rozdiel chemického posunu medzi cis- a transformami veľmi malý. Ukázalo sa, že model jednoduchého polymérneho reťazca nie je dostatočný na to, aby primerane vysvetlil experimentálne výsledky, a že interchainové interakcie sa musia vziať do úvahy v 3D polymérnom kryštáli.

Elektronické štruktúry a chemické posuny 13C nekonečných cis- a trans- polyacetylénových kryštálov s ortorombickou kryštalografickou formou sa vypočítali pomocou metódy ab initio TB MO v rámci minimálnej sady báz STO-3G. Získali sa celkové energie na monomérnu jednotku a chemické posuny. Celková energia na monomérnu jednotku pre transformu je nižšia ako energia cisformy o 0, 0024 au. Transforma sa dá predpokladať, že bude stabilnejšia ako cisforma. 13C chemický posun cis- formy v polyacetylénovom kryštáli sa objaví na vyššom poli o 1, 0 ppm ako je trans- forma; to sa vypočítalo pomocou experimentálnych parametrov mriežky. Vypočítané výsledky sa blíži experimentálnym hodnotám v porovnaní s výsledkami z modelu jednoduchého polyméru. To ukazuje, že intermolekulárne interakcie majú dôležitú úlohu pri chovaní chemickým posunom pri 13 ° C. Keď sa parameter a mriežky a zníži na 5 Á (čo znamená zvýšenie intermolekulárnych interakcií), rozdiel 13 chemického posunu medzi cis- a transformami sa zmení na 4, 5 ppm. Potom, keď je dĺžka parametra a mriežky približne 4, 7 Ä, vypočítaný rozdiel chemického posunu 13 C sa stane 10 ppm a potom súhlasí s experimentálnou hodnotou. Tento výsledok naznačuje, že chemický posun 13C je veľmi citlivým parametrom na skúmanie intermolekulárnych interakcií v polymérnom kryštáli. Z vyššie uvedených výsledkov sa ukázalo, že štrukturálne objasnenie polymérových kryštálov a organických kryštálov sa môže uskutočniť kombináciou experimentov s chemickým posunom NMR 13C a metódou 3D polymérneho kryštálu MO / chemický posun vyvinutou nami.

Konformačne závislé NMR chemické posuny peptidov a polypeptidov v pevnom stave

Primárne štruktúry syntetických polypeptidov pozostávali z opakujúcich sa sekvencií určitých aminokyselinových zvyškov nie sú také komplikované ako tie v proteínoch. Syntetické polypeptidy sú veľmi dôležité polyméry vo vede o polyméroch a vede o proteínoch, pretože charakteristické vlastnosti týkajúce sa štruktúry vedú k expanzii výskumných oblastí v oblasti vedy o polyméroch a sú veľmi odlišné od bežných syntetických polymérov. Okrem toho sa syntetické polypeptidy niekedy používajú ako modelové biomolekuly pre proteíny, pretože tvoria a -helix, p -list, co -helix atď. za vhodných podmienok. Z takýchto situácií sa syntetické polypeptidy môžu považovať za „interdisciplinárne“ makromolekuly, ktoré sú veľmi dôležité pre výskumné práce v oblasti vedy o polyméroch a proteínovej vedy.

Ako je dobre známe, väčšina tu uvažovaných peptidov, polypeptidov a proteínov pozostáva z opakujúcich sa sekvencií peptidových väzieb s 20 rôznymi typmi substituentov na uhlíkovom atóme. Obmedzené konformácie, ako sú napríklad a -helix, co -helix, p -list atď. sú brané do úvahy použitím súboru možných dihedrálnych uhlov ( Ψ, around) okolo väzieb NC a a Ca (= 0). V stave roztoku sa chemický posun týchto biomolekúl NMR s možnou rotáciou okolo väzieb niekedy stáva spriemerovanou hodnotou pre možné rotácie okolo peptidových väzieb v časovom rámci NMR. V pevnom stave je však chemický posun charakteristický pre špecifické konformácie, pretože vnútorná rotácia okolo peptidových väzieb je fixná. To ukazuje, že chemický posun NMR sa môže použiť na objasnenie konformácie polypeptidov a proteínov v tuhom stave. Experimentálne a teoreticky sa ukázalo, že chemický posun polypeptidov a proteínov NMR je veľmi dôležitým parametrom NMR na určenie konformácie hlavného reťazca a niektoré štúdie štruktúrnej charakterizácie polypeptidov a proteínov pomocou takejto metodológie sa budú diskutovať nižšie.,

Chemické posuny 13 C závislé od konformácie

Napríklad sa ukázalo, že chemické posuny 13C uhlíkov Ca, Cp a amid C = O poly (L-alanínu) ((Ala) n ) úzko súvisia s jeho konkrétnymi konformáciami. 34 Pozorované13C CP-MAS (skrížená polarizácia - MAS) NMR spektrá pevného poly (L-alanínu) ukazujú, že uhlíkové signály Ca, Cp a amid C = O sú dobre rozlíšené medzi a -helixom a p - hárkové formuláre. Z grafov pozorovaných 13C chemických posunov oproti číselne priemernému stupňu polymerizácie sa tiež ukázalo, že chemické posuny 13C (Ala) n s a -helixovou formou ( n > 16) a p -listom Forma ( n <16) je nezmenená pre peptidy s rôznou molekulovou hmotnosťou v rámci experimentálnej chyby, a tak môže slúžiť na charakterizáciu a -helixovej formy a p -listovej formy. Chemické posuny Ca a karbonylových uhlíkov a -helixovej formy sú významne posunuté smerom dole o 4, 2 respektíve 4, 6 ppm, v porovnaní s posunmi vo forme p -listu, zatiaľ čo chemický posun Cp uhlíka a -helixová forma je posunutá smerom hore o približne 5 ppm vzhľadom na formu p -listu. Z tohto dôvodu sa na opis miestnej konformácie môžu použiť hodnoty chemického posunu o 13 ° C. Okrem toho má chemický posun 13C náhodne stočeného (Ala) n v roztoku kyseliny trifluóroctovej hodnotu medzi hodnotami vo forme a-helix a p -list.

Existencia takýchto charakteristických posunov chemických posunov o 13 ° C nie je obmedzená na zvyšok Ala. Tabuľka 1 sumarizuje hodnoty 13C chemického posunu rôznych aminokyselinových zvyškov vo formách a -helixu a p -listu vo vzťahu k tetrametylsilánu. 35, 36, 37, 38, 40 Tu je vidieť, že vrcholy Ca a C = O formy a -helixu sú všetky posunuté smerom nadol vzhľadom na vrcholy p -listovej formy, čo je v súlade s experimentálnymi údajmi (Ala) n . Okrem toho sú hodnoty chemického posunu 13C významné pre rôzne konformácie poly ( P- benzyl L-asparátu) (PBLA; (Asp (OBzl)) n ), ako napríklad a (aR) -helix na pravej strane, a (aL) -helix na ľavej strane, formy na ľavú ruku a ( aL ) -helix a p -listy, ktoré sa dosahujú vhodným ošetrením polypeptidového reťazca. 41 Ukázalo sa, že absolútne chemické posuny uhlíkov C a a Cp 13C sú ovplyvnené chemickou štruktúrou jednotlivých aminokyselinových zvyškov a môžu sa účinne použiť na konformačné štúdie konkrétnych aminokyselinových zvyškov v polypeptidoch a proteínoch., Zdá sa však, že chemické posuny C = O nie sú ovplyvnené štruktúrou zvyškov, a preto sa môžu použiť na určenie konformácie hlavného reťazca. Táto metóda bola použitá na štruktúrnu charakterizáciu kolagénových proteínov, 42 vlny keratínu, 43, 44 hodvábneho proteínu, 45 kvapalných kryštálov polypeptidu, 46, 47 polypeptidových gélov, 48, 49 a polypeptidových zmesí. 50, 51 Ďalšie peptidové systémy analyzované touto metódou sú zhrnuté v Saito et al. 40, 52

Tabuľka v plnej veľkosti

Je známe, že zmeny v helixovom význame polypeptidov v pevnom stave sa často vyskytujú kvôli zmenám vonkajších podmienok, ako je teplota atď., A zmeny v konformácii postranného reťazca tiež často vyvolávajú zmeny v helixovom zmysle hlavného -chain alebo iné konformácie. Zmena v pocite špirály následne zmení povahu polypeptidov. Vzorky PBLA s rôznymi sekundárnymi štruktúrami sa môžu získať tepelným spracovaním pri rôznych teplotách. 41 To bolo demonštrované pomocou meraní 13C CP-MAS NMR s premenlivou teplotou v reálnom čase. Bolo vidieť, že PBLA má formu aR -helixu pri izbovej teplote a zvýšením teploty sa forma aR -helixu postupne mení na formu wL-helixu a súčasne mierne na beta. listový formulár. Potom pri približne 150 ° C forma aR -helixu úplne zmizne a forma coL-helixu sa stane hlavnou zložkou a pri 173 ° C sa forma coL-helixu úplne zmení na formu p -listu. Merania teploty 13C CP-MAS NMR v reálnom čase ďalej ukázali 54, 55, že poly ( y - n -alkyl-L-glutamát) s dlhými n- oktadecylovými bočnými reťazcami tvorí termotropný kvapalno-kryštalický stav topením bočné reťazce pri približne 50 ° C, pretože hlavný reťazec má tuhú a -helixovú formu iba pri teplotách vyšších ako približne 50 ° C, ale poly ( β - n -alkyl L-aspartát) s dlhými n- oktadecylovými bočnými reťazcami tvoria roztavenie bočných reťazcov pri približne 50 ° C v termotropnom stave v tekutom kryštalickom stave, pretože hlavný reťazec sa mení z formy aR -helix na formu aL-helix pri teplotách vyšších ako približne 50 ° C, a teda je nie rigidné. Takáto prechodná zmena v smere špirály z pravotočivej špirálovej formy na ľavostrannú špirálovitú formu indukuje zmeny v povahe polypeptidov.

Chemické posuny závislé od konformácie 15 N

Konformácia závislá od 15 N chemických posunov pevných homopolypeptidov, ako je 15 N-značený poly (L-alanín) s a -helixom a p -listovými formami, poly (L-leucín) s a -helixom a p -listovou formou a tak ďalej, 56, 57 bolo študovaných pomocou 15 N CP-MAS NMR v pevnom stave, ako pre prípad chemickej zmeny 13C závislý od konformácie. Z týchto experimentálnych výsledkov sa potvrdilo, že izotropické 15 N chemické posuny spôsobené peptidovým skeletom homopolypeptidov v pevnom stave vykazujú významnú zmenu závislú od konformácie z pozorovaní a teoretických výpočtov. Ukázalo sa, že 8 izo pre a -helixovú formu homopolypeptidov sú 97, 0 - 99, 2 ppm relatívne k Gly- 15 N a hodnoty pre p -listovú formu sú 99, 0 - 107, 0 ppm, a teda a -helixová forma sa objaví vzostupne približne o 1, 2 - 10, 0 ppm vzhľadom na formu p -listu. 15 N chemický posun závislý od konformácie samozrejme závisí od štruktúry jednotlivých aminokyselinových zvyškov. Približne 15 N rozdielov chemického posunu je dosť malé, ale mali by byť v rámci prijateľných limitov pre homopolypeptidy. Variácie hodnôt ô izo pre rôzne typy homopolypeptidov sú približne 2, 5 ppm vo forme a-helixu a približne 7, 5 ppm vo forme p -listu. Ďalej, 5 iso hodnoty p -listovej formy L-Leu, L-Val a L-Ile zvyškov s alkylovými bočnými reťazcami sa javia downfield vzhľadom k hodnotám L-Ala zvyšku. Na rozdiel od toho, 5 iso hodnoty pre p -listovú formu L-Asp (OBzl), L-Glu (OBzl) ( y- benzyl L-glutamát) a L-Glu (OMe) ( y- metyl-L-glutamát) zvyšky s esterom postranného reťazca sa objavia vzostupne vzhľadom na 5 izo hodnotu zvyšku L-Ala. To znamená, že rozdiel 15 N chemického posunu medzi formami a -helixu a p -listu závisí od štruktúry postranného reťazca jednotlivých aminokyselinových zvyškov. Ďalším výsledkom je to, že 5 izo hodnoty pravotočivých a ( aR ) -helixov a ľavotočivých a (aL) -helixov PBLA v pevnom stave sú 99, 2 a 97, 0 ppm, a teda prvé sa objaví na spodnom poli o 2, 2 ppm ako druhé. To znamená, že 15 N 5 izo výsledky poskytujú informácie o pocite špirály, ako pre výsledky 13 C ô izo .

Izotropické 15 N chemické posuny a tenzorové zložky boli stanovené pomocou 15 N CP-MAS a CP NMR v tuhom stave pre sériu polypeptidov [Ala *, X] n obsahujúcich 15 N-značený L-alanín (Ala *). a ďalšie aminokyseliny (X: zvyšky s prirodzeným výskytom 15 N), ako napríklad glycín, L-alanín, D-alanín, L -valín, p -benzyl-L-aspartát atď. Konformácie pre tieto polypeptidy sú charakterizované na základe ich chemických posunov13C závislých od konformácie. 58 Ukázalo sa, že 8 izo je užitočné pre konformačnú štúdiu kopolypeptidov s rovnakými primárnymi štruktúrami (aminokyselinové sekvencie), a okrem toho hodnota ô 22 zvyšku Ala * v kopolypeptide úzko súvisí s hlavným - konformácie reťazcov (ako sú pravostranné a ľavostranné a-helices a p -listové formy), skôr ako aminokyselinová sekvencia. Teda 15 N chemické posuny tuhých polypeptidov závisia od konformácie. 59

17 O chemické posuny závislé od konformácie

Chemicko-posuny amidokarbonylových uhlíkov v Gly zvyšku tuhého polyglycínu s formami 3-helixu a p -listu a Ala zvyšku pevného poly (L-alanínu) s a -helixom a Boli študované p -listové formy, aby sa okrem analýzy 13 C a 15 N jadier aminokyselinových zvyškov polypeptidov vyvinula metodika štruktúrnej charakterizácie. Aby sme to dosiahli, musíme prekonať dva ťažké problémy. Prvým problémom je, že 17O jadro má veľmi nízku prirodzenú hojnosť 0, 037%. Druhým problémom je to, že pretože číslo 17O jadrového spinu je 5/2, kvadrupolárne rozdelenie karbonylového kyslíka aminokyselinového zvyšku v pevných látkach je veľmi veľké, a teda signál amidu 17O je extrémne široký. To znamená, že nie je ľahké určiť spoľahlivý 17 O chemický posun v tuhých látkach. Z tohto dôvodu sme vyvinuli metódu označovania 17O na prípravu polyglycínu a poly (L-alanínu) so 6% a 10% 17 0-značených amidových karbonylových oxygénov zvyškov Gly a Ala, respektíve 60, 61, 62. a vykonali 17 O NMR merania v tuhom stave s rôznymi NMR frekvenciami 61, 63, 64 a s vysokou NMR frekvenciou a vysokorýchlostnou MAS 64, 65 a uskutočnili 17O spektrálnu analýzu. 66

17 O NMR spektrá peptidov a polypeptidov obsahujúcich Gly a Ala v tuhom stave sa merali pomocou metódy statického CP pri určitých frekvenciách NMR (270, 400 a 500 MHz pre 1 H). 61 Chemický posun ( δ ), kvadrupolárna väzbová konštanta ( e2 qQ / h ) a asymetrický parameter gradientu elektrického poľa ( η ) boli stanovené počítačovou simuláciou získaného spektra. Najskôr sa použijú izotropné chemické posuny a tenzorové zložky. Na základe statických experimentov s CP sa zistilo, že hodnoty δ izo pre formy 3 1 -helixu a p -listu v polyglycíne 61 sú 288 a 299 ppm, vzhľadom na vonkajšiu kvapalnú vodu ( 5 = 0 ppm), a teda forma 3i-helixu sa objavuje vo vyššom poli o 11 ppm ako forma p -listu. Statické CP experimenty tiež určili, že 8 izo hodnoty pre a -helix a p -listové formy v poly (L-alaníne) 63 sú 303 a 265 ppm, a teda a -helix forma sa objavuje na spodnom poli pomocou 38 ppm ako forma p -listu. To naznačuje, že 17O5 izo je veľmi citlivý na sekundárnu štruktúru, a teda závisí od konformácie. Ďalej sa zaoberáme tenzorovými zložkami ( ô 11, δ 22 a δ 33, z horného poľa na horné pole), hoci experimentálne chyby nie sú z dôvodu širokého spektra také malé. Zistilo sa, že tenzorové zložky ( 811 , 5 22 a 5 33 ) pre p -listovú a 3 1 -helixovú formu v polyglycíne 61 sú (574, 425 a -101 ppm) a (562, 410 a -108). ppm) a tenzorové zložky ( 811 , 5 22 a 5 33 ) pre a -helix a p -listovú formu v poly (L-alaníne) 63 sú (595, 435 a -112 ppm) a ( 514, 390 a -110 ppm). Z týchto experimentálnych výsledkov je zrejmé, že všetky tenzorové komponenty pre p -listovú formu v polyglycíne sa vyskytujú na nižšom poli ako 3-helixová forma v polyglycíne a v poly (L-alaníne), ô 11 a 822 pre a -helixovú formu sa objaví v nižšom poli ako vo forme p -listu a 5 33 pre a -helixovú formu sa objaví vo vyššom poli ako pre formu p -listu.

Ďalej sa na stanovenie presnej izotropnej hodnoty 17O chemického posunu použila kombinácia magnetických a vysokorýchlostných metód MAS s vysokým poľom. Ako jeden príklad sa NMR spektrá v pevnom stave s vysokým rozlíšením pevných poly (L-alanínov) s formami a -helixu a p -listu merali pomocou magnetu s vysokým poľom (800 MHz na 1 H) a vysokorýchlostný MAS (25 kHz), ako je znázornené na obrázku 1. 64 Hodnoty ô izo pre a -helix a p -listovú formu boli 319 a 286 ppm. Je ukázané, že forma a -helixu sa objavuje v dolnom poli o 33 ppm ako forma p -listu. Tieto hodnoty sú približne hodnoty stanovené statickou metódou CP. Z týchto výsledkov je zrejmé, že chemický posun 17 O v závislosti od konformácie je pozoruhodne väčší ako zodpovedajúci chemický posun v závislosti od konformácie 13 C a 15 N. Avšak, 5 izo hodnoty pre formy 3 1 -helixu a P -listu v pevnom polyglycíne sú 293 respektíve 304 ppm. Je ukázané, že forma 3 1 -helixu sa objavuje vo vyššom poli o 11 ppm ako forma p -listu. Z týchto výsledkov je zrejmé, že tieto hodnoty sú približne hodnoty stanovené statickou metódou CP. Ďalej môžeme získať hodnotu e2QQ / h z pozorovanej 17O NMR spektrálnej analýzy. Zistilo sa, že hodnoty e2QQ / h pre a -helix a p -listové formy v poly (L-alaníne) sú 8, 59 a 8, 04 MHz, a hodnoty pre 3-helix a p -list formy v polyglycíne sú 8, 21 a 8, 36 MHz. E2qQ / h sa bude diskutovať o vzťahu k dĺžke amidovej vodíkovej väzby> C = O ·· HN < 67, 68, 69 a experimentálnym výsledkom 64, 65 a teoretickým výpočtom 66 sa bude porovnávať pod časťou izotropické 1 H chemické posuny.

Image

Pozorované a teoreticky simulované MAS17O ( a ) NMR spektrá sa otáčali pri 25 kHz pre tuhú (L-Ala) n, ( b ) n = 100, s a -helixovou formou a tuhú (L-Ala) n, n = 5, s formou p -listu pri 108, 6 MHz (800 MHz pre 1 H) pri teplote miestnosti. Z Yamauchi a kol. 64

Obrázok v plnej veľkosti

Lemaitre a kol. 70 merala MAS17O NMR spektrá v pevnom stave selektívne značeného transmembránového peptidu, 17O- [L-Ala12] -WALP23, ktorý bol na Ala-12 označený ako lyofilizovaný prášok a ktorý bol začlenený do hydratovaných vezikúl pri 81, 345 a 108, 419 MHz. Spektrálny obrazec je veľmi podobný spektru (Ala) n vo forme a -helixu. 64 Izotropný chemický posun pre značený peptid pri 317, 5 ppm je veľmi blízky posunu (Ala) n s a -helixovou formou pri 319 ppm, a preto peptid má a -helixovú formu. MAS17O spektrum bolo merané pri 81, 345 MHz pre 17O- [L-Ala12] -WALP23 v hydratovaných DSPC vezikulách (molárny pomer peptid / lipid 1:10) s jedinou rezonanciou zo značky vloženej v alaníne-12 so stredom približne pri približne 280 ppm Lyofilizovaná vzorka MLV sa hydratovala jedným hmotnostným ekvivalentom vody a spektrum sa získalo pri teplote miestnosti s lipidmi v kvapalnej kryštalickej fáze. V poslednej dobe sa čoraz viac uvádza počet 17 NMR štúdií v pevnom stave o štruktúrach rôznych typov peptidov a biomolekúl.

Chemické posuny 1 H závislé od konformácie

Shoji a kol. 71, 72 ukázali pomocou meraní1H CRAMPS (kombinovaná rotácia a viacnásobná pulzná spektroskopia) na rôznych homopolypeptidoch v tuhom stave, že1H chemické posuny signálu H a homopolypeptidov s a-helixom a p-listom sú 3, 9– 4, 0 ppm, respektíve 5, 1 - 5, 5 ppm, vztiahnuté na tetrametylsilán. Preto je chemický posun H v tuhom stave rovnako závislý od konformácie ako chemické posuny 13C, 15N a 17O, čo je veľmi užitočné pre konformačnú analýzu polypeptidov v tuhom stave.

Yamauchi a kol. 73, 74 vyvinuli novú NMR techniku ​​na meranie vysokorozlišovacej tuhej fázy1H NMR s použitím metódy homonukleárneho dipolárneho odpojenia FSLG-2 (frekvenčne prepínaný Lee-Goldburg) kombinovanej s vysokorýchlostným MAS a vykonali štrukturálnu charakterizáciu polypeptidov v tuhom stave, ako je opísané nižšie. Použitím tejto techniky sa uskutočnila štruktúrna charakterizácia polyamidu Nylon 6, v pevnom stave, meraním1H NMR spektier v tuhom stave v širokom rozmedzí teplôt. 75

Koncept mapy chemického posunu NMR

V kryštalickom stave štruktúrna informácia získaná chemickým posunom polypeptidov zodpovedá pevnej konformácii, ako je uvedené vyššie. Výpočet 13C chemických posunov pre dipeptidové fragmenty ( N- acetyl- N' -metyl-L-alanínamid) [Ac-L-Ala-NHMe] poly (L-alanín) a L-alanín obsahujúcich proteíny má Pokus o použitie metódy FPT (konečná poruchová teória) INDO ako funkcie dihedrálnych uhlov ( Φ , Ψ ), sa líšil v 15 ° intervaloch. Bola vytvorená obrysová mapa ako funkcia Φ a Ψ v priečnej a pozdĺžnej osi pre chemický posun 13C pomocou získaných hodnôt chemického posunu na porozumenie a predpovedanie správania chemického posunu 13C polypeptidov spojených so sekundárnymi. štruktúrne prvky, ako napríklad a -helix, p -list atď. 76 Táto mapa chemického posunu je veľmi užitočným vyjadrením správania sa chemického posunu, ktoré je výsledkom zmeny dihedrálnych uhlov ako v Ramachandranovej energetickej mape. Porovnaním experimentálnych údajov a predpokladaných hodnôt daných touto mapou chemického posunu je možné úspešne predpovedať chemické posuny 13C zvyškov Ala v polypeptidoch a proteínoch. To sa použilo na pochopenie chovania kolagénového proteínu 42 a proteínov hodvábu 45 v pevnom stave chemickým posunom 13C.

Ďalej boli pre stredne veľké molekuly dostupné ab initio výpočty pre chemické posuny NMR v dôsledku pozoruhodného pokroku vo výkone pracovných staníc, osobných počítačov a superpočítačov. To umožňuje kvantitatívnu diskusiu o chovaní chemického posunu. Ako príklad možno uviesť, že výpočet ab initio MO so základom 4–31 G pomocou metódy GIAO-CHF (atómovo nezávislá atómová orbitálna väzba Hartree – Fock) sa uskutočnil na N -acetyl-N'-metyl-L-alanineamide., rovnaké modelové molekuly ako v prípade vyššie uvedeného výpočtu FPT INDO. 77 Izotropná 13C chemická posunová mapa uhlíka Cp ako funkcia dvojstenných uhlov ( Φ , Ψ ) bola vypočítaná tak, ako je to znázornené na obrázku 2, pričom kladné znamienko označuje tienenie. Celkový trend tejto mapy je podobný trendu získanému metódou FPT INDO. Vypočítaný izotropický chemický posun ( σ ) pre uhlík C je 186, 4 ppm pre dvojstenové uhly ( Φ , Ψ ), ktoré zodpovedajú tvare antiparalelných β ( βA ), 189, 4 ppm pre pravotočivý α ( α) R ) -helixová forma a 189, 6 ppm pre ľavostrannú a (aL) -helixovú formu a pozorované izotropné chemické posuny ( 5 ) sú 21, 0 ppm pre formu Ap -listu, 15, 5 ppm pre aR -helixu forma a 15, 9 ppm pre formu aL-helixu. Takéto experimentálne chovanie chemickým posunom je dobre vysvetlené vypočítaným chovaním chemického posunu. Zistilo sa, že zmeny v dihedrálnych uhloch ( Φ , Ψ ) dominujú v izotropnom chemickom posune C uhlíka uhlíka L-alanínového zvyšku.

Image

The isotropic 13 C chemical shift contour map for the C β carbon of the L -alanine residue with the dihedral angles ( Φ , Ψ ) calculated by using the GIAO-CHF method with the 4–31 G ab initio basis set according to the concept of the NMR chemical shift map, 76 in ppm The 4–31 G basis set optimized the geometries for the model molecules, N ′-acetyl- N ′-methyl- L -alanine amide. From Asakawa et al. 77

Obrázok v plnej veľkosti

As mentioned above, the principal values of the chemical shift tensor provide information about the 3D electronic state of a molecule. However, to understand the behavior of the principal values, one should obtain information about the orientation of the principal axis system of the chemical shift tensor with respect to the molecular fixed frame. The orientations of the principal axis systems of the chemical shift tensors of the C β -carbons in Ala have been calculated for some peptides whose Ala moieties have different main-chain dihedral-angles: ( Φ , Ψ )=(−57.4°, −47.5°) ( α R -helix form), (−138.8°, 134.7°) ( β A -sheet form), (−66.3°, −24.1°) (3 10 R -helix form) and (−84.3°, 159.0°) (3 1 -helix form). The σ 33 component nearly lies along the C α -C β bond for all the peptides considered here, and the σ 11 is nearly also perpendicular to the plane defined by the C β , C α , and N atoms in the Ala residue. 78 The σ 22 component is parallel to the plane. These results agree with the experimentally determined direction of the σ 33 for the C β -carbon in the L -Ala amino-acid residue by Naito et al. 79 The σ 11 component for the dihedral angles corresponding to the β A -sheet form is 37.06 ppm This shows a downfield shift of approximately 9 ppm with respect to that for the α R -helix form. This means that the σ 11 dominates the downfield shift on the isotropic chemical shift of the C β carbon for the β A -sheet form. Because the σ 11 is not oriented along a specified chemical bond, it is not easy to intuitively comprehend the chemical shift tensor behavior of the C β carbon. However, it is obvious that the through-space interaction between the C β methyl group and its surroundings might be important for understanding the σ 11 behavior.

For all of the dihedral angles employed in the calculations, the σ 33 component of the chemical shift tensor of L -alanine C α -carbons lies approximately along the C α -C′(=O) bond. However, for the dihedral angles ( Φ , Ψ )=(−57.4°, −47.5°) ( α R -helix form), (−66.3°, −24.1°) (3 10 R -helix form) and (−84.3°, 159.0°) (3 1 -helix form), the σ 22 component diverges slightly from the C α -C β bond and for ( Φ , Ψ )=(−138.8°, 134.7°) ( β A -sheet form), the σ 11 component is along this direction. The tensor component that is nearly along the C α -C β bond is 47.53 ppm for the β A -sheet form, 61.93 ppm for the α R -helix form, 64.74 ppm for the 3 10 R -helix form and 65.79 ppm for the 3 1 -helix form. Changes in the dihedral angles cause a large deviation of the chemical shift tensor component that is along the C α -C β bond. Moreover, because the σ 33 depends on changes from one dihedral angle to another, it is obvious that the dihedral angle is explicitly dependent on the σ 33 . It is thought that if the carbonyl group in the Ala residue forms a hydrogen bond, the σ 33 will be most likely affected. de Dios et al. 80 studied the 13 C chemical shift behavior of polypeptides and proteins by using ab initio MO calculation of the 13 C chemical shifts of several types of oligo-peptides such as in the representation of the FPT INDO 13 C chemical shift map as a function of the dihedral angles.

Another significant and empirical correlation of the 13 C chemical shift map has been made by Spera and Bax 81 on the basis of a database of the experimental 13 C chemical shift values of 442 residues of various globular proteins in solution for which the dihedral angles ( Φ , Ψ ) are known with good precision by X-ray work, resolved at 1.0–2.2 Å. Their 13 C chemical shift maps of the C α and C β carbons show the distribution of the secondary shifts in the α -helix and β -sheet forms. These are consistent with the solid state 13 C chemical shifts of homopolypeptides. For the C α carbon, the average secondary shift for the α -helix form (119 residues) appears at a lower field by approximately 4.6 ppm compared with the β -sheet form (126 residues), and for the C β carbon, the former appears at a higher field by approximately 2.6 ppm The chemical shift dispersion collected from globular proteins in solution is much larger than that from solid polypeptides. In addition, the database, containing 3796 13 C α chemical shifts and 2794 13 C β chemical shifts as obtained from 40 different proteins, was used for the preparation of the chemical shift maps by Asakura et al. 82, 83 It is shown that the chemical shift map is useful for the structural characterization of proteins, and the solution conformation of the protein is essentially similar to that in the solid state.

NMR chemical shifts and hydrogen-bonded structures associated with the secondary structure of solid peptides and polypeptides

It is well known that hydrogen bonds have an important role in forming the secondary structures of peptides and polypeptides, including proteins. Thus, the nature of the hydrogen bond has been widely studied by various spectroscopic methods. 84 High-resolution NMR spectroscopy has also been used as one of the most powerful means for obtaining useful information about details of the hydrogen-bonded structure as associated with the secondary structure. Therefore, the chemical shifts of the amide carbonyl carbon, amide nitrogen, amide carbonyl oxygen and amide hydrogen of the amino-acid residues associated with hydrogen bonding have provided useful information about the secondary structure of polypeptides. 85

The NMR chemical shift is one of the most important parameters for providing information about molecular structures including hydrogen bonds. Because the electronic structure around the amide carbonyl-carbon and nitrogen in peptides and polypeptides is greatly affected by the nature of the hydrogen bond, the NMR chemical shifts for the nuclei involved are sensitive to the spatial arrangement of the nuclei comprising the hydrogen bond.

However, it is difficult to exactly determine the effect of hydrogen bonding on the chemical shifts in solution because the observed chemical shifts of peptides are often the averaged value over rotational isomers resulting from the interconversion caused by rapid rotations about the bonds. In contrast, the chemical shifts in the solid state provide direct information about the hydrogen bond of the peptides and polypeptides with a fixed conformation. Taking advantage of this, systematic studies have been performed on the effect of hydrogen bonding on the chemical shifts of the amide carbonyl carbon, amide nitrogen, amide oxygen and amide hydrogen of the amino acid residues for peptides and polypeptides in the solid state to obtain detailed information about the hydrogen-bonded structure. 85 In this section, some of the studies on the hydrogen-bonded structure of peptides and polypeptides in the solid state based on measurements and theoretical calculations of NMR chemical shifts will be discussed. 59, 85, 86, 87

Isotropic 13 C chemical shifts and chemical shift tensor components

The effect of hydrogen bonding on the 13 C chemical shift of the carbonyl carbon has been studied in several amino-acid residues. 88, 89, 90, 91, 92 The observed isotropic chemical shifts ( δ iso ) of the amide C=O carbons of the Gly, L -Ala, L -Val, L -Leu and L -Asp residues of peptides and polypeptides in the solid state were plotted against the N···O hydrogen bond length (R N···O ), as shown in Figure 3. This figure shows that a decrease in R N···O leads to a downfield shift. There is an approximately linear relationship between δ iso and R N···O for the peptides considered here, expressed as δ iso = a − b R N···O, where δ iso is expressed in ppm, R N···O is in Å, and a (in ppm) and b (in ppm/Å) are constant. The values of a and b were calculated to be 206.0 and 12.4 for the Gly residue, 237.5 and 21.7 for the Ala residues, 202.2 and 10.0 for the Leu residue, 215.4 and 14.2 for the Val residue and 199.0 and 9.6 for the Asp residues, respectively, by using the least squares method. There is also an approximately linear relationship between the δ 22 and R N···O for the Gly and Ala residues, and the values of a and b were calculated to be 262.9 and 30.2 for the Gly residue and 344.7 and 54.5 for the Ala residue, respectively.

Image

The correlation between the 13 C chemical shifts of the amide carbonyl carbons in Gly, L -Ala, L -Val, L -Leu and L -Asp residues of oligopeptides and polypeptides in the solid state and the hydrogen bond length between the amide nitrogen and the amide carbonyl oxygen (R N

,

O ). 13 C chemical shifts are in ppm relative to tetramethylsilane. From Tsuchiya et al. 90

Obrázok v plnej veľkosti

These relationships indicate that the hydrogen bond length can be determined through the observation of the 13 C chemical shift of the carbonyl carbon in the amino acid residues in peptides and polypeptides. The slope b of the variation of δ iso against the hydrogen bond length for these amino acid residues decreases in the order Ala>Val>Gly>Leu≈Asp. The magnitude of the intercept decreases in the order Ala>Val>Gly>Leu≈Asp. The magnitude of the slope b decreases in the same order as the intercept a . These results show that the values of a and b are characteristic of individual amino-acid residues. It is noted that the amide carbonyl carbon chemical shifts show this hydrogen bond length dependence not only in oligopeptides but also in polypeptides, such as polyglycine and poly( L -alanine). This suggests that the 13 C chemical shift of any amino acid carbonyl-carbon that accepts the hydrogen bond which is formed between the amide >C=O and amide >NH is strongly influenced by the hydrogen bond length.

Some Gly-containing peptides in the crystalline state have a hydrogen bond between the >C=O and −NH 3 +, where the N-terminus is protonated as NH 3 + and the C-terminus is unprotonated. 88 The carbonyl 13 C chemical shifts are linearly displaced upfield with decreasing R N···O, in contrast to the >C=O···HN< hydrogen bond. Next, we consider the 13 C chemical shift calculations for the amide carbonyl carbons of some amino-acid residues by using the corresponding dipeptide hydrogen bonded with two formamide molecules in the calculations utilizing the FPT INDO method as a function of R N···O . 88 The theoretical calculations show that the isotropic 13 C chemical shifts for all of the amino-acid residues exhibit approximately linear downfield shifts for short R N···O values. This experimental finding should be reasonably explained by the calculated results in the R N···O region. However, the 13 C chemical shifts of the carbonyl carbon of the N -acetyl- N ′-methylglycineamide hydrogen bond between the >C=O and −NH 3 + are calculated as a function of the hydrogen bond length. The 13 C chemical shift moves upfield for decreasing values of R N···O, agreeing with the experimental results. This trend is opposite to that for found peptides that have hydrogen bonds between the amide >C=O and HN< groups.

Let us consider the 13 C chemical shift tensor behavior of the amide carbonyl carbon of peptides with a hydrogen-bonded structure. It has been reported that the δ 11 component is in the amide sp 2 plane and lies along a direction normal to the C=O bond, the δ 22 component lies almost along the amide C=O bond, and the δ 33 component is aligned perpendicular to the amide sp 2 plane. 88, 89 It is expected that the principal values of the 13 C chemical shift tensors ( δ 11, δ 22 and δ 33 ) are, in principle, more valuable as parameters for obtaining the detailed information about the hydrogen bonding that can be used to determine the electronic structure compared with the isotropic 13 C chemical shift ( δ iso =( δ 11 + δ 22 + δ 33 )/3).

The exact tensor components were determined from the Herzfeld–Berger analysis 93 of the spinning side bands of the 13 C CP-slow MAS NMR spectra of carbonyl 13 C-labeled Ala-containing peptides, such as AcAlaNHMe, AcAlaAibOMe, AlaGlyGly·H 2 O, AlaSer and AlaProGly·H 2 O, and poly( L -alanine) with the α -helix form. 89 The experimental δ 22 values are the most sensitive to R N···O, and the δ 22 values move linearly downfield with decreasing R N…O, except for the δ 22 of AlaProGly·H 2 O; the covalent bond between the Ala and Pro residues of AlaProGly·H 2 O does not form a peptide bond but an imide bond. For this, the electronic structure of the Ala carbonyl-carbon in AlaProGly·H 2 O is thought to be different from that of the Ala carbonyl-carbon forming the peptide bond, and hence, the chemical shift for the Ala carbonyl-carbon might be sensitive to both the R N···O and the nature of the bonds. A decrease in R N…O leads to a slight upfield shift in the δ 11, except for AlaProGly·H 2 O. The experimental δ 33 values are almost independent of R N···O, with some scatter on the data. With a decrease in R N···O, there is a large downfield shift of the isotropic 13 C chemical shifts, δ iso, resulting from the behavior of the δ 22 in overcoming that of the δ 11 . McDermott et al. 94 obtained similar results on the amide carbonyl carbons of various types of amino acids.

To understand the relationships between the 13 C chemical shift and the hydrogen bond length, the FPT INDO calculations on the 13 C chemical shift tensor components of some model peptides have been performed. 88, 89 The calculations show that the σ 22 is the most sensitive to a change of R N···O and moves linearly downfield with a decrease in R N···O . Correspondingly, the σ 11 increases with a decrease in R N···O, whereas the σ 11 is insensitive to changes in R N···O . The results of the theoretical calculations are in agreement with the experimental results. Such an agreement indicates that the changes in the 13 C chemical shift originate predominately from a change in the electronic state of the amino carbonyl groups caused by the variation in the hydrogen bond length.

Next, we are concerned with the relationship between the carbonyl 13 C chemical shifts and the R N···O values for a Gly residue incorporated into (Ala) n, (Leu) n and (Val) n to obtain structural information regarding how the corresponding Gly residue is incorporated with the same secondary structure into the host polypeptides. 95 The R N···O value for the α R -helix form is in the range of approximately 2.7–2.8 Å and that for the β -sheet form is approximately 3.0 Å, as determined from X-ray diffraction. The R N···O values for the guest Gly residue incorporated into host copolypeptides can be determined by using the relation δ = a − b R N···O and observing the amide carbonyl 13 C chemical shifts, δ , of the guest Gly residue. The analysis of the 13 C chemical shift of the Gly residue revealed that the hydrogen bond lengths of the guest Gly residue (R N···O ) are both 2.7 Å in (Leu, Gly*) n and (Ala, Gly*) n, where the host Leu and Ala residues take the α R -helix form and Gly* indicates the 13 C-labeled glycine residue. This is in agreement with the values of 2.7 and 2.8 Å for the host Leu and Ala residues. Therefore, the guest Gly residue is completely incorporated into host polypeptides with the α R -helix form. Similar results are obtained for (Val, Gly*) n and (Ala, Gly*) n in the β -sheet form.

Isotropic 15 N chemical shifts and chemical shift tensor components

The isotropic 15 N chemical shifts and the tensor components of the glycine residue in a variety of peptides with a terminal Boc group have been measured to clarify the relationship between the 15 N chemical shift (relative to a saturated 15 NH 4 NO 3 solution in water) and R N···O . 96, 97 It has been shown that there is a clear relationship between the observed isotropic 15 N chemical shifts ( δ iso ) of GlyNH in BocGly, BocGlyAla, BocGlyPhe, BocGlyAib and BocGlyProOBzl in the solid state and their R N···O values determined by X-ray diffraction. The R N···O values of the peptides used here are in the 2.95–3.08 Å range. However, the hydrogen bond angles ( ∠ C=O···N) are somewhat variable and are in the 113–155° range. The chemical shifts move downfield with a decrease in R N···O . The δ 11 and δ 33 components are more sensitive to a change in R N···O than the δ 22 component. A change of 0.2 Å in R N···O results in a change of 20 ppm in the δ 11 and δ 33 components but a change of 5 ppm in the δ 22 component. However, only the δ 33 component moves linearly downfield with a decrease in R N···O ; in the δ 11 and δ 22 components, there is no clear relationship with R N···O . Such a behavior is governed not only by the hydrogen bond length but also by the hydrogen bond angle. The 15 N chemical shift ( σ iso ) and the chemical shift tensor components ( σ 11, σ 22 and σ 33 ) calculated by the FPT INDO method for N -acetyl- N ′-methylglycine amide hydrogen bonded with a formamide molecule have shown that the isotropic 15 N chemical shifts move downfield with a decrease in R N···O . This explains the experimental results well. Further details of studies of solid-state 15 N NMR chemical shifts associated with hydrogen bonding in peptides and polypeptides are reviewed elsewhere. 40, 59

The directions of the GlyNH 15 N chemical shift tensor components have been determined using a BocGlyGlyGlyOBzl single crystal. 98 It was shown experimentally that the σ 11 component lies approximately along the NH bond, the σ 22 component is aligned in the direction perpendicular to the peptide plane, and the σ 33 component lies approximately along the NC α bond. The FPT INDO calculation 96, 97 shows that the σ 11 component lies approximately along the NH bond, in agreement with the experimental results, but the σ 22 component lies approximately along the NC α bond and the σ 33 component is aligned in the direction perpendicular to the peptide plane, which are different from the experimental results. It seems that it is not easy to determine the directions of the σ 22 and σ 33 components with significant experimental accuracy because their values are very close to each other. The calculated assignment of the σ 22 and σ 33 components seems to be acceptable, although it is difficult to differentiate between them. The direction of the σ 11 component can be easily determined because its magnitude is significantly different from the others. In the theoretical calculation, the most shielded component σ 33 is aligned in the direction perpendicular to the peptide plane because the orbitals of the nitrogen lone-pair electrons are in this direction. It has been shown from the experimental results that the σ 33 component moves linearly downfield with a decrease in the hydrogen bond length; therefore, the σ 33 component is not related to the hydrogen bond angle and the σ 11 and σ 22 components are related to the hydrogen bond length and the hydrogen bond angle. These have been reasonably explained by the calculation.

Isotropic 17 O chemical shifts and chemical shift tensor components

In addition to the studies on the conformation-dependent 17 O chemical shifts of polyglycine and poly( L -alanine), the association of the hydrogen bond structure with the 17 O NMR parameters such as the chemical shifts δ iso and ( δ 11, δ 22 and δ 33 ), e 2 qQ / h and η of Gly-containing peptides and polyglycine and poly( L -alanine) in the solid state have been studied. 61, 63, 64, 65 Furthermore, these experimental data have been analyzed with the theoretical calculations of the association of the hydrogen-bonded structure with the NMR parameters for N -acetyl- N ′-methylglycineamide hydrogen bonded with two formamide molecules by the FPT-MNDO-PM3 method 66 and the ab initio MO method 99 as a function of the hydrogen bond length R N···O . The hydrogen bond length is closely related to the higher-order structures, such as the α -helix, 3 1 -helix, β -sheet and other forms. The above theoretical calculations predict that the δ iso values moves upfield with a decrease in the R N···O . It is known from X-ray diffraction studies that the R N···O values for the β -sheet form 100 and the 3 1 -helix form 67 in polyglycine are 2.95 and 2.73 Å, respectively, and the R N···O values for the α -helix and β -sheet forms in poly( L -alanine) 68, 69 are 2.87 and 2.83 Å, respectively. Therefore, the experimental finding that the β -sheet form ( δ iso =304 ppm) in polyglycine appears at a lower field by 11 ppm than the 3 1 -helix form ( δ iso =293 ppm) is reasonably explained by the chemical shift calculations. The experimental finding that the α -helix form ( δ iso =319 ppm) in poly( L -alanine) appears at a lower field by 33 ppm than the β -sheet form ( δ iso =286 ppm) also agrees with the chemical shift calculations on N -acetyl- N ′-methylglycineamide.

Furthermore, we are concerned with the experimental 17 O chemical shift tensor components ( δ 11, δ 22 and δ 33 ) for the Gly residues of the Gly-containing peptides (GlyGly and GlyGly·HNO 3 ) and polyglycine. It has been shown that all of the tensor components move to a high field with a decrease in R N···O . 60 However, the hydrogen bond length dependence of the calculated chemical shift tensor components of the Gly carbonyl oxygen for the model molecule system of N -acetyl- N ′-methylglycine amide hydrogen bonded with two formamide molecules shows that all of the tensor components move largely downfield with an increase in R N···O . This qualitatively explains the experimental trend.

The plots of the experimental e 2 qQ / h values for the Gly residues of the Gly-containing peptides (GlyGly and GlyGly·HNO 3 ) and polyglycine against the hydrogen bond length show that the e 2 qQ / h values decrease linearly with a decrease in R N···O . This relationship can be expressed by e 2 qQ / h (MHz)=5.15+1.16 R N···O (Å). 61 Such a change results from a change in the q values, which are the largest component of the electric gradient tensor (V 33 ). This result shows that the decrease in the hydrogen bond length leads to the decrease of electric gradient. The q value seems to be very sensitive to changes in the hydrogen bonding length.

As mentioned above, it has been shown that the significance of solid-state 17 O NMR studies has been revealed in the deeper understanding of the hydrogen-bonded structure of solid biopolymers.

Isotropic 1 H chemical shifts

In addition to the 13 C, 15 N and 17 O NMR studies on the hydrogen-bonded structure, it may be significant to clarify whether there is a relationship between the amide 1 H NMR chemical shift and the hydrogen bond length R N···O for peptides and polypeptides in the solid state, and also whether this is supported by theoretical calculations because this information could lead to further elucidation of the hydrogen-bonded structure. However, before doing this experiment, we must overcome some technical NMR problems. For example, it is necessary to reduce the large dipolar interaction between the proton nuclei to obtain a small linewidth. The CRAMPS method is one of the solutions to obtain a 1 H NMR spectrum with a reasonable resolution. To obtain a high-resolution 1 H NMR spectrum for peptides and proteins in the crystalline state, there are some reports in which a combination of MAS and CRAMPS techniques is used. 71, 72 However, the CRAMPS method requires a slow MAS speed for sampling the data points during acquisition (for example, the BR24 multi-pulse sequence needs less than approximately 3 kHz for sampling). The spinning rate of 3 kHz is not enough to provide a high-resolution 1 H NMR spectrum to analyze the amide proton chemical shift in peptides and polypeptides because the amide proton is directly bonded to the quadrupolar 14 N nucleus. As reported by McDermott et al. , 101, 102 amino acids take up NH 3 + forms, so the quadrupolar effect on the proton linewidth by the 14 N becomes very small because of its high symmetry. Therefore, the NH 3 + proton linewidth in the amino acids become much sharper than that of amide protons in the peptides and polypeptides considered here.

Let us consider the relationship between the R N···O and the hydrogen-bonded amide 1 H chemical shift data obtained from high-resolution 1 H NMR spectra of hydrogen-bonded Gly-containing peptides and polypeptides in the solid state. The 1 H NMR spectra was obtained at a high MAS speed of 30 kHz and a high frequency of 800 MHz for the removal of the dipolar coupling and quadrupolar coupling with amide 14 N. 73 The 1 H MAS NMR spectra of Gly-containing peptides and polyglycine show that the amide proton, α -proton and side-chain protons are straightforwardly assigned because their peaks are clearly resolved from each other. The amide 1 H chemical shift must be carefully assigned. By using an NMR technique to measure the high-resolution solid-state 1 H NMR designed with the FSLG-2 homonuclear dipolar decoupling method 103, 104, 105, 106 combined with high-speed MAS, the high-resolution solid-state 1 H NMR spectra of amino acids, peptides and polypeptides have been obtained with more reasonable resolution for the amide 1 H signals. The chemical shifts of the amide 1 H provide information about the hydrogen-bonded structure, compared with other high-resolution solid-state 1 H NMR methods. 74 The determined Gly amide 1 H chemical shift values of peptides and polypeptides in the solid state were plotted against the R N···O as determined from X-ray diffraction (not shown), and the amide 1 H chemical shifts moved downfield with a decrease in R N···O . The relation between the amide 1 H chemical shifts ( δ H ) and the R N···O was determined to be δ H =25.4–5.9 R N···O (ppm). Therefore, by observing the amide 1 H chemical shift value, the value of R N···O can be determined. Furthermore, the ab initio MO calculation and the neutron diffraction data show that the reduction of R N···O leads to a decrease in the hydrogen bond length (R O···H ) between the amide hydrogen and the amide carbonyl oxygen. 96 Thus, the 1 H chemical shifts move downfield with a decrease in R O···H . The isotropic 1 H chemical shifts and the tensor components of hydrogen-bonded Gly amide protons of two hydrogen-bonded GlyGly molecules were also calculated by using the Gaussian 96 program with the ab initio 6–31 G** basis set by changing R N

,

O from 3.5 to 2.6 Å according to its crystal structure as determined by X-ray diffraction. 107 The calculated chemical shifts move downfield by 2.5 ppm from 6.9 to 9.4 ppm as R N···O is decreased from 3.30 to 2.72 Å, and the calculation qualitatively explains the experimental results. However, quantitative agreement was not obtained. This may be because, strictly speaking, the position of the amide proton in the >NH···O=C< hydrogen bond depends on R N

,

O, 95 but in this calculation the NH bond length was fixed at 1.0 Å.

Shoji et al. 108 have determined the hydrogen-bonded amide NH bond lengths of poly( L -alanine)s with the α -helix and β -sheet forms by analyzing the 1 H CRAMPS NMR spectra of fully 15 N-labeled poly( L -alanine)s in the solid state. The NH dipolar spinning sideband pattern of α -helical poly( L -alanine) is different from that of β -sheet poly( L -alanine). The sideband pattern is characteristic of the NH bond length. From the sideband pattern analysis, the NH bond lengths for the α -helix and β -sheet forms of poly( L -alanine) were determined to be 1.09 and 1.12 Å, respectively. It was shown that the NH bond length of the former is shorter than that of the latter.

Finally, the author would like to note that this review was given as an oral presentation at the Commemorative 30th Anniversary Meeting of the NMR Research Group of the Society of Polymer Science, Tokyo, Japan, December 8 and 9, 2011.