Umlčanie slimákov účinne potláča rast nádoru a invazívnosť onkogén

Umlčanie slimákov účinne potláča rast nádoru a invazívnosť onkogén

Anonim

abstraktné

Transkripčný faktor Snail bol nedávno navrhnutý ako dôležitý mediátor nádorovej invázie kvôli jeho úlohe pri znižovaní hladiny E-kadherínu a indukcii epitelových mezenchymálnych prechodov (EMT). Toto správanie viedlo k zváženiu snail ako potenciálneho terapeutického cieľa na blokovanie progresie nádoru. V tejto správe uvádzame dôkazy pre túto hypotézu. Ukazujeme, že umlčanie slimáka stabilnou RNA interferenciou v bunkách MDCK-slimák indukuje kompletný mezenchymálny na epitelový prechod (MET), spojený s upreguláciou E-kadherínu, downreguláciou mezenchymálnych markerov a inhibíciou invázie. Ešte dôležitejšie je, že stabilná interferencia endogénneho slimáka v dvoch nezávislých bunkových líniách karcinómu vedie k dramatickému zníženiu rastu nádoru in vivo , sprevádzanému zvýšenou diferenciáciou nádoru a výrazným znížením expresie MMP-9 a angiogénnych markerov a invazívnosťou. Tieto výsledky naznačujú, že použitie RNA interferencie môže byť účinným nástrojom na blokovanie funkcie slimáka, čím sa otvára cesta pre jeho aplikáciu v nových antiinvazívnych terapiách.

úvod

Udržiavanie stabilných kontaktov bunka - bunka a polarita buniek sú základnou požiadavkou na funkčnosť a homeostázu epitelových tkanív v organizme dospelých. Táto prísna organizácia tkanív sa stráca počas progresie epitelových nádorov (karcinómy) a je obzvlášť zrejmá v štádiu invázie (Behrens a kol., 1992; Stetler-Stevenson a kol., 1993). Počas invazívneho procesu nádorové bunky nielen strácajú svoje adhézne vlastnosti bunka-bunka, ale často podstupujú aj zásadné zmeny vo svojom fenotype známom ako epitelové mezenchymálne prechody (EMT) (Behrens et al., 1992; Christofori a Semb, 1999), a proces pripomínajúci EMT vyskytujúci sa v určených fázach vývoja (Nieto, 2002; Thiery, 2002). Komplexy E-kadherín / katenín predstavujú hlavný adhézny systém zodpovedný za udržiavanie kontaktov bunka-bunka v epitelových tkanivách (Takeichi, 1995; Huber a kol., 1996). K zníženiu expresie E-kadherínu alebo k funkčným poruchám komplexov E-kadherín / katechín často dochádza pri progresii karcinómov (Takeichi, 1993; Birchmeier a Behrens, 1994; Christofori a Semb, 1999) a je s progresiou spojená len náhodne. adenómu na invazívny karcinóm (Perl et al., 1998). Molekulové bázy down-regulácie E-kadherínu počas progresie nádoru sa začali objasňovať v posledných rokoch. Tento dôkaz naznačuje, že umlčanie expresie E-kadherínu môže zahŕňať genetické a epigenetické zmeny. Medzi nimi sa vo väčšine karcinómov objavila hypermetylácia promótora E-kadherínu a transkripčná represia (Christofori a Semb, 1999; Peinado a kol., 2004a). V posledných rokoch bolo niekoľko transkripčných faktorov charakterizovaných ako represory E-kadherínu pôsobiace prostredníctvom ich interakcie s proximálnymi E-boxmi ľudských alebo myších promótorov (Batlle a kol., 2000; Cano a kol., 2000; Grooteclaes a Frisch)., 2000; Comijn a kol., 2001; Perez-Moreno a kol., 2001; Hajra a Fearon, 2002; Bolos a kol., 2003; Yang a kol., 2004). Spomedzi týchto faktorov hrá hlavnú úlohu pri spúšťaní EMT pri vývoji rôznych druhov z Drosophily na cicavce faktor slimáka zo slimáka z transkripčných represorov slimáka (zhrnuté v Nieto, 2002). Slimák indukuje plný EMT, keď je nadmerne exprimovaný v epitelových bunkách obličiek psieho psa Madin Darby (MDCK), čo vedie k získaniu motilného / invazívneho fenotypu (Cano a kol., 2000; Peinado a kol., 2004b). V zhode s touto úlohou sa tiež zistilo, že Snail (tiež známy ako Snail1) down-reguluje expresiu ďalších epitelových génov, ako je oklúzia, klaudíny alebo mu1 (Guaita a kol., 2002; Ikenouchi a kol., 2003; Ohkubo a Ozawa, 2004; Martinez-Estrada a kol., 2005) alebo na indukciu expresie mezenchymálnych a invazívnych génov, ako je fibronektín a metaloproteináza (MMP) -9 (Cano a kol., 2000; Guaita a kol., 2002; Jorda) a kol., 2005). Expresia slimákov bola zistená pri rastúcom počte rôznych bunkových línií ľudského karcinómu a melanómu (prehľad v Peinado et al., 2004a). Ešte dôležitejšie je, že slimák je exprimovaný na invazívnej fronte epidermoidných karcinómov (Cano a kol., 2000) a bol asociovaný so stavom lymfatických uzlín a / alebo invazívnosťou duktálnych karcinómov prsníka a hepatokarcinómov (Blanco a kol., 2002; Sugimachi et. al., 2003) a na miestny výskyt nádorov prsníka (Moody et al., 2005). Okrem toho sa ukázalo, že expresia slimákov poskytuje rezistenciu voči bunkovej smrti sprostredkovanú niekoľkými faktormi a chemoterapeutikami (Kajita a kol., 2004; Vega a kol., 2004). Tieto dôkazy podporujú kľúčovú úlohu slimáka ako induktora invázie nádoru a tiež potenciálne prispievajú k mechanizmom rastu nádoru a / alebo chemorezistencie, čím poskytujú nový terapeutický cieľ.

V tejto správe sme skúmali, či môže byť funkcia slimáka blokovaná expresiou RNA interferenčných oligonukleotidov špecifických pre slimák stabilne v nádorových bunkových líniách. Uvádzame dôkazy, že stabilné tlmenie expresie slimákov pomocou interferónu s malou vlásenkou (shRNA) účinne derepresuje expresiu E-kadherínu a vedie k úplnému mezenchymálnemu prechodu na epitel (MET) v bunkovom systéme MDCK-Slimák. Dôležité je, že stabilná expresia shSnail v bunkových líniách karcinómu s vysokými hladinami endogénneho slimáka vedie k dramatickej inhibícii rastu nádoru a invazívnosti. Tieto výsledky môžu otvoriť cestu terapeutickým prístupom založeným na použití RNAi oligonukleotidov špecifických pre Snail ako nových protirakovinových stratégií.

výsledok

Interferencia slimáka derepresuje aktivitu E-kadherínového promótora

My a iní sme už skôr uviedli, že Snail indukuje silnú represiu proximálneho E-kadherínového promótora v MDCK a ďalších epitelových bunkových líniách buď po prechodnej alebo stabilnej transfekcii (Batlle a kol., 2000; Cano a kol., 2000). Stabilná expresia slimákov v MDCK bunkách nielen potláča E-kadherínový promótor, ale tiež indukuje úplnú EMT, sprevádzanú invazívnym správaním in vitro a in vivo (Cano a kol., 2000; Peinado a kol., 2004b).

Pôvodne sme použili MDCK-Snail bunkový systém, aby sme dokázali, že siRNA oligonukleotidy špecifické pre Snail sú užitočné na zrušenie jeho transkripčného účinku, ako aj jeho funkcie v EMT a invázii. Navrhli sme 19-mérový siRNA oligonukleotid nasmerovaný do N-terminálnej oblasti prvého prsta so zingom myšej Snail mRNA (poloha od 573 do 591 v myšej cDNA; Jorda a kol., 2005). Dôležité je, že táto špecifická nukleotidová sekvencia je konzervovaná medzi sekvenciami mRNA myší a ľudských slimákov (580 - 598 v ľudskej cDNA, prírastkové číslo NM005985), ale nie je prítomná v Slug (tiež známej ako Snail2 ) mRNA žiadneho druhu (Sefton et al., 1998; Manzanares a kol., 2001). Účinnosť shSnail bola testovaná analýzou aktivity E-kadherínu v MDCK a MDCK-Snail bunkách a porovnaná s aktivitou E-kadherínu v MDCK-Snail-EGFP bunkách prechodne transfekovaných shEGFP (Caplen et al., 2001). Výsledky naznačujú, že shSnail aj shEGFP účinne zmierňujú represiu E-kadherínového promótora sprostredkovaného slimákom a Snail-EGFP v MDCK bunkách (doplnkové obrázky S1 a S2). Analýza E-kadherínového promótora s použitím homológneho Slugovho faktora potvrdila, že navrhnutý shSnail bol skutočne špecifický pre činnosť Slimáka, pretože prítomnosť shSnailu neovplyvnila Slugom sprostredkovanú represiu E-kadherínového promótora (doplnkový obrázok S2C).

Stabilné tlmenie expresie slimákov pomocou shRNA účinne derepresuje expresiu E-kadherínu a vedie k MET

Po zistení špecifickosti a účinnosti navrhnutého shSnailu v derepresii aktivity E-kadherínového promótora sa snažíme analyzovať jeho účinok po stabilnej expresii v bunkách exprimujúcich slimák. Na tento účel sa vektor shSnail stabilne transfekoval v dobre charakterizovanom bunkovom systéme MDCK-Snail (Cano a kol., 2000; Bolos a kol., 2003; Peinado a kol., 2004b). Vykonali sa aj paralelné štúdie s bunkami MDCK-Snail-EGFP, ktoré boli stabilne transfekované buď vektormi shEGFP alebo shSnail. Z každej transfekcie sa izolovalo desať až 20 klonov a výsledky troch reprezentatívnych nezávislých klonov z každého nastavenia sú uvedené na nasledujúcich obrázkoch.

Účinnosť interakcie Snail v stabilných klonoch bola stanovená pomocou semikvantitatívnej reverznej transkriptázovej-polymerázovej reťazovej reakcie (RT – PCR). Ako je znázornené na obrázku la a doplnkovom obrázku S3A, bola vo všetkých analyzovaných nezávislých klonoch pozorovaná buď úplná neprítomnosť alebo veľmi nízke hladiny (<10% oproti zodpovedajúcej kontrole) mRNA slimáka , zatiaľ čo kontrolné bunky MDCK-slimák transfekované shEGFP vykazovali hladiny slimáka transkripty podobné transkriptom rodičovských buniek MDCK-Snail a MDCK-Snail-EGFP (obrázok la a doplnkový obrázok S3A, stredné panely). Analýza hladín mRNA E-kadherínu ukázala robustnú expresiu transkriptu E-kadherínu vo všetkých nezávislých klonoch so stíšenou expresiou slimáka (obrázok la a doplnkový obrázok S3A, horné panely), čo potvrdzuje a rozširuje naše nedávne výsledky (Jorda et al., 2005). Reexpresia E-kadherínu po interferencii slimáka v jednotlivých klonoch bola ďalej potvrdená na proteínovej úrovni, ako bolo stanovené Western blotom (obrázok 1b a doplnkový obrázok S3B) a imunofluorescenčnou analýzou (obrázok 2, panely E-CD).

Image

Mlčanie slimákov indukuje opätovnú expresiu E-kadherínu a zníženie regulácie mezenchymálnych markerov. Charakterizácia klonov získaných po stabilnej transfekcii shSnail v MDCK-Snail a MDCK-Snail-EGFP bunkách. a ) RT-PCR analýza hladín mRNA myšieho slimáka a psieho E-kadherínového (dE-CD) v MDCK-mocku, buniek MDCK-slimáka a troch nezávislých stabilných klonov po transfekcii shRNA z každého experimentálneho nastavenia. Bunky MDCK stabilne transfekované shSnail (MDCK-shSnail) a shEGFP (MDCK-shEGFP) a bunky MDCK-Snail transfekované shEGFP sú zahrnuté ako kontroly (tri najviac pravé panely). Hladiny GAPDH mRNA sú zobrazené ako kontrola náboja. b ) Western blot analýza hladín epiteliálneho markera E-kadherínu (dE-CD) a mezenchymálnych markerov fibronektínu a vimentínu v nezávislých klonoch a kontrolných bunkách uvedených v bode a ). a- Tubulín je znázornený ako kontrola plnenia.

Obrázok v plnej veľkosti

Image

Mlčanie slimákov vyvoláva MET. Imunofluorescenčné analýzy hladín a subcelulárnej lokalizácie E-kadherínu (E-CD, zelená), fibronektínu (FN, červená) a vimentínu (VN, fialová) v kontrolnej vzorke (MDCK-falošný, MDCK-Snail) a jedného reprezentatívneho klonu získaného po stabilná transfekcia shSnail v bunkách MDCK-Snail. Všetky analyzované klony vykazovali podobné správanie. Zlúčené obrázky (panely pravého stĺpca) zahŕňajú farbenie DNA (modré). Na ľavých paneloch sú zobrazené obrázky fázového kontrastu každého typu bunky pestované pri podobnom sútoku. Tyčinky, 20 um .

Obrázok v plnej veľkosti

Dôležité je, že stabilná interferencia slimáka získaná v systémoch MDCK-Snail / MDCK-Snail-EGFP, okrem reaktivácie expresie E-kadherínu, tiež indukuje významné zmeny mezenchymálnych markerov, pretože expresia fibronektínu a vimentínu bola vo všetkých analyzovaných vzorkách silne znížená klony s účinnou interferenciou slimáka alebo slimáka-EGFP (obrázok 1b a doplnkový obrázok S3B a údaje nie sú uvedené), podporujúce pleiotropnú úlohu slimáka pri kontrole epiteliálnych a mezenchymálnych markerov (Nieto, 2002; Thiery, 2002). V súlade so zmenami pozorovanými v E-kadheríne a mezenchymálnych proteínoch účinné umlčanie slimáka vyvolalo dramatickú zmenu vo fenotype buniek MDCK-Slimák / MDCK-Slimák-EGFP s obrátením na epitelovú morfológiu pozorovanú vo všetkých vybraných klonoch. (Obrázok 2, obrázky s fázovým kontrastom a údaje nie sú zobrazené). Imunofluorescenčná analýza E-kadherínu a mezenchymálnych markerov jasne potvrdzuje MET, ktorý utrpeli všetky klony po interferencii slimákov (obrázok 2). Morfologický fenotyp a organizácia naznačených markerov v nezávislých klonoch so stabilnou interferenciou slimáka bola skutočne takmer nerozoznateľná od toho, ktorý vykazovali kontrolné MDCK-falošné bunky (obrázok 2, porovnajte hornú a dolnú radu panelov). Dôležité je, že zvrátenie fenotypu bolo tiež pozorované po umlčaní fúzie Snail-EGFP pomocou shEGFP (údaje nie sú uvedené), čím sa vyradili nešpecifické účinky použitého oligonukleotidu RNAi.

Stabilné tlmenie slimáka inhibuje pohyblivé a invazívne správanie buniek MDCK-Slimák

Ďalej sme skúmali, či MET indukovaný umlčaním slimákov ovplyvnil aj pohyblivé a invazívne správanie buniek MDCK-slimákov. Testy hojenia rán klonov MDCK-shSnail a MDCK-falošných klonov jasne naznačujú, že umlčanie slimákov má za následok výrazné zníženie náhodnej motility buniek slimáka (údaje nie sú uvedené). Invazívne správanie rôznych bunkových klonov odvodených od MDCK sa analyzovalo v trojrozmerných kultúrach kolagénu typu I. Ako je znázornené na obrázku 3, bunky MDCK-Snail vykazujú po 1 týždni kultivácie vysoko infiltratívne správanie, ktoré vykazuje hojnú expresiu vimentínu a úplnú neprítomnosť E-kadherínu (obrázok 3, stredné panely), v súlade s našou predchádzajúcou analýzou (Peinado et al. ., 2004b). Keď však došlo k interferencii Snail, bunky rástli ako monovrstva neinfiltrovaných polarizovaných epiteliálnych buniek, ktoré exprimovali E-kadherín na bazolaterálnej membráne (obrázok 3, spodné panely), a tak vykazovali správanie nerozoznateľné od kontrolných MDCK-shSnail alebo MDCK-zosmiešňovaných bunky (obrázok 3, horné panely a údaje nie sú zobrazené). Celkovo tieto výsledky jasne preukazujú účinnú blokádu bunkovej invázie stabilným slimákom slimákov v bunkovom systéme MDCK-slimáky.

Image

Blokovanie expresie slimákov inhibuje inváziu v trojrozmerných kolagénových kultúrach. Invazia na trojrozmerných kolagénoch typu I kontroly (MDCK-shSnail, MDCK-Snail) a MDCK-Snail-shSnail-C3 sa uskutočňovala podľa popisu v materiáli a metódach a nechala sa rásť počas 1 týždňa. Imuofluorescenčná analýza E-kadherínu (E-CD; zelená) a vimentínu (VN; červená) sa uskutočňovala na rezoch kryostatu 8 um ; jadrá sa zafarbili DAPI (modrá). Vložky zobrazujú obrázky s vysokým výkonom, ktoré ilustrujú organizáciu E-kadherínu v kontrolných bunkových líniách MDCK-shSnail a MDCK-Snail-shSnail-C3. Podobné výsledky sa získali v dvojtýždňovej kultúre. Tyčinky, 50 um .

Obrázok v plnej veľkosti

Interferencia endogénneho slimáka v bunkách karcinómu ovplyvňuje markery EMT a vedie k zníženej invazívnosti

Účinnosť navrhnutého shSnailu na blokovanie endogénnej expresie slimáka sa analyzovala v bunkách karcinómu. Vybrali sme dve bunkové línie myšieho epidermálneho karcinómu odvodené od spinocelulárneho karcinómu (HaCa4) a karcinómu vretenových buniek (CarB), ktoré sme predtým značne charakterizovali ako nedostatočné v E-kadheríne, ktoré exprimujú vysoké hladiny slimákov a slimákov a vykazujú vysoko invazívne., tumorigénne a metastatické správanie (Navarro a kol., 1991; Llorens a kol., 1998; Cano a kol., 2000). Po transfekcii každej bunkovej línie s shSnail sa izolovalo a charakterizovalo päť až 10 stabilných klonov (nazvaných HaCa4-shSnail a CarB-shSnail). Ako negatívne kontroly bola každá rodičovská bunková línia tiež transfekovaná shEGFP (HaCa4-shEGFP a CarB-shEGFP). RT-PCR analýzy ukázali účinnosť tlmenia slimákov v nezávislých klonoch odvodených po transfekcii shSnail v bunkách HaCa4 alebo CarB (obrázok 4a, slimáky), čo demonštruje celkovú stratu expresie slimákov dosiahnutú v nezávislých klonoch. Bola preukázaná aj špecificita interakcie slimákov, pretože v klonoch odvodených od shSnail z ktorejkoľvek bunkovej línie neboli v porovnaní s ich zodpovedajúcimi rodičovskými a kontrolnými bunkami detegované žiadne významné zmeny v hladine endogénnej Slug mRNA (obrázok 4a, Slugove panely). Po tomto potvrdení sme sa zamerali na expresiu niekoľkých mezenchymálnych markerov, ako napríklad fibronektínu a vimentínu, ktoré sa významne znížili v klonoch CarB-shSnail (obrázok 4b), čo naznačuje, že niektoré z markerov spojených s EMT sú priamo ovplyvnené umlčaním slimákov v CarB bunky. Dôležité je, že reexpresia E-kadherínu na úrovni mRNA bola tiež detekovaná v klonoch HaCa4-shSnail (Obrázok 4a, horný panel). Analýza aktivity promótora E-kadherínu v skutočnosti naznačila reaktiváciu promótora až 60-násobne v klonoch HaCa4-shSnail a sedemkrát v klonoch CarB-shSnail v porovnaní s ich príslušnými rodičovskými a kontrolnými bunkami (údaje nie sú uvedené). Imunofluorescenčná analýza fibronektínu ukázala zníženú expresiu a / alebo organizáciu na bunkovom povrchu klonov CarB-shSnail; v klonoch odvodených od shSnail z HaCa4 alebo CarB buniek však nemohla byť detegovaná žiadna expresia proteínu E-kadherínu (doplnkový obrázok S4). V súlade s týmito pozorovaniami sa zistili menšie zmeny vo fenotype buniek získaných z shSnail v porovnaní s kontrolnými bunkami: rozšírenejšia morfológia klonov CarB-shSnail a mierne kompaktnejšia organizácia klonov HaCa4-shSnail (doplnkový obrázok S4, obrázky s fázovým kontrastom). Tieto výsledky naznačujú, že sú potrebné ďalšie mechanizmy na udržanie stabilnej expresie E-kadherínu v kultúre in vitro ; táto situácia však môže byť prekonaná v podmienkach nádoru in vivo (pozri nižšie).

Image

Karbonizácia stabilných klonov získaných po stabilnej expresii shEGFP alebo shSnail v bunkách HaCa4 a CarB. ( a ) RT-PCR analýza hladín mRNA myší E-kadherín , slimák a slimák v kontrolných bunkách HaCa4 (ľavý panel) a CarB (pravý panel) a uvedených stabilných klonov získaných po expresii shSnail (HaCa4-shSnail a CarB-shSnail) ) alebo kontrolný shEGFP (HaCa4-shEGFP a CarB-shEGFP). Hladiny GADPH sú zobrazené ako kontrola plnenia. b ) Western blot analýza mezenchymálnych markerov fibronektínu a vimentínu v bunkových líniách opísaných v bode a ). a- Tubulín je znázornený ako kontrola plnenia.

Obrázok v plnej veľkosti

Nedávno sme uviedli, že umlčanie slimákov v bunkách MDCK-Snail účinne potláčalo expresiu a sekréciu MMP-9 (Jorda et al., 2005). Preto sme analyzovali, či stabilné umlčanie slimákov v bunkových líniách karcinómu HaCa4 a CarB bolo schopné ovplyvniť expresiu MMP-9. Ako je znázornené na obrázku 5a, aktivita myšieho promótora MMP-9 bola dramaticky znížená vo všetkých klonoch HaCa4 a CarB-shSnail v porovnaní s rodičovskými a kontrolnými bunkami. V zhode s týmito výsledkami HaCa4-shSnail alebo CarB-shSnail bunky vykazovali silne zníženú aktivitu sekretovaného MMP-9 v porovnaní s kontrolami (obrázok 5b). Aktivita MMP-2 bola detegovaná v kondicionovanom médiu buniek CarB a nebola ovplyvnená umlčaním slimákov. Neprítomnosť MMP-2 aktivity bola pozorovaná v bunkách HaCa4 (a odvodených klonoch), ako bolo predtým opísané pre tento bunkový systém (Llorens et al., 1998). Nakoniec sa analyzoval biologický účinok umlčania slimákov v invazívnych vlastnostiach, uskutočňovali sa transwell testy na kolagénoch typu IV gélov. Klony HaCa4-shSnail aj CarB-shSnail vykazovali silne zníženú invazívnu kapacitu in vitro v porovnaní s rodičovskými a kontrolnými bunkami (obrázok 5c). Tieto výsledky spolu naznačujú, že blokáda endogénnej expresie slimákov v rakovinových bunkách ovplyvňuje expresiu niektorých markerov EMT a silne znižuje ich invazívnu kapacitu bez ohľadu na expresiu úzko príbuzného Slugovho faktora.

Image

Analýza expresie MMP-9 a invazívneho fenotypu v bunkách HaCa4-shSnail a CarB-shSnail. ( a ) Analýza aktivity promótora MMP-9 v kontrolných bunkách HaCa4 (ľavý panel) a CarB (pravý panel) a v uvedených stabilných klonoch získaných po expresii shSnail (HaCa4-shSnail a CarB-shSnail) alebo kontrolného shEGFP (HaCa4- shEGFP a CarB-shEGFP). Výsledky ukazujú priemer ± sd štyroch nezávislých testov uskutočnených na duplikátnych vzorkách. ANOVA analýza: *** P <0, 001. ( b ) Zymografické testy aktivity sekretovanej MMP-9 uskutočňované na kondicionovanom médiu získanom z buniek opísaných v ( a ). Aktivita MMP-2 je uvedená ako kontrola. ( c ) Analýza invazívneho fenotypu kontrolných bunkových línií a klonov opísaných v bode ( a ), vykonaná na priechodných filtroch (0, 8 μm pórov) potiahnutých matricou kolagénu typu IV. Bunky do dolnej komory sa spočítali 24 hodín po nasadení. Výsledky ukazujú priemer ± sd z troch nezávislých testov. ANOVA analýza: ** P <0, 01; *** P <0, 001.

Obrázok v plnej veľkosti

Interferencia slimákov v bunkách karcinómu dramaticky znižuje rast nádoru a ovplyvňuje diferenciáciu nádorov

Aby sme získali ďalšie informácie o biologickej relevantnosti interakcie slimákov, analyzovali sme jeho vplyv na tumorigénne vlastnosti buniek HaCa4 a CarB. Dva nezávislé klony odvodené od shSnail z CarB a päť z buniek HaCa4 sa injikovali nahým myšiam paralelne s rodičovskými a kontrolnými bunkami odvodenými od shEGFP. Všetky klony odvodené od HaCa4-shSnail a CarB-shSnail tvorili primárne nádory na všetkých miestach injekcie, podobné rodičovským a kontrolným bunkám. Nádory indukované bunkami HaCa4-shSnail a CarB-shSnail však rástli oveľa pomalšie ako nádory indukované rodičovskými alebo kontrolnými bunkami (obrázok 6a). 60% zníženie objemu nádorov indukovaných bunkami CarB-shSnail sa detegovalo 17 dní po injekcii (obrázok 6a, pravé panely). Predovšetkým bolo pozorované 95% zníženie objemu nádoru 12 dní po injekcii do všetkých analyzovaných klonov HaCa4-shSnail (obrázok 6a, ľavý panel), čo je zvlášť dôležité vzhľadom na extrémne agresívne správanie rodičovskej bunkovej línie HaCa4 (Navarro et al., 1991; Llorens a kol., 1998). Tieto výsledky ukazujú, že umlčanie endogénneho slimáka silne ovplyvňuje tumorigénne správanie rakovinových buniek.

Image

Stlmenie slimáka silne znižuje tumorigénny potenciál buniek HaCa4 a CarB a vedie k in vivo expresii E-kadherínu. ( a ) Nádorový potenciál HaCa4 (ľavý panel) a CarB buniek (pravý panel) a uvedených stabilných klonov získaných po expresii shSnail (HaCa4-shSnail a CarB-shSnail) alebo kontrolného shEGFP (HaCa4-shEGFP a CarB-shEGFP) sa analyzovala subkutánnou injekciou do nahých myší. ANOVA analýza: * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001. b ) RT – PCR analýza m slimáka a m E-kadherínu (mE-CD) vykonaná na vzorkách RNA izolovaných z jednotlivých nádorov generovaných bunkami HaCa4 (ľavé panely) alebo CarB (pevné panely) a uvedených odvodených klonov. Hladiny GAPDH mRNA boli zahrnuté ako kontrola plnenia. Je ukázaná analýza RNA získaná z dvoch nezávislých nádorov indukovaných z každého typu bunky.

Obrázok v plnej veľkosti

RT-PCR analýza nádorov pochádzajúcich z rôznych bunkových línií ukázala, že transkripty slimáka zostali umlčané vo všetkých nádoroch pochádzajúcich z klonov shSnail (obrázok 6b, stredné panely). Je zaujímavé, že reexpresia transkriptov E-kadherínu vo vnútri nádorov bola skutočne detegovaná, ale iba v tých prípadoch, ktoré udržiavali Ticho umlčané: to znamená, že nebolo zistené v nádoroch pochádzajúcich z rodičovských a kontrolných bunkových línií s vysokou úrovňou expresie slimákov (Obrázok 6b, porovnajte horný a stredný panel), čo naznačuje, že umlčanie slimákov účinne derepresuje expresiu E-kadherínu v kontexte in vivo v bunkách CarB alebo HaCa4. Histologické a imunofarebné analýzy xenoimplantátov ďalej potvrdili biologický účinok blokády slimákov. Bunky HaCa4-shEGFP a CarB-shEGFP indukovali nádory s histologickými charakteristikami podobnými tým, ktoré boli indukované ich zodpovedajúcimi rodičovskými bunkami, stredne diferencovanými spinocelulárnymi karcinómami (obrázok 7a a e), respektíve vretenovými bunkami (obrázky 7c ag). Na rozdiel od toho nádory indukované bunkami HaCa4-shSnail vykázali významnú zmenu na diferencovanejší skvamózny bunkový fenotyp s rozsiahlymi oblasťami keratinizácie (obrázok 7b af), zatiaľ čo nádory indukované bunkami CarB-shSnail vykazovali fenotyp s menším počtom vretien (obrázok 7d a h). V súlade s histologickým vzorcom imunohistochemické farbenie xenoimplantátov HaCa4-shSnail vykazovalo bohaté oblasti s reexpresiou proteínu E-kadherínu dobre usporiadaného pri kontaktoch bunka - bunka, čo je zvlášť zrejmé v najviac diferencovaných oblastiach nádorov (obrázok 7j, pozri prílohu). Tento expresný vzorec pripomína štruktúru detegovanú v dobre diferencovaných spinocelulárnych karcinómoch myších kožných buniek, kde sa E-kadherín detekuje hlavne v diferencovaných suprabazálnych vrstvách (Navarro et al., 1991). Farbenie E-kadherínu sa detegovalo aj v rozptýlených oblastiach xenoimplantátov CarB-shSnail, hoci s difúznejším / cytoplazmatickejším obrazcom (obrázok 7l). Vzorec farbenia E-kadherínu pozorovaný v xenoimplantátoch HaCa4-shSnail bol v ostrom kontraste s neprítomnosťou E-kadherínu detegovaného v nádoroch indukovaných zodpovedajúcimi kontrolnými bunkami (obrázok 7i). Imunohistochemická analýza proliferačného markera Ki67 ukázala silne znížené zafarbenie v xenoimplantátoch odvodených od shSnail z ktoréhokoľvek typu buniek (obrázok 7n ap) v porovnaní s ich zodpovedajúcimi kontrolnými shEGFP xenoimplantátmi (obrázky 7m a o). Na ďalšiu charakterizáciu účinku interakcie slimákov vo fenotype nádoru sa uskutočnila imunofluorescenčná analýza mezenchymálnych a invazívnych markerov. Ako je znázornené na obrázku 8A, znížená expresia vimentínu bola detegovaná v oboch xenoimplantátoch HaCa4-shSnail (obrázok 8A (b)) a CarB-shSnail (obrázok 8A (d)) v porovnaní so zodpovedajúcimi kontrolami (obrázok 8A (a) a (c) ). Silná redukcia zafarbenia MMP-9 bola tiež detekovaná v nádoroch vyvolaných klonami HaCa4-shSnail (Obrázok 8A (f)) a CarB-shSnail (Obrázok 8A (h)) v porovnaní s ich zodpovedajúcimi kontrolami (Obrázok 8A (e) a (g) ). Kvantitatívna analýza RT-PCR potvrdila zníženie expresie vimentínu a MMP-9 na úrovni mRNA v rastúcich nádoroch vyvolaných bunkami HaCa4- a CarB-shSnail a silné zníženie hladín fibronektínovej mRNA v xenoimplantátoch HaCa4-shSnail (obrázok 8B). Nakoniec sa analyzoval angiogénny potenciál nádorov indukovaných klonami HaCa4-shSnail a CarB-shSnail stanovením expresie CD31. Je zaujímavé, že keď sa porovnávali nádory rovnakej veľkosti, stredná oblasť xenoimplantátov HaCa4-shSnail a CarB-shSnail vykázala dramatický pokles počtu CD31 pozitívnych buniek (obrázok 8A (j a l)) v porovnaní s centrálnymi oblasťami nádorov. indukované kontrolnými bunkami HaCa4-shEGFP a CarB-shEGFP (obrázok 8A (i) a (k)). Pozorované zmeny v expresii mezenchymálnych a invazívnych markerov na úrovni mRNA bolo možné pozorovať aj v klonoch HaCa4 a CarB-shSnail, keď rastú v kultúre in vitro (doplnkový obrázok S5).

Image

Zmiernenie slimáka indukuje nádory s diferencovanejším fenotypom a nízkym potenciálom proliferácie. Histologická analýza nádorov vyvolaných bunkami HaCa4-shEGFP, CarB-shEGFP a reprezentatívnymi klonmi HaCa4-shSnail (C11) a CarB-shSnail (C27) ( a - d ). Vysoko výkonné snímky histológie uvedených nádorov ( e - h ). Imunohistochemická analýza nádorových rezov na detekciu E-kadherínu (E-CD) ( i - l ; vložky ukazujú obrázky s vysokým výkonom zodpovedajúcich nádorov) a Ki67 ( m - p ). Pruhy 50 μm , okrem 20 μmv ( e - h ). Všimnite si dobre diferencovaný fenotyp xenotransplantátov indukovaných bunkami HaCa4-shSnail (C11) s hojnými oblasťami keratinizácie ( b, f ) a organizovaným E-keratínom pri kontaktoch bunka - bunka ( j, vložka). Pozri tiež silnú redukciu sfarbenia Ki67 v nádoroch vyvolaných bunkami odvodenými od shSnail ( n, p ).

Obrázok v plnej veľkosti

Image

Stlmenie slimáka indukuje nádory s nízkym invazívnym / angiogénnym potenciálom. ( A ) Imunofluorescenčná analýza nádorov indukovaných bunkami HaCa4-shEGFP, CarB-shEGFP a reprezentatívnymi klonmi HaCa4-shSnail (C11) a CarB-shSnail (C27) na detekciu vimentínu (a – d), MMP-9 (e –H) a CD-31 (i – l). Tyčinky, 50 um . ( B ) qRT – PCR analýza hladín mRNA mezenchymálneho fibronektínu (vľavo), vimentínu (stredná) a invazívnych markerov MMP-9 (vpravo) v uvedených nádoroch. Analyzovali sa dva rôzne nádory indukované každou bunkovou líniou a sú uvedené priemerné relatívne hodnoty ± sd.

Obrázok v plnej veľkosti

Na rozdiel od vyššie uvedených výsledkov nebolo možné detegovať žiadne významné rozdiely v apoptotickom indexe nádorov indukovaných bunkami odvodenými od shSnail a ich zodpovedajúca kontrola (údaje nie sú uvedené). Na druhej strane, v bunkách HaCa4-shSnail a CarB-shSnail neboli zistené žiadne zmeny v proliferačnom potenciáli in vitro alebo v apoptickej odpovedi na depriváciu séra vzhľadom na ich zodpovedajúce rodičovské alebo kontrolné bunkové línie (doplnkový obrázok S6). Celkovo tieto údaje naznačujú, že inhibícia rastu nádoru vyvolaná umlčaním slimákov v bunkách karcinómu HaCa4 a CarB sa môže sprostredkovať kombináciou pôsobenia na diferenciáciu a angiogénne vlastnosti nádorových buniek, čo je správanie, ktoré sa plne prejavuje v kontextoch in vivo . Nedá sa však vylúčiť, že účinok umlčania slimákov závisí od kontextu bunky, pretože v proliferácii buniek vyvolanej slimákom bol opísaný v určitých podmienkach in vivo (Vega a kol., 2004).

diskusia

EMT je nevyhnutný proces počas embryonálneho vývoja a progresie nádoru, ktorý umožňuje migráciu buniek z pôvodného epiteliálneho tkaniva alebo primárneho nádoru do susedných tkanív, a preto uprednostňuje niektoré bunkové procesy, ako je generovanie mezodermu v embryách alebo kolonizácia sekundárnych tkanív ( metastázy) nádorovými bunkami (Thiery, 2002). Strata E-kadherínu je charakteristickým znakom EMT a jeho význam počas progresie nádoru v posledných rokoch vedie k rastúcim poznatkom o molekulárnych mechanizmoch zapojených do jeho regulácie. Epigenetické zmeny, vrátane hypermetylácie promótora E-kadherínu a transkripčnej represie, sú hlavnými mechanizmami zapojenými do downregulácie E-kadherínu vo väčšine bunkových línií odvodených od karcinómu a karcinómu (Christofori a Semb, 1999; Peinado a kol., 2004a).

Medzi identifikovanými transkripčnými represormi E-kadherínu sa počas embryonálneho vývoja objavili ako dôležité regulátory EMT faktory rodiny slimákov (Nieto, 2002). Je dôležité, že expresia slimákov je spojená s downreguláciou E-kadherínu v mnohých rôznych bunkových líniách karcinómu a melanómu (revidované v Peinado et al., 2004a) a jeho expresia v primárnych nádoroch je spojená s invazívnymi oblasťami skvamóznych, prsných a hepatocelulárne karcinómy (Cano a kol., 2000; Blanco a kol., 2002; Sugimachi a kol., 2003). Tieto pozorovania spolu so schopnosťou slimáka indukovať úplné EMT a tumorigénne a invazívne vlastnosti, keď sú exprimované v epitelových bunkách (Cano a kol., 2000; Peinado a kol., 2004b), podporujú hlavnú úlohu slimáka pri indukcii invazivity., Preto môže byť Snail vhodným terapeutickým cieľom na ovplyvnenie procesu EMT a následne na blokovanie invázie nádoru.

Priamo sme sa priblížili k tomuto dôležitému problému analýzou účinku stabilného tlmenia slimákov shRNA v bunkách exprimujúcich slimáky. Použitím dvojitého prístupu, interferencie slimáka vyjadreného buď ako divoký typ alebo fúzna forma slimák-EGFP v bunkách MDCK, sme získali presvedčivé dôkazy o tom, že stabilné blokovanie expresie slimáka vedie k úplnej reverzii fenotypu, čo indukuje úplný MET proces. súvisí s reexpresiou E-kadherínu a súčasne s downreguláciou mezenchymálnych a invazívnych markerov, ako je MMP-9. Vplyv interakcie slimákov na expresiu E-kadherínu a MMP-9 sa vyskytuje na transkripčnej úrovni, pri ktorej dochádza k derepresii proximálneho E-kadherínového promótora a zníženiu aktivity promótora MMP-9 , v úplnom súlade so zverejnenou represiou vyvolanou slimákmi a aktiváciou oboch promótorov. (Batlle a kol., 2000; Cano a kol., 2000; Jorda a kol., 2005). Podľa týchto pozorovaní interferencia slimáka skutočne blokovala inváziu buniek MDCK-Slimák do trojrozmerných kultúr. Dôležité je, že rušenie slimákom tu používaným shSnailom je veľmi špecifické a vyskytuje sa bez ovplyvnenia homologického faktora zinok-prst Slug. Akútne podávanie shSnailu postačovalo na pozorovanie transkripčných účinkov faktora; to znamená zrušenie potláčania E-kadherínového promótora sprostredkovaného slimákmi (pozri doplnkové obrázky S1 a S2), ale neumožnilo pozorovať stabilnú fenotypovú transformáciu alebo dlhodobé biologické účinky umlčania slimákov.

Biologický význam špecifickej a stabilnej interakcie slimákov bol testovaný v dvoch bunkových líniách myšieho karcinómu, HaCa4 a CarB, ktoré vykazujú endogénnu expresiu slimáka a Sluga a veľmi agresívne tumorigénne, invazívne a metastatické správanie (Navarro a kol., 1991; Llorens a kol. ., 1998; Cano a kol., 2000). Získané výsledky naznačujú, že účinná a špecifická blokáda transkriptov slimáka bola dosiahnutá v oboch bunkových líniách karcinómu stabilnou expresiou navrhnutého shSnail bez ovplyvnenia expresie endogénnych Slugových transkriptov, čo bolo potvrdené analýzou piatich až 10 nezávislých klonov z každej bunkovej línie. Stabilná interferencia expresie slimákov v bunkách HaCa4 a CarB viedla k významným zmenám v expresii niekoľkých markerov spojených s EMT: aktivácia promótora E-kadherínu , znížená expresia vimentínu a fibronektínu na hladinách proteínov a mRNA a zníženie expresie MMP-9 a vylúčená aktivita. Dôležité je, že blokáda slimákov vedie k významnému zníženiu in vitro invazivity buniek HaCa4 a CarB. Zmiernenie slimákov preto narúša biologické vlastnosti karcinómových buniek, ktoré majú pre ich správanie in vivo potenciálny význam. Toto sa skutočne potvrdilo v testoch xenotransplantátu, pretože stabilné umlčanie slimákov v bunkách CarB a HaCa4 vedie k dramatickému zníženiu rastu nádorov vyvolaných obidvoma bunkovými líniami karcinómu (až 95% zníženie buniek HaCa4). Dôležité je, že pokles rastu nádoru je spojený s reexpresiou E-kadherínu a súbežne so zníženou proliferáciou buniek a zníženou expresiou markerov vimentínu, MMP-9 a CD31, čo vedie k diferencovanejšiemu fenotypu nádoru, čo je zvlášť zrejmé. v nádoroch vyvolaných klonami HaCa4-shSnail. Rozdiely pozorované pri indukcii expresie mRNA E-kadherínu po umlčaní slimákov v bunkách HaCa4 a CarB in vitro sa dajú vysvetliť viac dediferencovaným fenotypom buniek CarB a / alebo rozdielnym pôsobením iných represorov E-kadherínu (ako Slug alebo E47). ), ktorý by mal byť schopný udržiavať E-kadherín potlačený v kultúre, dokonca aj v neprítomnosti slimáka, v CarB bunkách. Napriek tomu sa vo vnútri nádorov môže reexpresia E-kadherínu dosiahnuť po umlčaní slimákov v bunkách CarB alebo HaCa4, čo naznačuje, že blokáda expresie slimákov môže účinne prekonať účinok iných E-kadherínových represorov v in vivo kontexte. Okrem expresie E-kadherínu sa ďalšie dôležité vlastnosti buniek získaných z shSnail, ako je znížená proliferácia a zvýšená diferenciácia, prejavujú iba v rastúcich nádoroch, ale nie v kultúre, čo naznačuje, že úplný biologický účinok umlčania slimákov musí byť silne ovplyvnený mikroprostredie nádoru. Je zaujímavé, že sme nedávno uviedli podobné správanie po umlčaní lyzyl oxidázy typu-2 (LOXL2), regulátora slimákov, v bunkách HaCa4 a CarB (Peinado a kol., 2005). Tieto pozorovania tiež vyžadujú potrebu in vivo štúdií na úplné stanovenie biologických účinkov interakcie slimákov alebo iných relevantných molekúl na progresiu nádoru.

Niektoré nedávne štúdie využili niekoľko siRNA duplexných oligonukleotidov proti Snail na vyhodnotenie účinku prechodného umlčania faktora a niektorých jeho transkripčných účinkov (Espineda a kol., 2004; Kajita a kol., 2004). Žiadna z predchádzajúcich štúdií však neanalyzovala účinok dlhodobého a účinného umlčania slimáka a jeho dôsledky in vivo , určite sa vyžaduje prístup na posúdenie potenciálu anti-slimákovej terapie. Pokiaľ je nám známe, je to prvýkrát, čo sa dosiahlo stabilné umlčanie expresie slimákov s vysokou účinnosťou interferenciou RNA v modelových bunkových systémoch, a čo je dôležitejšie, v bunkách karcinómu, čo umožňuje štúdium širokého spektra biologických účinkov sprostredkovaných Slimák, od transkripčnej kontroly po fenotypové, invazívne a tumorigénne vlastnosti. Je dôležité, že dramatické zníženie rastu nádoru pozorované po účinnom umlčaní endogénneho slimáka, ktoré sa tu uvádza prvýkrát, silne podporuje jeho potenciálne terapeutické použitie v ľudských karcinómoch s expresiou slimáka. Tieto výsledky môžu preto otvoriť nové možnosti skúmania nových spôsobov liečby rakoviny založených na použití a účinnom dodávaní reagencií Snail RNAi.

Materiály a metódy

Bunková kultúra

MDCK-II (imortalizované bunky psích epiteliálnych obličiek), karcinóm myšieho vretienka CarB a ich odvodené bunkové línie sa pestovali v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM); myšacie spinocelulárne bunky HaCa4 a odvodené bunkové línie boli pestované v HamF12 (Gibco BRL; San Diego, CA, USA). Všetky kultivačné médiá boli doplnené 10% FBS, 2 m ML-glutamínu a antibiotikami pri 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére 5% C02.

Generovanie expresných vektorov a stabilných bunkových línií

Generovanie expresných vektorov pcDNA3-Snail, Slug a Snail-EGFP bolo už predtým opísané (Cano a kol., 2000; Bolos a kol., 2003; Peinado a kol., 2005). Generácia shRNA, obsahujúca špecifické oligonukleotidové sekvencie proti EGFP (22nt) (Caplen a kol., 2001) alebo proti myši / ľudskému slimákovi (19nt: 5'-GATGCACATCCGAAGCCAC-3 '), klonovaná do vektora pSuperior-Puro (Oligoengine) bol nedávno opísaný (Jorda et al., 2005). Rôzne vektory sa transfekovali v uvedených bunkových líniách s použitím lipofektamínu (Gibco BRL) a stabilné transfektanty sa získali selekciou s vhodným antibiotikom počas 2 až 4 týždňov: Šnek-EGFPcDNA sa transfekoval v MDCK bunkách a selekciou 400 ug / ml G418. (Bunky MDCK-Snail-EGFP); Vektory pSuperior-Puro (falošný), pSuperior-shEGFP (shEGFP) a pSuperior-shSnail (shSnail) sa transfekovali do klonov MDCK, MCDK-Snail, izolovaných MDCK-Snail-EGFP, HaCa4 alebo CarB a selekcia sa uskutočňovala s 1 μg / ml puromycínu. Desať až 20 klonov sa izolovalo po transfekcii shRNA v oboch typoch buniek a individuálne sa charakterizovali alebo sa zhromaždili ako spojené klony pri kontrolných transfekciách. Pôvod a charakterizácia buniek MDCK-CMV, MDCK-Snail, HaCa4 a CarB boli už opísané (Navarro a kol., 1991; Llorens a kol., 1998; Cano a kol., 2000).

Analýza promótorov E-kadherínu a MMP-9

Proximálne myšie E-kadherín- Luc (-178 až +92) a myšacie MMP-9 -1170Luc (-1170 až +142) sa použili, ako už bolo opísané (Bolos et al., 2003; Jorda a kol., 2005 ). Cotransfekcie sa uskutočňovali v uvedených bunkových líniách a v neprítomnosti alebo prítomnosti uvedených množstiev expresných vektorov slimáka / slimáka a / alebo shSnailu alebo shEGFP. Luciferázové a renilné aktivity sa merali pomocou súpravy s duálnym luciferázovým reportérovým testom (Promega, Madison, WI, USA) a normalizovali sa na aktivitu promótora divokého typu detegovanú v simulovaných transfekovaných bunkách (s pcDNA3 alebo pSuperior-shEGFP).

RT – PCR a kvantitatívna RT – PCR (qRT – PCR)

Celková RNA sa izolovala z rôznych bunkových línií a RT-PCR analýzy sa uskutočňovali, ako už bolo opísané, s použitím špecifických primerov pre myší slimák , myš Slug a psie alebo myši E-kadherín , ako je uvedené, a GAPDH (Cano et al., 2000; Perez-Moreno a kol., 2001; Bolos a kol., 2003). RT-PCR nádorov sa uskutočňovala podľa nedávneho opisu po starostlivej disekcii nádorov (Peinado et al., 2005).

For qRT–PCR analysis, 2.5 μ g of total RNA from cells and tumours were used to synthesize cDNA using High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Fifty nanograms of cDNA was added to quantitative 2 × PCR master mix, which also contained SYBR green (Applied Biosystems) and 300 n M of each gene-specific primers. PCR was carried out at 60°C (annealing temperature) during 40 cycles using the following primers: mouse fibronectin, 5′-GATGCCGATCAGAAGTTTGG-3′, 5′-GGTTGTGCAGATCTCCTCGT-3′; mouse vimentin, 5′-CCAACCTTTTCTTCCCTGAA-3′, 5′-TGAGTGGGTGTCAACCAGAG-3′; mouse MMP-9, 5′-ACGACATAGACGGCATCCA-3′, 5′-GCTGTGGTTCAGTTGTGGTG-3'; mouse 18S-rRNA, 5′-CCAGTAAGTGCGGGTCATAAGC-3′, 5′-CCTCACTAAACCATCCAATCGG-3′ qRT–PCR was performed in triplicate samples and normalized to 18S rRNA using 348-well plates on a 7900HT Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems), according to the manufacturer's instructions.

Cell extracts and Western blot analysis

Whole-cell extracts were obtained using RIPA buffer (50 m M Tris-HCl pH 7.5, 150 m M NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulphate (SDS)), containing protein inhibitors. For Western blot analysis, 30 μ g of total protein from each sample were loaded on 7.5, 10 or 12% SDS–polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) gels. Transference, blocking and incubation with the appropriate antibodies was performed as described (Cano et al., 2000; Perez-Moreno et al., 2001; Bolos et al., 2003). The primary antibodies used included: mouse monoclonal anti- α -tubulin (1:1000) (Sigma Chemical Co) and anti-vimentin (1:2000) (Babco), rat monoclonal anti-E-cadherin (ECCD-2) (1:200) and rabbit polyclonal anti-fibronectin (1:4000) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA).

Želatínová zymografia

Gelatin zymography was performed as described (Llorens et al., 1998; Jorda et al., 2005). Briefly, cells were grown in normal growth media; serum-free media was placed on confluent cultures for 24 h to collect conditioned medium. Twelve micrograms of conditioned media were mixed with SDS sample buffer without reducing agent and fractionated on 7.5% SDS–PAGE gels containing 0.1% gelatin. The gels were incubated at 37°C after removing the SDS by washing with 2.5% Triton X-100-containing buffer. The gels were stained with Coomassie Brilliant Blue R250, and the gelatinolytic activities were detected as clear bands against a blue background.

Confocal immunofluorescence

Cells grown on glass cover slides were washed three times with phosphate-buffered saline (PBS) and fixed in 100% methanol (at −20°C) for 4 min and washed in PBS. Slides were incubated with the indicated primary antibodies at optimal dilution for 1 h, washed in PBS and incubated with the appropriate secondary antibody coupled to anti-mouse Alexa 488, anti-rabbit Alexa 648 or anti-rat FITC for 45 min. DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole) (Sigma Chemical Co.) was used for DNA stain. Confocal images were obtained with a Leica TCS SPII Spectral microscope and × 63/1.3 NA oil objective. Primary antibodies included: anti-vimentin (1:200), rat monoclonal anti-E-cadherin (ECCD-2) (1:50) and rabbit polyclonal antifibronectin (1:200).

Invasion assays

Invasion assays in three dimensional cultures on collagen gels were performed as previously described (Peinado et al., 2004b). Briefly, 1 × 10 6 cells were seeded onto collagen gels (type I) in filter-culture inserts (pore size 3.0 mm, polycarbonate; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). The cultures were immersed in DMEM and grown for the indicated time periods. Medium was completely replaced every 3 days. At the end of the culture period, membranes with the cultures were dissected from the filter inserts and immediately frozen in liquid nitrogen embedded in Tissue Tek OCT Compound (Medim). At least four cultures of each cell clone were analysed.

Invasion assays on modified Boyden chambers on collagen type IV gel were performed as previously described (Cano et al., 2000; Perez-Moreno et al., 2001), starting with 1 × 10 6 seeded cells, and counting of cells into the lower part of the filter 24 h after seeding.

Local tumour growth and histological studies

Murine CarB and HaCa4 cells (1 × 10 6 in 0.1 ml PBS) from subconfluent cultures were injected into the dorsal midline of female Balb/c nude immunocompromised mice, aged 8 weeks (Charles River). Growing tumours in mice were measured every 2 days using caliper by determination of the two orthogonal external diameters and statistical comparisons were made using the ANOVA analysis. Mice were killed when the tumours reach a size of 0.5 cm 3 ; tumours were surgically excised and processed for histology, immunostaining and RT–PCR analysis as recently described (Peinado et al., 2004b, 2005). Mice were housed and maintained under specific pathogen-free conditions and used in accordance with institutional guidelines and approved by the Use Committee for Animal Care. A minimum of eight tumours from each cell line was generated and, at least, four different tumours derived from each cell line were analysed. For RT–PCR, one part of the tumour was directly frozen in liquid nitrogen after careful removal of all surrounding skin. For immunostaining procedures, one part of the tumour tissue was fixed in formalin and embedded in paraffin and another was frozen in liquid nitrogen embedded in Tissue Tek OCT Compound and stored at −70°C. Paraffin sections were stained with haematoxylin and eosin or analysed by immunohistochemistry with anti-E-cadherin (1:100) or rabbit monoclonal anti-Ki67 (1:200) (Clone SP6, Lab Vision Corporation), and frozen sections were simultaneously analysed by immunofluorescence with anti-MMP-9 (1:200), anti-CD31(1:300) (Chemicon), anti-vimentin (1:200) and appropriate secondary antibodies as described (Peinado et al., 2004b, 2005).

prírastky

GenBank / EMBL / DDBJ

  • NM005985

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplnkový obrázok S1

  2. 2.

    Doplnkový obrázok S2

  3. 3.

    Doplnkový obrázok S3

  4. 4.

    Doplnkový obrázok S4

  5. 5.

    Doplnkový obrázok S5

  6. 6.

    Doplnkový obrázok S6

  7. 7.

    Suplementary Materials and Methods

glosár

EMT

epithelial–mesenchymal transition

LOXL2

lysyl oxidase like-2

MET

mesenchymal–epithelial transition

MDCK

Madin Darby canine kidney

zhrnieme

small hairpin interfering RNA

MMP

metalloproteinase

RT-PCR

reverzná transkripčná polymerázová reťazová reakcia

qRT–PCR

quantitative real-time PCR

Doplňujúce informácie sprevádza dokument na webovej stránke Oncogene (//www.nature.com/onc).