In situ diferenciácia cd8aα τ buniek od cd4 t buniek v periférnych lymfoidných tkanivách vedecké správy

In situ diferenciácia cd8aα τ buniek od cd4 t buniek v periférnych lymfoidných tkanivách vedecké správy

Anonim

predmety

  • autoimunita
  • odlíšenie
  • imunogenetika

abstraktné

V brzku sa vyskytuje vzájomne sa vylučujúce stanovenie bunkového osudu pomocných CD4 alebo CD8 zabíjacích T buniek. Verí sa, že tieto podmnožiny T-buniek nepresmerujú iné línie. Tu sme ukázali, že kyselina retínová a transformujúci rastový faktor-p1 podporovali diferenciáciu CD8a T buniek od CD4 T buniek spôsobom závislým od Runx3. Tieto bunky sa považovali za patriace do imunoregulačných populácií, pretože je známe, že subpopulácie CD8aa + TCRaß T buniek potláčajú aktivované T bunky a myši s bunkami Runx3 - / - T vykazovali defekty počas zotavovania sa z experimentálnej alergickej encefalomyelitídy. Naše výsledky ukazujú, že CD4 T bunky hrajú zásadnú úlohu pri kontrole imunitných reakcií prostredníctvom propagácie a atenuácie. Preto očakávame, že objasnenie mechanizmov, na ktorých je tento proces založený, poskytne informácie vedúce k terapii autoimunitných a imunodeficienčných ochorení.

úvod

Počas dozrievania T buniek bunky nesúce receptor T-buniek (TCR) aB exprimujú na svojom povrchu molekuly CD4 aj CD8 (dvojito pozitívne tymocyty). Prechod z dvojitého na jeden pozitívny (CD4 + CD8- alebo CD4-CD8 +) vyžaduje selekciu TCRαβ s intratmickými ligandami, ktoré sú prezentované hlavnými histokompatibilnými komplexmi (MHC). Koreceptory CD4 a CD8 interagujú s molekulami MHC II. A II. Triedy, čo vedie k interakcii TCRaß s komplexmi ligand / MHC a stabilizáciou expresie CD4 alebo CD8 na dozrievajúcich TCRa T bunkách. Súčasne sa tymocyty rozchádzajú na funkčne odlišné pomocné bunky CD4 a bunky zabíjajúce CD8 1 . Korelácia medzi mechanizmami rozpoznávania antigénu a funkčnou divergenciou T buniek naznačuje, že viazanie týchto buniek je nevratné. Presmerovanie CD4 T buniek na líniu CD8 a naopak sa na periférii nevyskytuje.

Na udržanie imunologickej homeostázy je dôležité zavedenie centrálnej a periférnej tolerancie. Okrem prirodzene sa vyskytujúcich regulačných T buniek CD4 + CD25 + Foxp3 + (nTregs) bolo navrhnutých aj niekoľko fenotypovo a funkčne odlišných regulačných populácií T-buniek, 2, 3, 4, 5, 6 . K dnešnému dňu boli identifikované najmenej štyri podmnožiny CD8 + Treg a medzi ne patria CD8 + CD28-, CD8 + CD25 +, CD8 + CD122 + a CD8aa T bunky. Spomedzi nich dve podskupiny CD8 + T-buniek vykazujú špeciálnu vlastnosť v potlačovaní aktivovaných, ale nie naivných T-buniek 7, 8, 9 . CD8αβ + CD122 + CD44 + indukovateľný kostimulačný ligand (ICOSL) + TCR aβ + T bunky tlmia imunitné reakcie inhibíciou folikulárnych pomocných buniek T (TFH) rozpoznávaním Qa-1, ktorá je exprimovaná na TFH bunkách aktivačne závislým spôsobom 7 . Pri skríningu buniek Treg, ktoré inhibujú experimentálnu autoimunitnú encefalomyelitídu (EAE) u myší 10, 11, sa identifikovala podskupina CD8a + CD122 + TCRαβ + T. Táto podskupina T-buniek CD8aa rozpoznáva patogénny peptid odvodený od TCR, ktorý je prítomný na molekule Qa-1 patogénnych T buniek aktivačne závislým spôsobom a inhibuje patogénne T bunky. Imunoregulačná úloha CD8a + TCRaß + T buniek bola preukázaná v dvoch ďalších modeloch autoimunitného ochorenia. Po prvé, prenos CD8aαTCRaβ T buniek inhibuje kolitídu, ktorá je vyvolaná adoptívnym prenosom naivných CD4 T buniek do závažných kombinovaných imunodeficientných (SCID) myší 6 . Po druhé, neobézne diabetické myši (NOD) sú defektné pri tvorbe CD8aaTCRaß T buniek, čo naznačuje regulačnú úlohu týchto populácií buniek12. Okrem toho genetické kontrolné prvky, ktoré sú potrebné pre klonálnu odchýlku od CD8aa T buniek, tiež regulujú záchranu z klonálnej delécie nTregs v brzlíku 13, čo naznačuje, že tieto rôzne podmnožiny imunoregulačných T buniek zdieľajú spoločný mechanizmus tymickej selekcie.

Vývojová dráha CD8aa + TCRaβ + T buniek je kontroverzná kvôli nasledujúcim zisteniam. Najskôr bola pozorovaná akumulácia autoreaktívnych TCR v repertoári CD8aa + TCRaβ + T buniek 14 . Po druhé, CD8aa + TCRaß + T bunky obsahujú iba malú časť T buniek v lymfatických uzlinách a slezine (<1% T buniek), ale veľkú časť (približne 40% T buniek) v intraepiteliu čreva. Z tohto dôvodu sa predtým verilo, že CD8aa + TCRaβ + T bunky boli extratymického pôvodu a lokálne diferencovali v čreve; teraz sa však predpokladá, že pochádzajú z týmusu 15 . V brzlíku boli CD8aa + TCRaß + prekurzorové T bunky vybrané vysokoafinitnými vlastnými antigénmi, ako sú nTregs 12, 16, 17 . Vybrané prekurzorové T bunky boli CD4- a CD8-dvojité negatívne bunky. K konečnému dozrievaniu týchto buniek, vrátane expresie CD8aa, dochádza v čreve 18 . Transformačný rastový faktor (TGF) -p1 hrá kľúčovú úlohu pri tvorbe nTregov a CD8a T buniek počas selekcie v brzlíku 19, 20 . Teda boli objasnené regulačné faktory, ktoré riadia vývoj CD8aa + TCRaß + intestinálnych intraepiteliálnych lymfocytov (IEL) a molekulárne dráhy tejto bunkovej populácie. Pôvod CD8aa + TCRaβ + T buniek mimo čreva a faktory potrebné na ich generovanie však nie sú úplne známe.

V tejto štúdii sme ukázali, že imunitné reakcie podporujú diferenciáciu CD8aa + TCRaβ + T buniek od naivných CD4 T buniek v periférnych lymfoidných tkanivách. Spomedzi faktorov vyvolaných zápalom sú na diferenciáciu CD8a T buniek nevyhnutné TGF-pi, kyselina all-trans retinová (atRA) a interleukín (IL) -2. Boli pozorované výrazné podobnosti medzi indukovanými Tregs (iTregs) a CD8aa T bunkami, pričom na diferenciáciu iTregs boli potrebné rovnaké signály. Okrem toho CD4 T-bunky s deficitom Runx3 stratili svoju schopnosť stať sa T bunkami CD8aa, čo naznačuje, že v tejto diferenciácii hrá Runx3 rozhodujúcu úlohu. Ďalej myši, ktorých T bunky boli deficientné na Runx3, vykazovali defekty v zotavovaní sa z EAE. Bolo teda potvrdené, že CD8aa Tregs sa generujú v týmuse a periférii, ako CD4 + Foxp3 + Tregs, a signály požadované pre CD8aa Tregs boli rovnaké ako signály požadované pre CD4 + Foxp3 + Tregs. Ukázali sme teda, že novo identifikovaná podskupina Treg, menovite CD8aa Tregs, ktoré sú odvodené od CD4 T buniek, hrá imunoregulačnú úlohu v EAE.

výsledok

Tvorba CD8aa T buniek v slezine imunizáciou

Okrem CD4 + CD25 + Foxp3 + T buniek 21, 22, 23 bolo identifikovaných niekoľko imunoregulačných buniek tiež 7, 10, 24, 25 . CD8 Treg podmnožiny negatívne regulujú aktivované, ale nie naivné, funkcie T buniek 7, 10, 24, 25 . O týchto bunkových podsúboroch sa uvádza, že CD8aaTCRaß T bunky hrajú dôležitú úlohu v črevnej mukozálnej imunite a bránia autoimunitným ochoreniam 6, 12, 13 . Pôvod tejto podskupiny a mechanizmy jej rozvoja však zostávajú nejasné. Počiatočný záväzok CD8a T buniek sa vyskytuje v týmuse po expozícii agonistickým auto-peptidom 16, 17, 18 a ich generovanie vyžaduje signál TGF-pi 19 . Keď pozitívne vybrané CD8aaTCRa3 prekurzory T buniek dosiahnu črevo, exprimujú molekuly CD8aa IL-15 závislým spôsobom 18 . Dôležité je, že expresia CD8aa je indukovaná na CD8aB T bunkách imunizáciou a je potrebná na vytvorenie pamäťových CD8aB T buniek 26, 27 . Preto sme skúmali účinok imunizácie na tvorbu CD8aa pozitívnych buniek v slezine. Ako sa očakávalo, imunizácia vyvolala tvorbu CD8aa single-pozitívnych T buniek (6, 5% CD4-CD8αβ-CD8aa + TCRβ + T buniek v CD4-T bunkách v imunizovanej slezine v porovnaní s 2, 5% v neimunizovanej slezine; obr. 1A).,

Image

(A) Fluorescenčne aktivované triedenie buniek (FACS) analýza CD8aa + CD8aβ-CD4-TCRaβ T buniek v slezine po imunizácii myší WT (C57BL / 6) NP-CGG / Alum. Horizontálna os označuje percento CD8aa T-buniek v CD4-T-bunkách. * p <0, 05; n = 3. TCR, receptor T-buniek. (B) FACS analýza lymfocytov z Rag2 - / - myší (CD45.1), ktoré dostali naivné CD4 T bunky (CD45.2) pred 6 mesiacmi. Bunky TCRaP + CD45.2 + boli vyšetrené na expresiu CD4 a CD8a. CD4-CD8a + (I) a CD4 + CD8a + (II) T bunky sa ďalej skúmali na expresiu CD8a a CD8p. IEL, intestinálne intraepiteliálne lymfocyty, PP, Peyerove náplasti. Diferenciácie CD8a T buniek od CD4 T buniek u myší Rag2 - / - boli potvrdené u dvoch zo štyroch analyzovaných myší a sú uvedené reprezentatívne údaje.

Obrázok v plnej veľkosti

Tvorba CD8a T buniek z CD4TCRaß T buniek u myší Rag2 - / -

S cieľom identifikovať podmnožiny, ktoré sa potenciálne diferencujú na CD8aa T bunky, sa ich tvorba skúmala v deň 20 po tom, čo sa naivné myši CDag a CD8ap T adoptívne preniesli na myši Rag2 - / - . Zatiaľ čo CD8aa T bunky sa nenašli ani v jednom prípade po 20 dňoch, u niektorých myší Rag2 - / -, ktoré dostali naivné CD4 T bunky, sa našli približne po 6 mesiacoch. Vo všetkých skúmaných tkanivách bolo nájdených niekoľko buniek pozitívnych na CD8aa, s významne väčším počtom pozorovaných v Peyerových náplastiach (PPs; Obr. 1B). Tieto pozorovania naznačujú, že naivné CD4 T bunky sa môžu diferencovať na CD8a T bunky, aspoň za týchto experimentálnych podmienok.

TGF-pi, atRA a IL-2 podporujú diferenciáciu CD8aaTCRaβ Tregs z naivných CD4 T buniek in vitro

Aby sme preskúmali mechanizmy diferenciácie z CD4 na CD8aa T bunky, najskôr sme sa zamerali na faktory potrebné na generovanie iTregs alebo CD4 + Foxp3 + buniek. Faktory sme pridali do konvenčného in vitro testu diferenciácie CD4 T-buniek. IL-2, TGF-pi a atRA generovali CD8a T bunky z CD4 T buniek (obr. 2A). Aj keď atRA hral iba podpornú úlohu pri diferenciácii iTreg buniek, generovanie CD8aa T buniek záviselo od všetkých troch faktorov (obr. 2A a údaje nie sú uvedené). Aby sa vylúčila možnosť, že CD8aa T bunky boli odvodené od kontaminovaných CD8aß buniek, CD8aß T bunky boli kultivované za rovnakých podmienok, aké boli použité na diferenciáciu CD8aa od CD4 T buniek, a neboli pozorované žiadne CD8aa T bunky (Obr. 2B). Navyše, CD8aß T bunky majú schopnosť inhibovať diferenciáciu CD8aa T buniek odvodených od CD4, ako je znázornené na obrázku 2C. Tieto pozorovania naznačujú, že CD4 T bunky a nie CD8aB T bunky sú hlavným zdrojom periférnych CD8a T buniek. Pretože IL hrajú kritickú úlohu pri určovaní pomocných T-bunkových podsúborov, ďalej sme skúmali účinky rôznych IL na diferenciáciu CD8aa. Naše výsledky ukázali, že IL-2 mal najsilnejší účinok na tvorbu CD8aa T buniek (Obr. 2D). Ukázalo sa, že dávka antigénu ovplyvňuje diferenciáciu CD8a T buniek. V brzlíku indukuje nízka koncentrácia agonistu CD8a T bunky, zatiaľ čo vysoká koncentrácia indukuje CD8aa T bunky. Koncentrácia atRA ovplyvňuje diferenciáciu iTreg a Th17 buniek 28, 29 . Dávka antigénu a koncentrácia atRA teda ovplyvňujú rôzne procesy pri určovaní osudu buniek. Preto sme skúmali účinky sily signálu TCR a koncentrácie atRA na diferenciáciu CD8aa T buniek. Vysoké percento CD8a T buniek sa zistilo po kultivácii so silnou stimuláciou TCR a vysokou koncentráciou atRA (obr. 2E).

Image

(A) Naivné CD4 + T bunky boli stimulované a-CD28, IL-2, TGF-pi a atRA na a-CD3ε-potiahnutých platniach. CD8a a + CD4-T bunky sa analyzovali pomocou FACS. (B) CD8aβ + T bunky sa stimulovali za podmienok uvedených v A. (C) Celkom slezinných T buniek (41% CD8a + T buniek a 56% CD4 T buniek) sa stimulovali za podmienok uvedených v bode A. (D) Naive CD4 + T bunky sa kultivovali s rôznymi IL a TGF-pi + atRA. (E) Naivné CD4 + T bunky boli stimulované TGF-pi, IL-2 a rôznymi koncentráciami atRA na doštičkách potiahnutých indikovanými koncentráciami a-CD3ε. Diferenciácia buniek sa analyzovala pomocou FACS. Všetky experimenty sa uskutočňovali najmenej trikrát; sú zobrazené reprezentatívne údaje.

Obrázok v plnej veľkosti

Generovanie CD8aαTCRaβ Tregs závislých od runx3 in vitro

S cieľom charakterizovať CD8aa T bunky (CD8a pozitívna frakcia na obrázku 3A alebo CD8aa bunky na obrázku 3B), ktoré boli vytvorené in vitro , bol ich profil génovej expresie porovnávaný s iTregs (CD8 negatívna frakcia zobrazená na obrázku 3A alebo bunky iTreg na obrázku 3B). ) odvodené z rovnakých kultivačných podmienok (ako je znázornené na obr. 3A) a predtým dobre charakterizovaných CD8 TCRaP Tregs 7, 9, 24, 30 . Expresia granzýmov A a B sa zvýšila v populácii CD8aa, zatiaľ čo expresia Foxp3 sa znížila (obr. 3A, B). Expresia CD122 a ICOSL na povrchu bola tiež špecificky indukovaná v CD8a T bunkách (Obr. 3A). Vzorec expresie týchto génov bol podobný ako v iných CD8 Treg bunkách 7, 9, 24, 30 . Posledné štúdie naznačili, že Runx3 je hlavný regulátor CD8aß T buniek, zatiaľ čo ThPOK je hlavný regulátor CD4 T buniek 31, 32, 33 . Preto sme skúmali možnosť, že tieto faktory sa podieľali na diferenciácii z CD4 na CD8aα T bunky. Runxl a ThPOK boli špecificky exprimované v naivných CD4 T bunkách (obr. 3B). Po vytvorení CD8a T buniek sa pozorovala iba expresia Runx3, zatiaľ čo sa to nenašlo v podskupine iTreg (obr. 3B). Je potrebné si všimnúť, že predtým sme zistili, že Runx2 a Runx3 sú potrebné pre signály TGF-pi a atRA pri prepínaní triedy IgA v B bunkách 34, 35 . Bolo teda možné predpokladať, že Runx3 prispel k diferenciácii CD8aa buniek. Ako sa očakávalo, Runx3 - / - CD4 T bunky neboli schopné diferencovať sa na CD8a T bunky (Obr. 4). Tieto pozorovania podporujú hypotézu, že CD8aa T bunky odvodené od CD4 fungujú ako regulačné bunky in vivo a že Runx3 je nevyhnutný na generovanie týchto buniek línie.

Image

(A) Naivné CD4 + T bunky boli stimulované za podmienok uvedených na obrázku 2 (A). Expresia génu bola stanovená pomocou FACS. (B) Naivné CD4 + T bunky boli stimulované za podmienok uvedených na obrázku 2 (A). Bunky iTreg (CD4 + T) a CD8aT (CD8 + T) boli triedené od kultivovaných buniek (ukázané na obrázku 3A) a génová expresia bola analyzovaná pomocou reverznej transkripcie - polymerázovej reťazovej reakcie. Na kontrolu sa použili naivné CD4 T bunky (CD4 + CD62L + T bunky), CD8aß T bunky. Naivný CD4, CD8ap, iTreg a CD8aa indikujú zdroj RNA použitý na tvorbu cDNA. Pre uvedené transkripty sa amplifikovalo päťnásobné sériové riedenie cDNA. Všetky experimenty sa uskutočňovali najmenej trikrát a sú uvedené reprezentatívne údaje.

Obrázok v plnej veľkosti

Image

Naivné CD4 T bunky z divokého typu (WT) alebo z buniek derivovaných z Runx3 - / - FL boli stimulované za podmienok uvedených na obrázku 2 (A). CD8a a + CD4-T bunky sa analyzovali pomocou FACS. Všetky experimenty sa uskutočňovali trikrát; sú zobrazené reprezentatívne údaje.

Obrázok v plnej veľkosti

Generovanie CD8aa tregov z CD4 T buniek in vivo vyžaduje Runx3

Aby sa určilo, či sa CD4 T bunky diferencujú na CD8a T bunky in vivo , naivné CD4 T bunky z C57BL / 6 (CD45.2) myší sa adoptívne preniesli do myší Rag2 - / - s pozadím C57BL / 6 (CD45.1) a generovanie CD8aa T buniek sa skúmalo po podaní atRA. Vzhľadom na to, že umiestnenie navádzaných CD4 T buniek nemôže byť kontrolované, absolútny počet prenesených T buniek v PP, IEL a LPL sa podstatne menil. V súlade s tým bola skúmaná diferenciácia T buniek CD8aa stanovením percentuálneho podielu buniek CD8aa. CD8aa T bunky sa objavili atRA-dependentným spôsobom vo všetkých skúmaných tkanivách (obr. 5). Percento CD8aα T buniek bolo signifikantne vyššie v PP a IEL ako v kontrolných skupinách (12, 2% CD8aα + CD4 − TCRαβ + T buniek v PP ošetrených atRA v porovnaní s 0, 05% v kontrolných vzorkách; 10, 0% v SRA liečených atRA v porovnaní s kontrolou 0, 09%; obr. 5). Tieto výsledky ukazujú, že atRA-dependentná diferenciácia CD4 T buniek na CD8a T bunky sa vyskytla in vivo . Aby sa vylúčila možnosť, že T bunky CD8aa boli odvodené od kontaminovaných T buniek CD8a, hodnotili sme vplyv T buniek CD8a na generovanie T buniek CD8α moduláciou pomeru T buniek CD8α v naivných donorských bunkách CD4. Naivné CD4 T bunky použité na sériu experimentov s bunkovým prenosom obsahovali menej ako 0, 02% T buniek CD8a. Purifikované naivné CD4 T bunky sa preniesli do myší Rag2 - / - s T bunkami CD8aP alebo bez nich a vyhodnotila sa tvorba CD8a T buniek in vivo . Medzi myšami nesúcimi populácie CD4 T buniek obsahujúcich 0, 02% CD8aß T buniek a myšami nesúcimi populácie obsahujúci 0, 12% CD8a T T buniek bol zanedbateľný rozdiel v percentách CD8a T buniek (údaje nie sú uvedené). Okrem toho naivné CD4 T bunky kontaminované menej ako 0, 002% CD8aß T bunkami sa diferencovali rovnako efektívne ako populácie CD4 T buniek nesúcich 0, 02% CD8a T T buniek u myší Rag2 - / - . Tieto výsledky ukazujú, že CD8aß T bunky nie sú hlavným zdrojom CD8aa T buniek diferencovaných in vivo .

Image

FACS analýza lymfocytov z Rag2 - / - myší (CD45.1), ktoré dostali naivné CD4 T bunky (CD45.2) z buniek získaných z WT alebo Runx3 - / - FL po podaní atRA. Bunky TCRaP + CD45.2 + boli vyšetrené na expresiu CD4 a CD8a (všetky vzorky). CD4-CD8a + T bunky sa ďalej skúmali na expresiu CD8a a CD8p v prípade vzoriek podávaných atRA. Všetky experimenty sa uskutočňovali najmenej trikrát; sú zobrazené reprezentatívne údaje. LPL, lamina propria lymfocyty.

Obrázok v plnej veľkosti

Príspevok Runx3 k diferenciácii CD4-CD8aa in vivo sa ďalej určoval pomocou naivných buniek CD4 T s deficitom Runx3 ako darcu. U myší ošetrených atRA alebo neliečených myší neboli pozorované žiadne CD8a T bunky (Obr. 5). Preferenčná diferenciácia CD8aβ + T buniek, ale nie CD8aα + T buniek, sa však pozorovala po liečbe atRA vo vysokých dávkach (doplnkový obrázok S1). Berúc do úvahy všetky výsledky, Runx3 hrá špeciálnu úlohu pri diferenciácii CD8a T buniek od CD4 T buniek in vivo . Okrem toho niekoľko ďalších signálov, ktoré neboli skúmané v tejto štúdii, prispieva k tvorbe CD8 T buniek z CD4 T buniek in vivo ; Runx3 - / - naivné CD4 T bunky nemôžu diferencovať CD8α + T bunky in vitro . Vzhľadom na funkčnú redundanciu transkripčných faktorov rodiny Runx sa skúmal ich príspevok k diferenciácii CD4 T buniek na CD8 T bunky pomocou T buniek Runx2 - / - Runx3 - / - CD4. Podávanie vysokých dávok atRA nemohlo zachrániť defekt pri tvorbe CD8 T buniek (údaje nie sú uvedené), čo naznačuje, že Runx2 a Runx3 hrajú rozhodujúcu úlohu pri diferenciácii CD4 T buniek na CD8 T bunky. Presné úlohy každého faktora Runx pri diferenciácii na rôzne CD4 T bunkové podskupiny odvodené od CD4 však ostávajú predmetom skúmania.

CD4 T bunky sa počas imunitnej reakcie diferencujú na CD8aa Tregs a utlmujú imunitné reakcie

Hromadné dôkazy naznačujú, že črevo je bohaté na atRA 28, 29, 36, 37 a predpokladá sa, že udalosti závislé od RA sa vyskytujú prednostne v črevách. Avšak spontánna diferenciácia CD4 T buniek na CD8a T bunky nebola pozorovaná v čreve v neprítomnosti podania atRA (obr. 5). Fyziologický význam diferenciácie CD4 T buniek na CD8a T bunky v normálnych imunologických reakciách je preto diskutabilný. Posledné správy ukázali, že RA je potrebná na podporu efektorových reakcií CD4 T buniek a je hojnejšia v zapálených tkanivách ako v črevách 38, 39 . Preto sme skúmali, či diferenciácia CD4 T buniek na CD8a T bunky môže byť indukovaná imunizáciou. Po imunizácii sa vyhodnotila tvorba CD8a T buniek u myší Rag2 - / -, ktoré dostali naivné CD4 T bunky. V dňoch 1, 3 a 6 po imunizácii bolo v slezine pozorovaných približne 1% T buniek CD8aa (Obr. 6A). Táto hodnota sa príliš nelíšila od hodnoty pozorovanej po obvyklej imunizácii. Približne 2% - 3% buniek boli CD8aα + v TCRαβ + CD8αβ-T bunkách (obrázok 1A a údaje nie sú uvedené). Významne väčšie populácie CD8aa + T buniek boli pozorované v PP, IEL a lymfocytoch lamina propria v deň 6 (obr. 6B). Naopak, v čreve sa v deň 3 pozorovali takmer žiadne CD8aa + T bunky (obr. 6B). Tieto výsledky teda naznačujú, že k diferenciácii CD4 T buniek na CD8a T bunky došlo v mieste imunitných reakcií a že novo generované CD8a T bunky migrovali do čreva prostredníctvom expresie čreva navádzajúcich receptorov, ako už bolo skôr uvedené 26, 36 . V predchádzajúcej štúdii sme zistili, že myši Runx3 - / - vykazovali defekty v zotavovaní sa z kolitídy, a tým zvýšili tvorbu nádorov spojených so zápalom 40 . Predpokladali sme, že diferencované CD8aa T bunky oslabujú imunitné reakcie a znižujú škodlivé účinky nepretržitého zápalu, keďže je známe, že CD8aa Tregs špecificky potláča aktivované T bunky. Na podrobnejšie posúdenie tejto hypotézy sme ako modelový systém použili myši s EAE. V tomto modeli CD8 T bunky hrajú kľúčovú úlohu pri znižovaní frekvencie recidív po zotavení z akútneho EAE 41, 42 . Toto autoimunitné ochorenie je preto vhodným modelom na hodnotenie regulačných funkcií CD8 Tregs. Ako sa očakávalo, medzi genotypmi sa nepozorovali žiadne rozdiely vo výskyte, klinickom skóre v skorej fáze alebo výskyte EAE. Myši Runx3 - / - však vykazovali defekty v zotavovaní sa z EAE, ako naznačuje zvýšené klinické skóre po 6 týždňoch (P = 0, 0010; obr. 7A). Aby sa vylúčili účinky pochádzajúce z iných línicových buniek, uskutočnili sme experimenty indukcie EAE s použitím myší Rag2 - / -, ktoré preniesli T bunky CD4 z myší Runx3 - / - a divokého typu. Myši Rag2 - / - majúce T bunky Runx3 - / - CD4 opäť vykazovali defekty v zotavovaní sa z EAE (P = 0, 0048; Obr. 7B). Tieto výsledky naznačujú, že funkcie Runx3 v CD4 T bunkách sú dôležité pre zotavenie z EAE. Na regulácii EAE sú zapojené rôzne bunky derivované z CD4: bunky Th17, Th1 a CD4 + Foxp3 + Treg. Th17 a Th1 sú dôležité na vyvolanie choroby EAE. Transkripčné faktory rodiny Runx sú však pozitívnymi regulátormi diferenciácie Th1 a Th17, čo naznačuje, že nedostatok Runx3 prispeje k inhibícii choroby EAE. Ďalej, diferenciácia a funkcia Treg buniek nie sú silne ovplyvnené deficitom Runx3, ako bolo ukázané skôr 40, 48 . Stručne povedané, defekt v zotavení sa z EAE choroby pozorovaný u Rag2 - / - myší, ktoré majú Runx3-deficientné CD4 T bunky, nemožno vysvetliť skôr známymi funkciami Runx3 v CD4 T bunkách. Z týchto dôvodov sme dospeli k záveru, že CD8aa T bunky odvodené od CD4 fungujú ako imunitné regulačné bunky, prinajmenšom v tomto modeli EAE. Tieto pozorovania podporujú hypotézu, že diferencované CD8aa T bunky hrajú dôležitú regulačnú úlohu pri vytváraní negatívnej spätnoväzbovej slučky, ktorá znižuje nepriaznivé účinky počas imunitných reakcií.

Image

(A) Naivné CD4 + T bunky (CD45.2) sa injikovali do myší Rag2 - / - . Bunky TCRaP + CD45.2 + zo sleziny 1, 3 a 6 dní po imunizácii sa analyzovali na expresiu CD8a a CD4. (B) FACS analýza lymfocytov z tkanív myší použitých pre (A). Bunky TCRaP + CD45.2 + boli vyšetrené na expresiu CD4 a CD8a. Bunky CD4-CD8a + T sa ďalej skúmali na expresiu CD8a a CD8p. Všetky experimenty sa uskutočnili najmenej trikrát a sú uvedené reprezentatívne údaje.

Obrázok v plnej veľkosti

Image

Myši Rag2 - / - s (A) WT alebo Runx3 - / - lymfocytmi a (B) WT alebo Runx3 - / - CD4 T bunky boli sledované na príznaky neurologického ochorenia po experimentálnej indukcii autoimunitnej encefalomyelitídy (EAE). Zobrazené údaje sú priemerné ± štandardné chyby priemeru klinického skóre EAE 10 myší spojené z dvoch nezávislých experimentov a percentuálneho výskytu ochorenia.

Obrázok v plnej veľkosti

Táto štúdia odhalila predtým neznáme podmnožiny CD8 T-buniek, ktoré boli odvodené z aktivovaných periférnych CD4 T buniek (obr. 8) a jedinečný mechanizmus na generovanie aktivovaných CD8 T buniek bez ďalších CD4 T buniek. Ďalej tieto podskupiny T-buniek môžu pravdepodobne inhibovať imunitné reakcie. Objasnenie presného mechanizmu týchto procesov a presných funkcií týchto bunkových podsúborov poskytne základné poznatky o budúcich terapiách autoimunitných chorôb.

Image

Obrázok v plnej veľkosti

diskusia

Je známe, že CD4 T bunky sa diferencujú na rôzne pomocné a regulačné línie T-buniek, konkrétne Thl, Th2, Th9, Th17, TFH a CD4 + Foxp3 + Tregs. Okrem týchto podskupín sme v tejto štúdii identifikovali novú bunkovú populáciu s názvom CD8aα Tregs, ktoré majú regulačnú funkciu. Diferenciácia CD8aα Tregs vyžadovala rovnaké signály ako iTregs. Diferenciácia CD8aa Tregs však trvala dlhšie ako diferenciácia iTregs a na ich vytvorenie bolo potrebné silnejšie stimulovanie TCR a vyššie koncentrácie atRA. Tieto údaje naznačujú, že stanovenie bunkového osudu jednej z dvoch indukovateľných podskupín Treg buniek bolo počas imunitných reakcií diferencovane kontrolované. Preto iTregs a CD8aa Tregs môžu mať v imunitnej regulácii odlišné funkcie. Podľa tohto konceptu sa ukázalo, že niektoré podskupiny T-buniek CD8aa majú schopnosť inhibovať aktivované, ale nie naivné T bunky. Verí sa, že Qa-1 u myši (alebo HLA-E u človeka), ktorá je neklasickou molekulou MHC I. triedy, zohráva kľúčovú úlohu pri obmedzovaní aktivity CD8aa Tregs iba voči aktivovaným T bunkám, pretože tieto molekuly sú prechodne upregulované na povrch aktivovaných T buniek a buniek prezentujúcich antigén. Korelácia medzi CD8 Tregs a Qa-1 bola navrhnutá na základe predchádzajúcich štúdií nasledovne. Imunizácia aktivovanými CD4 T bunkami exprimujúcimi Qa-1 indukuje CD8 Tregs obmedzené na Qa-1 43, 44 ; CD8aa Treg klony rozpoznávajú peptid odvodený od TCR prezentovaný na Qa-1111; Myši Qa-1 - / - vykazujú zväčšenie CD4 T-bunkových odpovedí a zvýšenú náchylnosť na EAE 45 ; rezistencia na opätovnú indukciu EAE sa stratila u myší s deficitom CD8 a Qa-1 41, 42, 45, 46 . V tejto štúdii sme pozorovali defekty pri zotavovaní sa z EAE u myší s deficitom Runx3, pri ktorých sa CD4 T bunky nemohli diferencovať na CD8aa Tregs. Tieto údaje naznačujú, že CD8aa Tregs hrajú špeciálnu úlohu v regulácii aktivovaných T buniek. Molekulárne mechanizmy, ktoré sú základom supresorových funkcií CD8aa Tregs, sú však zle pochopené. Ďalej je potrebné študovať presné cieľové bunky CD8a T buniek a vzťah medzi CD8aa Tregs a Qa-1 pri rôznych imunitných reakciách 47 .

Našli sme nápadné podobnosti medzi signálmi pre CD4 a CD8αα Tregs. Okrem toho diferenciácia týchto dvoch podskupín regulačných T-buniek vyžaduje aktivity proteínov Runx; CD8aα Tregs vyžadujú Runx3 a CD4 Tregs vyžadujú Runx1 48 . Je potrebné objasniť, či rôzne funkcie Runx1 a Runx3 alebo celkové množstvo proteínov Runx ovplyvňujú určovanie bunkového osudu.

CD8aa T bunky sú hlavnými populáciami IEL a väčšina z nich je vybraná v týmuse. Záväzok CD8aaTCRaß T buniek sa vyskytuje z T lymfocytov 16, 17 s obmedzeným MHC triedy I aj triedy II. Navyše CD8aa IEL chýbajú u p2-mikroglobulín-deficientných myší, ale nie u MHC triedy Ia-deficientných myší 49, 50 . Z týchto pozorovaní sa predpokladá, že molekuly MHC triedy Ib, vrátane Qa-1, sú potrebné na selekciu CD8a T buniek. V tejto štúdii sme ukázali, že CD4 T bunky sa na periférii diferencovali na CD8a T bunky, čo naznačuje, že primárna selekcia týchto buniek závislá od MHC triedy II sa vyskytla v týmuse. Je zaujímavé určiť presnú úlohu molekuly Qa-1 pri diferenciácii, udržiavaní alebo expanzii CD8aa T buniek odvodených z CD4.

V súhrne sme identifikovali novú podskupinu indukovateľných Treg buniek (obr. 8). Tento diferenciačný systém môže byť ovplyvnený rôznymi imunitnými dysfunkciami, vrátane autoimunitných chorôb a imunity nádorov. Predpokladáme, že ďalšie objasnenie presných mechanizmov tohto procesu poskytne základ pre vývoj protirakovinových liekov a zdôvodnenie liečby autoimunity.

metódy

myši

Túto štúdiu získal príslušný etický súhlas od Inštitúcie pre hodnotenie inštitúcií Kjótskej univerzity (referenčné číslo: Med Kyo12076). Myši divokého typu (WT), Runx3 +/−, Runx2 +/− a Rag2 - / - (CD45.1) v genetickom prostredí C57BL / 6 sa udržiavali v špecifickom myšom zariadení bez patogénov. Postupy týkajúce sa zvierat a ich starostlivosti boli v súlade s pokynmi pre zaobchádzanie so zvieratami Ústavu laboratórnych zvierat, Kjótska univerzita.

Fetálny prenos pečene

Jednobunkové suspenzie 2 - 4 x 106 celých jadrových buniek fetálnej pečene zozbieraných z embryí Runx3 - / -, Runx2 - / - Runx3 - / - a WT (CD45.2) v E14.5 sa injikovali intravenózne do subletálne ožiareného ( 4 Gy) myši Rag2 - / - (CD45.1). Najmenej 10 týždňov po transplantácii boli myši použité na indukciu EAE alebo boli usmrtené a ich naivné CD4 T bunky boli analyzované prietokovou cytometriou alebo použité na kultiváciu in vitro . V niektorých experimentoch boli naivné CD4 T bunky purifikované a adoptívne prenesené do iných myší Rag2 / príjemca (CD45.1). Všetky myši Rag2 - / - (CD45.1) použité pre každú experimentálnu súpravu boli porovnávané podľa veku a pohlavia.

Príprava buniek

Naivné CD4 + TCRaß + sa pripravili magnetickým triedením buniek (MACS) s použitím súpravy na izoláciu CD4 + CD62L + T buniek (Miltenyi Biotec, Bergisch, Nemecko) v kombinácii s rôznymi protilátkami (BD Pharmingen). V stručnosti, bunky pozitívne na líniu, ale nie CD4, boli odstránené podľa inštrukcií výrobcu s použitím biotínom konjugovaných línií špecifických protilátok a a-biotínových mikroguličiek. Po negatívnej selekcii sme urobili hrubú predpoveď konečnej koncentrácie kontaminovaných buniek CD4-CD62L + po vyčistení buniek CD4 + CD62L +. Za týmto účelom bola časť negatívne vybraných buniek zafarbená a-CD4 a a-CD62L protilátkami. Pokiaľ bolo medzi CD62L + bunkami viac ako 5% buniek CD4-CD62L +, vykonali sme negatívnu selekciu znova pomocou nasledujúcich protilátok a magnetických guličiek; a-CD8a-FITC, a-CD25-biotín, a-CD19-biotín, a-B220-biotín, a-CD11b-biotín, a-CD11c-biotín, a-la-biotín, a-Dx5-biotín, a- TCRy5-biotín, Ter119-biotín (Becton Dickinson, Mountain View, CA), a-FITC mikroguľôčky a streptavidínové mikroguľôčky (Myltenyi Biotech Bergisch, Nemecko). Po dokončení druhého kola negatívnej selekcie sa bunky CD62L + ďalej vybrali podľa pokynov výrobcu. Čistoty boli stanovené zafarbením protilátkami na CD8a, CD8p, CD4 a CD62L. Zvyčajne viac ako 97% buniek bolo CD4 + CD62L + a menej ako 0, 02% buniek bolo CD8a +. Bunky CD8aα sa nedajú zistiť. Ak bolo viac ako 0, 02% buniek pozitívnych na expresiu CD8a alebo menej ako 97% buniek bolo CD4 + CD62L +, myli sme ďalej vyčistené CD4 + CD62L + bunky prietokovou cytometriou s použitím FACSAria. Všetky purifikované bunky pomocou vyššie uvedenej metódy sa použili ako na kultiváciu in vitro, tak na experimenty s bunkovým transferom do myší RAG2 - / - . V podstate všetky metódy purifikácie boli použité pre experimenty s kultiváciou in vitro a bunkovým prenosom.

Na purifikáciu CD4 T buniek boli bunky sleziny podrobené negatívnej selekcii s použitím nasledujúcich protilátok a magnetických guličiek; a-CD8a-FITC, a-CD19-biotín, a-B220-a-CD11b-biotín, a-CD11c-biotín, a-la-biotín, a-Dx5-biotín, a-TCRy5-biotín, Ter119-biotín ( Becton Dickinson), a-FITC mikroguľôčky a streptavidínové mikroguľôčky.

CD8aß + TCRaß + T bunky boli pripravené pomocou MACS s použitím súpravy na izoláciu CD8a + T buniek (Miltenyi Biotec) v kombinácii s rôznymi protilátkami (BD Pharmingen). V stručnosti, bunky pozitívne na líniu, ale nie CD8, boli odstránené podľa inštrukcií výrobcu s použitím biotínom konjugovaných línií špecifických protilátok a a-biotínových mikroguličiek. Potom sme uskutočnili druhé kolo negatívnej selekcie pomocou nasledujúcich protilátok a magnetických guličiek; a-CD4-biotín, a-CD19-biotín, a-B220-biotín, a-CD11b-biotín, a-CD11c-biotín, a-la-biotín, a-Dx5-biotín, a-TCRy5-biotín, Ter119- Biotín (Becton Dickinson) a streptavidínové mikroguľôčky. Po druhom kole negatívnej selekcie boli bunky CD8p pozitívne vybrané pomocou MACS. Zvyčajne viac ako 98% populácie boli bunky CD8αβ + a menej ako 0, 5% boli bunky CD8a +. Ak bolo CD8aß + menej ako 96% buniek alebo viac ako 1, 0% buniek CD8a a +, myli sme ďalej vyčistené CD8a + bunky prietokovou cytometriou s použitím FACSAria. Všetky purifikované bunky s použitím vyššie uvedeného spôsobu sa použili ako na kultiváciu in vitro, tak na experimenty s bunkovým transferom do myší RAG2 - / - .

Prenos CD4 T buniek alebo naivných CD4 T buniek

Naivné CD4 T bunky boli pripravené ako je opísané vyššie; Do myší Rag2 - / - (CD45.1) sa prenieslo 0, 5 až 2, 5 x 106 naivných CD4 T buniek (CD45.2). Najmenej 4 týždne po transplantácii sa myši použili na rôzne experimenty. Pre experimenty EAE sa 2, 5 x 106 CD4 T buniek (CD45.2) prenieslo do myší Rag2 - / - (CD45.1). Niekoľko dní po transplantácii sa myši použili na indukciu EAE.

Bunkové kultúry

Vo všetkých experimentoch bolo percento CD62L + CD4 + T buniek alebo CD8aβ + T buniek nad 97. Naivné CD4 + T bunky (1 x 105 buniek / ml) boli aktivované anti-CD3 naviazanými na platni (5 μg / ml; BD) Pharmingen), rozpustný anti-CD28 (1 μg / ml; BD Pharmingen), anti-interferón-y (3 μg / ml; BD Pharmingen), anti-IL-4 (3 μg / ml; BD Pharmingen), TGF-pi (3 ng / ml; výskum a vývoj) a IL-2 (20 ng / ml; výskum a vývoj) v prítomnosti alebo neprítomnosti atRA (10 nM – 10 μM; Sigma-Aldrich) počas 7–9 dní.

Injekcia RA

atRA (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) sa rozpustil v sójovom oleji pri 6 mg / ml a alikvóty sa uchovávali pri -80 ° C. Pracovný roztok sa pripravil zriedením alikvotov atRA v sójovom oleji a rovnakým objemom dimetylsulfoxidu (DMSO). pred analýzou sa intraperitoneálnou injekciou podalo 1, 3 a 6 dní atRA 200 μg / 100 μl, 600 μg / 300 μl alebo vehikulum.

Analýza prietokovou cytometriou

Na farbenie boli použité nasledujúce protilátky: PECy7 anti-CD45.2 (BD Pharmingen); alofykocyanín (APC) anti-myšací TCRaB (BD Pharmingen); APCCy7 anti-myšací CD8a (BD Pharmingen); fluoresceín izotiokyanát (FITC) anti-myšací CD8p (BD Pharmingen); fykoerytrín (PE) anti-myšací CD4 (BD Pharmingen); PE anti-myšací CD8a (BD Pharmingen); Anti-myšací CD4 APC (BD Pharmingen); FITC anti-myšací CD8a (BD Pharmingen); FITC anti-myšací CD4 (BD Pharmingen); PE anti-myšací CD44 (BD Pharmingen); Biotín anti-myšací CD122 (BD Pharmingen); APC anti-myšací CXCR5 (BD Pharmingen); Biotín anti-myšací a4p7 (BD Pharmingen); FITC anti-myšací CCR9 (R&D); PE anti-myšací Granzyme A (Santa Cruz CA); Alexa 647 anti-Foxp3 (BD ​​Pharmingen); Alexa 647 anti-Granzyme B (BD Pharmingen); PerCP-streptavidín (Molecular Probes, Eugene, OR); APC-streptavidín (Molecular Probes, Eugene, OR); APCCy7-streptavidín (BD Pharmingen); PECy7-streptavidín (BD Pharmingen); PE-streptavidín (molekulárne sondy); FITC - streptavidín (molekulárne sondy).

Na cytoplazmatické farbenie sa použili roztok BD Cytofix / Cytoperm a roztoky BD Perm / Wash (BD Pharmingen).

Všetky analýzy sa uskutočňovali s FACSCalibur alebo FACSAria (Becton Dickinson).

Príprava IEL a LPL

To prepare IELs and LPLs, the intestines were removed, and PPs and mononuclear lymphocytes were isolated. The intestines were opened longitudinally, washed with phosphate-buffered saline, and cut into 5-mm pieces. To obtain IELs, pieces were shaken in Hank's balanced salt solution (+) containing 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid for 20 min at 37°C and passed through a cell strainer twice. The remaining tissue was cut into smaller pieces and digested with RPMI 1640 medium containing 4% fetal calf serum, 1 mg/mL collagenase II, 1 mg/mL Dispase (Gibco), and 40 μg/ml DNase I (TaKaRa) at 37°C and stirred for 20 min. Whole intestinal cell suspensions, which included LPL or IEL, were passed through a cell strainer and loaded on a 40/80% discontinuous Percoll gradient (GE Healthcare), and cells at the interface between 40% and 80% were collected and used as IELs or LPLs.

imunizácia

100 μg NP- chicken gamma globulin (CGG) in alum or complete Freund's adjuvant (incomplete Freund's adjuvant with Mycobacterium tuberculosis H37RA; Difco) was intraperitoneally injected.

EAE induction and clinical scoring

Age- and sex-matched mice were immunized subcutaneously with 100 μg MOG35-55 (Genway, China) in IFA (incomplete Freund's adjuvant) supplemented with 500 μg Mycobacterium tuberculosis on day 1. On days 1 and 3, mice were injected with 300 ng pertussis toxin (List Biological Laboratories). Clinical signs were scored on a scale of 1–5: 0, no clinical sign; 0.5, partially limp tail; 1, paralyzed tail; 2, loss of coordinated movement, hind limb paresis; 2.5, one hind limb paralyzed; 3, both hind limbs paralyzed, 3.5, hind limbs paralyzed, weakness in fore limbs; 4, fore limbs paralyzed; and 5, moribund.

Reverzná transkripčná polymerázová reťazová reakcia (RT-PCR)

Total RNAs were extracted from sorted T cells using TRIzol reagent (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). Oligo (dT)-primed cDNAs were prepared by reverse transcription. For semiquantitation, 50 ng cDNA was serially diluted and subjected to PCR. All PCR products were resolved electrophoretically on 2% agarose gels and visualized by ethidium bromide staining.

Štatistická analýza

Proportions of cells were compared with Student's t test (Fig. 1A). To see the effect of Runx3 in EAE recovery, the mean clinical scores were compared between genotypes using repeated measures analysis of variance (ANOVA). Greenhouse–Geiser correction was applied to adjust the degree of freedom for deviation from the sphericity assumption (Fig. 7A). All reported P values were two-tailed and P values lower than 0.05 were considered to indicate statistical significance.

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplnková informácia

    Doplnkový obrázok 1

Komentáre

Odoslaním komentára súhlasíte s tým, že budete dodržiavať naše zmluvné podmienky a pokyny pre komunitu. Ak zistíte, že je niečo urážlivé alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte ho ako nevhodné.