Súčasné zapojenie aktivačných receptorov nkg2d a cd3 na presmerovanie efektorových buniek na cd33-pozitívne zhubné bunky | leukémie

Súčasné zapojenie aktivačných receptorov nkg2d a cd3 na presmerovanie efektorových buniek na cd33-pozitívne zhubné bunky | leukémie

Anonim

predmety

  • Akútna myeloidná leukémia
  • Cielené terapie

Akútna myeloidná leukémia (AML) je rakovina postihujúca starších ľudí aj deti. Celková miera prežitia za tri roky je okolo 30%. Na predĺženie remisie a prežitia pacientov existuje potreba vývoja nových liečebných možností. AML blasty 85 - 90% dospelých a detských pacientov exprimujú CD33 na svojom povrchu. Preto sa CD33 javí ako sľubný cieľ pre imunoterapiu. 1 Pretože povrchovo viazané imunitné komplexy z predtým opísaných anti-CD33 protilátok sú rýchlo absorbované AML blastmi v priebehu prvých hodín, predchádzajúce anti-CD33 imunotargetingové stratégie boli založené hlavne na toxických liečivách, ktoré boli kovalentne viazané na anti-CD33 protilátky (pre napríklad gemtuzumab ozogamicín, Mylotarg), a tým sa spoločne dodáva do buniek AML. 2 Žiaľ, európske schválenie gemtuzumabu zlyhalo a droga bola nedávno stiahnutá z amerického trhu z dôvodu vedľajších účinkov.

Avšak CD33 stále predstavuje zaujímavý cieľ, najmä na presmerovanie imunitných efektorových T- alebo prírodných zabíjačských (NK) buniek bišpecifickými derivátmi rekombinantných protilátok. 3, 4 Na presmerovanie T buniek bišpecifické protilátky bežne pozostávajú z anti-CD3 domény a protilátkovej domény, ktorá je nasmerovaná na nádorový antigén na povrchu bunky. 4 Medzi inými stratégiami boli opísané 3 na presmerovanie NK buniek imunoglobulín pre aktivačný receptor NKG2D. 5 Tento imunoglobulín pozostáva z rozpustnej extracelulárnej domény receptora ULB-P2 a premennej fragmentu s jedným reťazcom (scFv) nasmerovanej na cieľový antigén. Na presmerovanie NK buniek na malígne plazmatické bunky pacientov s mnohopočetným myelómom autori vo svojej štúdii vybrali CD138 (BB-4). 5 Expresia aktivačného receptora NKG2D nie je obmedzená na NK bunky. V mononukleárnych bunkách periférnej krvi (PBMC) je väčšina CD8 + alfa beta T buniek pozitívnych na NKG2D, zatiaľ čo tento receptor obvykle exprimuje iba malá časť CD4 + T buniek. 6, 7 Takéto T bunky pozitívne na receptory NK buniek sa bežne získavajú na nádorových miestach u pacientov s melanómom, u ktorých môžu prejavovať protinádorovú reaktivitu zapojením oboch receptorov vrátane receptorov NKG2D a T buniek. 7 T lymfocytov pozitívnych na receptory NK buniek môže byť tiež dôležité pre imunitnú kontrolu iných nádorových buniek vrátane napríklad rakoviny hrubého čreva a konečníka, prsníka, prostaty a žalúdka. Zo zrejmých dôvodov imunoglobulín zameraný na NKG2D nielen precizuje NK-, ale aj časť NKG2D + T buniek. Doteraz však nie sú k dispozícii žiadne údaje týkajúce sa presmerovania nádorových buniek s NKG2D + T-bunkami, a to ani pomocou aktivačných receptorov NKG2D, ani CD3 s bišpecifickými protilátkami. Okrem toho nebolo analyzované súčasné presmerovanie T- a NK buniek na nádorové bunky a najmä AML blastov prostredníctvom CD3 a NKG2D. Preto sme chceli vyvinúť také nástroje, ktoré nám umožnia simultánne presmerovať tieto efektorové bunky na CD33-pozitívne AML bunky. Aby sa predĺžila dostupnosť imunitných komplexov súvisiacich s CD33 na povrchu buniek AML a tým sa prípadne zlepšila ich cieliaca účinnosť, vyvinuli sme nové hybridómy vylučujúce monoklonálne protilátky anti-CD33. Pre prezentované konštrukty sme vybrali anti-CD33 mAb DRB2. Ako je znázornené na obrázku 1A (al) (i) až (iii)), táto anti-CD33 mAb sa viaže na povrch AML buniek a výsledné imunitné komplexy tam môžu byť detegované dokonca 48 hodín po ich vytvorení. Dôvod tejto stabilizácie anti-CD33 imunokomplexov na bunkovom povrchu AML blastov nie je v súčasnosti známy. Bunky AML použité v našej štúdii sa izolovali centrifugáciou v gradiente po leukaferéze pacientov, ktorí boli po informovanom súhlase a schválení miestnou komisiou pre inštitucionálne preskúmanie zaradení do dvoch po sebe idúcich multicentrických skúšok (SHG96 a DSIL2003). Na presmerovanie T buniek prostredníctvom komplexu receptorov T buniek na AML bunky sme skonštruovali jednoreťazcovú bišpecifickú anti-CD33-anti-CD3 protilátku nazvanú scBsTaFv CD33-CD3 (Obrázok 1A, a2 (i); Obrázok 1B, bl). Z dôvodov stability bol scBsTaFv CD33-CD3 skonštruovaný v novom tandemovom formáte, v ktorom bol bežne používaný spojovací prvok glycín-serín medzi dvoma protilátkovými doménami nahradený 18 aminokyselinovou (aa) dlhou sekvenciou EKEALKKIIEDQQESLNK, ktorú sme nazvali l -Tag (Bachmann, neuverejnené). Sekvencia tohto nového linkerového prvku je odvodená od jadrového proteínu známeho ako La proteín. 8 Variabilné časti ťažkého a ľahkého reťazca v scBsTaFv CD33-CD3 sú usporiadané v poradí VH CD3 – G 4 S-linker – VL CD3 – l-Tag – VH CD33 – G 4 S-linker – V L CD33, Na presmerovanie efektorových buniek exprimujúcich aktivačný receptor NKG2D sme vyvinuli bišpecifický imunoglobulín ULB-scFv CD33 (obrázok 1A, a3 (i) a obrázok 1C). Podobne ako rodičovská anti-CD33 mAb, aj oba rekombinantné konštrukty bišpecifických anti-CD33 sú schopné tvoriť stabilné imunitné komplexy na povrchu AML blastov (obrázok 1A, a2 a a3 (i) - (iii)). anti-CD33 deriváty sú antigén špecifické z niekoľkých dôvodov: (i) všetky anti-CD33 abs sa tiež viažu na bunky Hek293T transdukované CD33, ale nie na CD33-negatívne bunky Hek293T, a (ii) väzbu rekombinantných derivátov protilátok na CD33- Pozitívne bunky Hek293T a AML blasty sú blokované rodičovskou anti-CD33 mAb (údaje nie sú uvedené).

Image

Charakterizácia nových anti-CD33 mAb a rekombinantných bišpecifických derivátov skonštruovaných na presmerovanie CD3 + - a / alebo NKG2D + -faktorových buniek. ( A ) Stabilné imunitné komplexy tvorené na povrchu AML blastov pacientov novými anti-CD33 protilátkami: (a1 (i) - (iii)) materská anti-CD33 mAb DRB2, (a2 (i) až (iii) ) nová bišpecifická scBsTaFv CD33-CD3 protilátka a (a3 (i) až (iii)) nová bišpecifická imuno-ligand ULB-scFv CD33. Vytvorené imunitné komplexy (čierne grafy) boli analyzované 1 hodinu (al (ii), a2 (ii), a3 (ii)) a 48 hodín po vytvorení (al (iii), a2 (iii), a3 (iii)). Transparentné grafy predstavujú AML blasty zafarbené sekundárnou protilátkou. ( B ) Presmerovanie efektorových buniek CD3 + prítomných v čerstvo izolovaných PBMC na CD33-pozitívne AML blasty s použitím novej jednoreťazcovej bišpecifickej protilátky scBsTaFv CD33-CD3 (koncentrácia 2, 5 μg / ml). (b1) Schematické zobrazenie. (b2) Kill test vykonaný pre AML bunky piatich nezávislých pacientov pomocou efektora (E) na zameranie (T) bunkových pomerov medzi 5: 1 a 20: 1. ( C ) Opätovné zacielenie izolovaných vopred aktivovaných NK buniek pomocou nového imunoglobulínu ULB-scFv CD33 (koncentrácia 2, 5 μg / ml). (c1) Schematické zobrazenie. (c2) Výsledky testu usmrcovania pre jeden reprezentatívny príklad AML. ( D ) Presmerovanie NKG2D + efektorových buniek prítomných v čerstvo izolovaných PBMC na CD33-pozitívne AML blasty s použitím nového imunoglobulínu ULB-scFv CD33 (koncentrácia 2, 5 μg / ml). Výsledky testu na usmrtenie dvoch reprezentatívnych príkladov AML s použitím pomerov E k T medzi 5: 1 a 10: 1. ( E ) Kostimulácia izolovaných neaktivovaných (CD3 + NKG2D + ) CD8 + T-buniek simultánnou koaguláciou prostredníctvom imunoglobulínu NKG2D (ULB-scFv CD33) a bišpecifických protilátok scBsTaFv CD33-CD3 na CD33-pozitívne nádorové bunky ( koncentrácia každej protilátky 1, 25 μg / ml): (e1) schematické zobrazenie. (e2 – e4) Odhad uvoľňovania cytokínov vrátane IFN-γ (e2) a TNF-a (e3) alebo (e4) schopnosti usmrtiť čerstvo izolované (CD3 + NKG2D + ) CD8 + T bunky v neprítomnosti (bez proteínu), alebo prítomnosť buď samotného imunoglobulínu ULB-scFv CD33 alebo samotného bišpecifického scBsTaFv CD33-CD3 alebo kombinácie oboch bišpecifických anti-CD33 protilátok (ULB-scFv CD33 + scBsTaFv CD33-CD3). ( F ) Presmerovanie PBMC s imuno-ligandom NKG2D (ULB-scFv CD33) alebo bišpecifickými scBsTaFv CD33-CD3 alebo ich kombináciou na nádorové bunky pozitívne na CD33 (koncentrácia každej protilátky 1, 25 μg / ml): (f1 ) schematické zobrazenie. (f2 – f4) Odhad uvoľňovania cytokínov vrátane IFN-γ (f2) a TNF-a (f3) alebo (f4) schopnosti usmrtiť čerstvo izolované PBMC v neprítomnosti (bez proteínu) alebo prítomnosť imunoglobulínu ULB. -scFv CD33 samotný alebo bišpecifický scBsTaFv CD33-CD3 samotný alebo kombinácia oboch bišpecifických anti-CD33 protilátok (ULB-scFv CD33 + scBsTaFv CD33-CD3). Testy sa uskutočňovali pri uvedených pomeroch E k T. Štatistická analýza sa uskutočnila pomocou Studentovho t- testu. Úroveň významnosti je znázornená nasledovne: * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001.

Obrázok v plnej veľkosti

Na preukázanie funkčnosti obidvoch nových bišpecifických protilátkových konštruktov sa použili na presmerovanie ich príslušných efektorových buniek na AML bunky. Ako efektorové bunky sme v našej štúdii použili buď čerstvo pripravené PBMC (obsahujúce neaktivované T- a NK bunky) alebo izolované CD8 + T bunky alebo izolované vopred aktivované NK bunky. Všetky efektorové bunky boli pripravené zo vzoriek krvi zdravých darcov s ich informovaným súhlasom a súhlasom miestnej inštitucionálnej kontrolnej rady. CD8 + T bunky boli čerstvo izolované z PBMC negatívnou selekciou s použitím súpravy na izoláciu CD8 + T buniek (Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach, Nemecko). NK bunky boli izolované použitím súpravy na izoláciu ľudských NK buniek II (Miltenyi Biotech GmbH). Izolované NK bunky boli expandované a aktivované počas 6 dní 500 U / ml guľôčkami viazanými na IL-2 a 6 μl protilátky (súprava na aktiváciu / expanziu NK buniek (Miltenyi Biotech GmbH). Podľa fluorescenčne aktivovaného farbenia buniek (údaje nie sú uvedené) ) viac ako 99% izolovaných CD8 + T buniek alebo CD8 + T buniek prítomných v PBMC bolo zafarbených anti-NKG2D protilátkou, zatiaľ čo väčšina CD4 + T buniek bola negatívna na NKG2D. Ako sa očakávalo, jednoreťazcové bišpecifické scBsTaFv CD33-CD3 je schopný presmerovať PBMC obsahujúce neaktivované T bunky na AML bunky, čo vedie k účinnej lýze cieľových buniek (obrázok 1B, b2). AML bunky od piatich nezávislých pacientov boli analyzované buď v prítomnosti (obrázok 1B, b2, scBsTaFv CD33-CD3) alebo neprítomnosť jednoreťazcovej bišpecifickej protilátky (obrázok 1B, b2, bez proteínu). Ako sa tiež očakávalo, imuno-ligand ULB-scFv CD33 bol schopný presmerovať izolované predaktivované NK bunky na AML 1C, cl, c2). Zaujímavejšie je imuno-li Gand ULB-scFv CD33 je tiež schopný presmerovať čerstvo izolované PBMC (obrázok 1D). Účinná lýza AML buniek od dvoch reprezentatívnych pacientov je znázornená na obrázku 1D (dl, d2). Lýza sa pozorovala v prítomnosti (obrázok 1D, ULB-scFv CD33), ale nie v neprítomnosti (obrázok 1D, bez proteínu) imuno-ligandu. Pretože NK- aj NKG2D + CD8 + T bunky mohli prispievať k zabíjaniu AML buniek PBMC v prítomnosti imunoglobulínu ULB-scFv CD33 (obrázky 1E, F, el, f1), chceli sme sa zistiť, či NKG2D + T bunky, ktoré sú zapojené s CD33-pozitívnymi nádorovými bunkami prostredníctvom bišpecifických scBsTaFv CD33-CD3, môžu byť kostimulované pomocou imunoglobulínu ULB-scFv CD33 NKG2D (obrázok 1E, el). Reprezentatívne údaje sú uvedené na obrázku 1E (e2 – e4). Ako je znázornené na obrázku 1E, v neprítomnosti tak CD33-CD3 diabody, ako aj ULB-scFv CD33 imuno-ligandu, by sme sotva detegovali akýkoľvek interferón (IFN) -y (e2) alebo tumor nekrotizujúci faktor (TNF) -a (e3). ) v supernatante čerstvo izolovaných nestimulovaných CD8 + T buniek, keď sa kultivujú spolu s CD33-pozitívnymi nádorovými bunkami. V prítomnosti bišpecifického CD33-CD3 diabody sme zmerali asi 1200 pg / ml IFN-y. V prítomnosti imunoglobulínu ULB-scFv CD33 bola produkcia IFN-y menšia v porovnaní s bišpecifickými diabolskými CD33-CD3, ale stále dosiahla hladinu asi 750 pg / ml. Kombinácia bišpecifických CD33-CD3 diabody s ULB-scFv CD33 bola lepšia ako jednotlivé zlúčeniny a viedla k produkcii približne 2200 pg / ml IFN-y. Kombinácia jednoreťazcového bišpecifického CD33-CD3 diabody s imuno-ligandom ULB-scFv CD33 tiež viedla k sekrécii najvyššieho množstva TNF-a (obrázok 1E, e3, približne 120 pg / ml). CD8 + T bunky, ktoré boli zapojené do CD33-pozitívnych nádorových buniek samotným bišpecifickým CD33-CD3 diabody, produkovali významne menej TNF-a (asi 60 pg / ml). Je zaujímavé, že NKG2D + CD8 + T bunky nereagovali so sekréciou TNF-a v prítomnosti imunoglobulínu ULB-scFv CD33. Okrem toho tiež nedochádza k ničeniu AML buniek T bunkami v prítomnosti iba imunoglobulínu (obrázok 1E, e4). Ďalej, schopnosť usmrtenia T buniek v prítomnosti oboch bišpecifických anti-CD33 zlúčenín nie je významne zvýšená (obrázok 1E, e4). Tieto výsledky, ktoré sú v dobrej zhode s predtým publikovanými údajmi 6, 7 naznačujú, že signalizácia sprostredkovaná NKG2D môže potvrdiť signalizáciu prostredníctvom komplexu CD3 receptora T buniek, ale nie je dostatočná na usmrtenie cieľovej bunky. 6 V dôsledku toho bolo zabíjanie AML buniek v prítomnosti imunoglobulínu ULB-scFv CD33 pozorované PBMCs sprostredkované hlavne NK bunkami.

Stimulované týmito údajmi sme chceli vedieť, či súčasné presmerovanie T- a NK buniek v prítomnosti oboch bišpecifických protilátkových konštruktov anti-CD33 je lepšie ako presmerovanie jednej skupiny efektorových buniek (obrázok 1F, fl). Ako je znázornené na obrázku 1F (f2, f3), súčasné presmerovanie týchto efektorových buniek jasne vedie k zvýšenému uvoľňovaniu prozápalových cytokínov vrátane IFN-y (obrázok 1F, f2) a TNF-a (obrázok 1F, f3). Okrem toho kombinované presmerovanie zlepšuje účinnosť usmrcovania presmerovaných efektorových buniek (obrázok 1F, f4). Aby sa preukázal tento priaznivý účinok, lýza nádorových buniek sa uskutočňovala pri suboptimálnych koncentráciách oboch zlúčenín. Za týchto podmienok viedlo presmerovanie T buniek (vrátane T buniek pozitívnych na receptory NK buniek) k maximálnej lýze asi 60% nádorových buniek (pomer efektor k cieľovým bunkám 20: 1) a presmerovanie NK buniek (vrátane pozitívnych T buniek) pre NK bunkové receptory) viedla k maximálnej lýze asi 50%, zatiaľ čo súčasné presmerovanie týchto imunitných efektorových buniek zvýšilo lýzu cieľových buniek na takmer 100% (obrázok 1F, f4).

V súhrne sme tu opísali dva nové bišpecifické konštrukty anti-CD33 protilátok na zapojenie CD33-pozitívnych AML blastov buď CD3 + a / alebo NKG2D + efektorových buniek. NKG2D + CD8 + T bunky presmerované komplexom CD3 sa kostimulovali dráhou receptora NKG2D. Okrem toho je súčasné presmerovanie T- a NK buniek lepšie ako presmerovanie jednej imunitnej efektorovej bunky. Obidva deriváty anti-CD33 sú teda sľubnými kandidátmi na ďalší vývoj smerom ku klinickému testovaniu buď samostatne alebo v kombinácii.