Výber vhodných referenčných génov pre kvantitatívnu analýzu expresie pcr génov v salix matsudane v reálnom čase v rôznych abiotických stresoch | vedecké správy

Výber vhodných referenčných génov pre kvantitatívnu analýzu expresie pcr génov v salix matsudane v reálnom čase v rôznych abiotických stresoch | vedecké správy

Anonim

predmety

  • abiotické
  • Molekulárne inžinierstvo v rastlinách

abstraktné

Salix matsudana je opadavý, rýchlo rastúci druh vŕby bežne pestovaný v Číne, ktorý dokáže tolerovať sucho, soľ a stresové podmienky ťažkých kovov. Výber vhodných referenčných génov pre kvantitatívnu real-time PCR je dôležitý pre normalizáciu expresie kľúčových génov spojených s rôznymi stresmi. Na overenie vhodných referenčných génov sme vybrali 11 kandidátskych referenčných génov (päť tradičných génov pre domácnosť a šesť nových génov) a analyzovali sme ich expresnú stabilitu v rôznych vzorkách vrátane rôznych tkanív a pri rôznych ošetreniach abiotickým stresom. Expresia týchto génov bola stanovená pomocou piatich programov - geNorm, NormFinder, BestKeeper, ACt a RefFinder. Výsledky ukázali, že a-TUB2 (alfa-tubulín 2) a DnaJ (chaperónový proteín DnaJ 49) boli najstabilnejšie referenčné gény vo všetkých testovaných vzorkách. Merali sme expresné profily génu obrannej odozvy SmCAT (kataláza) pomocou dvoch najstabilnejších a najmenej stabilných referenčných génov vo všetkých vzorkách S. matsudana . Relatívna kvantifikácia SmCAT sa veľmi líšila podľa rôznych referenčných génov. Navrhujeme, aby boli a-TUB2 a DnaJ preferovanými referenčnými génmi pre normalizáciu a kvantifikáciu transkripčných hladín v budúcich štúdiách génovej expresie u vŕbných druhov za rôznych abiotických stresových podmienok.

úvod

Stres zo sucha, soli a ťažkých kovov sú hlavnými abiotickými faktormi, ktoré prispievajú k riziku životného prostredia a ovplyvňujú produktivitu lesného hospodárstva na celom svete 1, 2, 3, 4, 5 ; za nepriaznivých okolností však rastliny musia prosperovať 6 . Štúdie o účinkoch rôznych abiotických stresov boli zamerané na rastliny s krátkymi rastovými cyklami, ako napríklad Arabidopsis thaliana 7, sója 8, cirok 9, juta 10, Sedum alfredii 11, ryža 12 a tabak 13, a niekoľko štúdií. boli uskutočňované na rastlinách s dlhými rastovými cyklami pri rôznych stresových podmienkach. Rastliny s krátkym rastovým cyklom sú obmedzené nízkou biomasou, zatiaľ čo rastliny (najmä dreviny) s vysokou biomasou a dlhé rastové cykly sú schopné zvládnuť ťažké abiotické stresové podmienky. Iba malý počet referenčných génov bol zaznamenaný u stromov v podmienkach sucha, slanosti a stresu ťažkých kovov 14, 15, 16, 17, 18 .

Rod Salix (Salicaceae) obsahuje na celom svete viac ako 450 druhov vŕby; 275 z týchto druhov rastie v Číne 19, 20, 21, 22 . Druhy vŕby sa používajú na výrobu energie, zalesňovanie a ekologizáciu vďaka svojej vysokej biomase, rýchlemu rastu a schopnosti prispôsobiť sa rôznym stresovým podmienkam 23, 24, 25, 26, 27, 28 . Salix matsudana je opadavý, rýchlo rastúci druh vŕby bežne pestovaný v Číne, ktorý toleruje stres zo sucha, soli a ťažkých kovov 29, 30, 31, 32, 33 . Fyziologické a biochemické vlastnosti boli charakterizované v S. matsudana 34, 35 . Medzitým boli identifikované niektoré kľúčové gény, ktoré regulujú faktory stresovej reakcie v stresovaných rastlinách na molekulárnej úrovni 36, 37, 38 . Porozumenie vzorcom expresie kľúčových génov odozvy na stres pomôže objasniť mechanizmy zapojené do rôznych stresov S. matsudana .

Analýza génovej expresie bola použitá na pochopenie rôznych druhov biologických procesov 39 . Kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (qRT-PCR) sa široko používa na analýzu génovej expresie vďaka svojej vysokej citlivosti, presnosti, špecifickosti a reprodukovateľnosti 40, 41, 42 . Faktory ako množstvo vzorky, integrita RNA, účinnosť reverznej transkripcie a kvalita cDNA však môžu významne ovplyvniť spoľahlivosť výsledkov génovej expresie 43, 44, 45 . Na zníženie vplyvu týchto faktorov sa používajú interné referenčné gény na získanie presných biologicky významných hodnôt expresie 46 ; nestabilné referenčné gény však môžu spôsobiť významné skreslenie a nesprávnu interpretáciu údajov o expresii 47, 48 . Aktín ( ACT ) a p- tubulín ( P-TUB ) sa použili ako referenčné gény pre normalizáciu qRT-PCR v analýze génovej expresie v S. matsudane pod napätím soli a medi 37, 49 ; systematická štúdia na validáciu referenčných génov však nebola publikovaná pre S. matsudana pri abiotických stresoch . Aby sa získali presné údaje o expresii, je potrebné vybrať vhodné referenčné gény pre každý druh rastlín a overiť ich stabilitu za konkrétnych špecifických experimentálnych podmienok.

V tejto štúdii sme určili profily expresie 11 kandidátnych referenčných génov od S. matsudana v šiestich rôznych tkanivách a pod tromi druhmi abiotických stresov. 11 kandidátnych génov boli ACT , alfa-tubulín 1 ( a-TUB1 ), alfa-tubulín 2 ( a-TUB2 ), chaperónový proteín DnaJ 49 ( DnaJ ), E3 ubikvitín-proteín ligáza ARI8 ( ARI8 ), proteín rodiny F-boxov ( F-box ), histón H2A ( H2A ), proteín s tepelným šokom 70 kDa ( HSP 70 ), glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza ( GAPDH ), membránou ukotvený ubikvitín-násobný proteín ( MUB ) a p-TUB . Transkripčné údaje S. matsudana sa použili ako zdroj potenciálnych referenčných génov (neuverejnené údaje). Stability 11 referenčných génov sa analyzovali pomocou piatich štatistických algoritmov - geNorm 43, NormFinder 44, BestKeeper 50, ACCt 51 a RefFinder, webový softvér 52 . Hladiny expresie génu obrannej odozvy SmCAT (kataláza) ako cieľového génu boli testované na overenie vybraných referenčných génov. Výsledky poskytnú vhodné referenčné gény pre normalizáciu qRT-PCR na presnú analýzu génovej expresie v S. matsudana za rôznych stresových podmienok.

Materiály a metódy

Rastlinné materiály a ošetrenie stresom

Odrezky (približne 10 cm dlhé) z jednoročných vetiev S. matsudana sa pestovali v hydroponii. Rastliny boli doplnené vodou obsahujúcou 1/4 roztoku Hoagland 53 v striedavých dňoch za normálnych podmienok (25 ° C, 16 hodín svetlo / 8 hodín tmy). Po 45 dňoch kultivácie boli skupiny sadeníc S. matsudana vystavené rôznym abiotickým stresom v roztokoch obsahujúcich Hoaglandov roztok s koncentráciou 1/4 pri pH 6, 0 nasledovne: sucho (15% PEG 6000), soľ (100 mM NaCI) a ťažké kov (100 uM CdCl2). Ako kontrola sa použili neošetrené sadenice. Vzorky z koreňov ošetrených rastlín sa odobrali po 0 h, 12 h, 24 h, 48 h a 72 h. Tkanivá z koreňov, xylému, kôry, stonky, listov a kvetov sa odobrali z neošetrených rastlín. Všetky vzorky z troch biologických replikátov boli starostlivo zozbierané, okamžite zmrazené v tekutom dusíku a skladované pri -80 ° C až do úplnej extrakcie RNA.

Celková izolácia RNA a syntéza cDNA

Celková RNA z každej vzorky sa izolovala z približne 0, 1 g čerstvého koreňa s použitím kompletnej súpravy RNA (NORGEN, Thorold, Kanada) a ošetrila sa DNázou I (TaKaRa, Dalian, Čína), aby sa odstránila akákoľvek kontaminácia genómovou DNA. Koncentrácia RNA každej vzorky bola stanovená pomocou spektrofotometra NanoDrop-2000 (Thermo, Wilmington, USA). Vzorky s pomerom 260/280 1, 9-2, 1 a pomerom 260/230 ≥ 2, 0 boli vybrané na stanovenie kvality a čistoty prípravkov RNA. Integrita purifikovanej RNA bola skontrolovaná elektroforézou na agarózovom géli s 1, 0% (p / v). Následne sa cDNA prvého vlákna syntetizovala v 20 ul reakčnej zmesi v systéme syntézy syntetických vlákien prvého vlákna Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, USA) podľa pokynov výrobcu a do použitia sa skladovala pri -20 ° C.

Skríning kandidátnych referenčných génov a návrh primérov

Z údajov transkriptómu S. matsudana sme identifikovali 11 kandidátnych referenčných génov a jeden cieľový gén (tabuľka 1). Priméry boli navrhnuté na základe sekvencií 11 génov pomocou Primer3 (//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/) s nasledujúcimi kritériami: obsah GC 45–65%, optimálny Tm 58–61 ° C, dĺžka priméru 18 - 22 bp a dĺžka amplikónu 120 - 220 bp (tabuľka 1). Špecifickosť každého vybraného páru primérov sa pozorovala pomocou štandardnej RT-PCR s použitím Premix Ex Taq (TaKaRa, Dalian, Čína) a každý gén sa overil elektroforézou na 2% agarózovom géli a sekvenoval sa, aby sa zabezpečila jeho spoľahlivosť.

Tabuľka v plnej veľkosti

QRT-PCR

Amplifikácia qRT-PCR sa uskutočňovala na 96-jamkových doštičkách s Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) s použitím SYBR® Premix Ex Taq ™ (TaKaRa, Dalian, Čína). PCR reakcie sa pripravili v 20 μl objemoch obsahujúcich: 2 μl 50-násobne nariedenej syntetizovanej cDNA, 10 μl 2 x SYBR Premix Ex Taq ™, 0, 8 μl každého priméru, 0, 4 μl ROX referenčného farbiva (50x) a 6, 8 μl ddH 20 O. Reakcie zahŕňali počiatočný krok pri 95 ° C počas 30 s, potom nasledovalo 40 denaturačných cyklov pri 95 ° C počas 5 s a žíhanie priméru pri 60 ° C počas 31 s. Ďalej sa v každej reakcii vyhodnotili krivky topenia v rozsahu od 60 ° C do 95 ° C, aby sa skontrolovala špecificita amplikónov. Biologické triplikácie všetkých vzoriek sa použili na analýzu qRT-PCR a pre každú biologickú vzorku sa analyzovali tri technické replikácie. Prahový cyklus (Ct) sa meral automaticky.

Štatistická analýza na stanovenie stability expresie kandidátnych referenčných génov

V programe Microsoft Excel 2013 boli vygenerované štandardné krivky na výpočet účinnosti génovo špecifickej PCR a korelačného koeficientu z 5-násobného riedenia zmiešanej šablóny cDNA (kvet, kôra a kmeň) pre každý pár primérov. Amplifikačné grafy, krivky topenia a píky sekvenovania boli uvedené na Obrázku Sla, b, c. Účinnosť amplifikácie PCR ( E ) a korelačný koeficient sa vypočítali pomocou sklonu štandardnej krivky podľa rovnice E = [ 5-1 / sklon - 1] x 100. Stabilita 11 vybraných referenčných génov sa vyhodnotila štyrmi algoritmami. -Norm, NormFinder, BestKeeper a metóda ΔCt. Nakoniec, RefFinder (//www.fulxie.0fees.us), komplexná evalučná platforma integrujúca štyri vyššie uvedené algoritmy, hodnotila celkovú stabilitu týchto 11 kandidátnych génov. Na určenie optimálneho počtu kandidátnych referenčných génov na presnú normalizáciu sa použili párové variácie založené na výpočte geNorm.

Normalizácia expresie génu SmCAT na základe rôznych referenčných génov

Gén obrannej reakcie SmCAT bol vybraný ako cieľový gén na meranie stability kandidátnych referenčných génov kvantifikáciou hladín expresie SmCAT vo všetkých testovaných vzorkách. Úrovne expresie génov SmCAT boli normalizované s dvoma najstabilnejšími referenčnými referenčnými génmi ( a-TUB2 a DnaJ ), ako aj s jedným z najmenej stabilných referenčných génov ( p-TUB ).

výsledok

qRT-PCR dáta pre kandidátne referenčné gény

11 vybraných kandidátnych referenčných génov (tabuľka 1) sú ortology génov v Salix purpurea , pre ktoré bol celý genóm sekvenovaný. Špecifickosť a presnosť primerov navrhnutých pre vybrané gény sa stanovila elektroforézou na 2% agarózovom géli (obrázok S2a) a ďalej sa potvrdil jediným píkom v analýze krivky topenia (obrázok S2b). Sekvencie primérov, dĺžka amplikónu, korelačný koeficient a účinnosť PCR amplifikácie sú uvedené v tabuľke 1. Ďalej boli produkty qRT-PCR sekvenované (súbor SI), aby sa stanovila presnosť 11 génov.

Na vyhodnotenie stability 11 kandidátnych referenčných génov na úrovni transkriptu za troch podmienok abiotického stresu boli úrovne génovej expresie stanovené pomocou priemerných hodnôt Ct, ktoré sa menili od 17 do 30 (obr. 1). Podľa priemerných hodnôt Ct všetkých vzoriek bol a-TUB1 najčastejšie exprimovaný gén, nasledovaný DnaJ, a-TUB2 a F-box , zatiaľ čo H2A bol najmenej hojne exprimovaný gén, nasledovaný P-TUB, ACT a MUB .

Image

Obrázok v plnej veľkosti

Analýza stability génovej expresie

Stabilita expresie 11 kandidátnych referenčných génov sa stanovila pomocou geNorm, NormFinder, ACt a BestKeeper a ich celková stabilita sa hodnotila pomocou RefFinder vo všetkých záťažových ošetreniach a vzorkách tkanív.

analýza geNorm

Stability 11 kandidátnych referenčných génov S. matsudana vypočítané pomocou geNorm boli zoradené v rôznych tkanivách a ošetrení abiotickým stresom podľa ich M hodnôt, ako je znázornené na obrázku 2. Najnižšia hodnota M označuje najstabilnejší referenčný gén a najvyššia hodnota M označuje najmenej stabilnú hodnotu. DnaJ a ARI8 mali najvyššiu stabilitu expresie v šiestich tkanivách a všetky gény mali hodnoty M pod prahom 1, 5 (obr. 2a). Horné dva najstabilnejšie gény boli DnaJ a a-TUB2 pre stres zo sucha a ťažkých kovov a a-TUB2 a MUB pre soľ zo stresu (obr. 2b, c, d). Keď sa spojili stability zo všetkých vzoriek, určili sa DnaJ a a-TUB2 ako najstabilnejšie referenčné gény vo všetkých vzorkách (obr. 2e), zatiaľ čo p-TUB mal menšiu stabilitu.

Image

a) rôzne tkanivá, b) ošetrenie suchom, c) ošetrenie soľou, d) ošetrenie ťažkými kovmi, e) všetky vzorky.

Obrázok v plnej veľkosti

Párová variácia (Vn / Vn + 1 ) medzi dvoma sekvenčnými normalizačnými faktormi NFn a NFn + 1 bola vypočítaná pomocou algoritmu geNorm na stanovenie optimálneho počtu referenčných génov pre presnú normalizáciu. Limitovaná hodnota 0, 15 je odporúčaná prahová hodnota naznačujúca, že ďalší referenčný gén nebude významne prispievať k normalizácii. Hodnoty V2 /3 v tkanivách, soliach a ťažkých kovoch boli nižšie ako 0, 15 (obr. 3), čo naznačuje, že horné dva referenčné gény boli dostatočné na presnú normalizáciu. Pre vzorky stresu zo sucha V4/ 5 bolo 0, 123, čo naznačuje, že na presnú normalizáciu boli potrebné prvé štyri referenčné gény ( DnaJ, a-TUB2, MUB a ACT ). Pre celkový počet vzoriek V3 /4 bol 0, 138, čo ukazuje, že boli potrebné tri referenčné gény ( DnaJ, a-TUB2 a MUB ).

Image

Priemerné párové variácie (Vn / Vn + 1) sa analyzovali, aby sa zmeral účinok pridania referenčného génu na qRT-PCR.

Obrázok v plnej veľkosti

Analýza NormFinder

Ako je uvedené v tabuľke 2, DnaJ bol najstabilnejší gén (najnižšia hodnota stability) v podsúboroch soli a sucha vypočítaných pomocou NormFinder. Vo vzorkách ťažkých kovov bol a-TUB2 najstabilnejší gén, zatiaľ čo ARI8 bol najstabilnejší gén v rôznych tkanivách. Keď sa všetky vzorky odobrali spolu, aby sa stanovila stabilita referenčných génov, tri najstabilnejšie gény boli a-TUB2, ARI8 a DnaJ .

Tabuľka v plnej veľkosti

ΔCt analýza

11 kandidátnych referenčných génov od najstabilnejšej do najmenej stabilnej expresie, vypočítaných pomocou metódy ACt , sú uvedené v tabuľke 3. a-TUB2 bol najstabilnejší referenčný gén v podsúboroch sucha, ťažkých kovov a celkového množstva. MUB a ARI8 boli najstabilnejšie gény pre soľnú podskupinu a rôzne tkanivá, a boli považované za ideálne referenčné gény.

Tabuľka v plnej veľkosti

Analýza BestKeeper

BestKeeper určil stability kandidátnych referenčných génov na základe ich štandardnej odchýlky (SD). Gény s SD> 1 sa považovali za neprijateľné referenčné gény. Gény sú uvedené od najstabilnejších génov v tabuľke 4. DnaJ bol najstabilnejší gén v podmnožinách tkanív a sucha, zatiaľ čo GAPDH a a-TUB2 boli najstabilnejšími génmi v podskupinách ťažkých kovov a solí.

Tabuľka v plnej veľkosti

RefFinder analýza

Aby sa získali spoľahlivé výsledky pre stabilitu expresie 11 kandidátnych referenčných génov S. matsudana , poradie štyroch algoritmov sa integrovalo pomocou RefFinder a výsledky sú uvedené v tabuľke 5. 11 génov sa zoradilo od najstabilnejšej k najmenej stabilnej expresii. podľa RefFinder (obr. 4). Expresia a-TUB2 bola zaradená medzi najstabilnejšie pod stresovým ošetrením soľou a ťažkými kovmi a expresia DnaJ bola zaradená medzi najstabilnejšie pri stresovom ošetrení suchom. Celkovo bol najlepším referenčným génom pre presnú normalizáciu transkriptu vo všetkých vzorkách a-TUB2 , ktorý mal najnižší geomean (geometrický priemer) hodnotových hodnôt.

Tabuľka v plnej veľkosti

Image

Nižšia geomovská hodnota znamená stabilnejšiu expresiu.

Obrázok v plnej veľkosti

Overenie referenčného génu

Na overenie výkonnosti najlepšie hodnotených kandidátnych referenčných génov sa analyzovali expresné vzorce SmCAT (katalázy) (obr. 5). C AT ako gény indukovateľné abiotickým stresom sú regulované pôsobením sucha 54, soli 55 a Cd 56 . CAT s nízkou afinitou k H202, ale s vysokou rýchlosťou spracovania 57, môže fungovať prostredníctvom komplexného sieťového zariadenia, aby sa zabránilo poškodeniu spôsobenému ROS 58 . V tejto štúdii sme použili najstabilnejšie referenčné gény ( a-TUB2 a DnaJ ) a najmenej stabilný gén ( P-TUB ) ako vnútorné kontroly na normalizáciu SmCAT podľa rebríčka RefFinder. Profily expresie SmCAT boli stanovené v rôznych tkanivách a pri stresu spôsobenom suchom, soľou a ťažkými kovmi. Keď sa na normalizáciu použili stabilné referenčné gény a-TUB2 a DnaJ , vykazoval SmCAT podobné trendy expresie. Keď sa však na normalizáciu použil najmenej stabilný referenčný gén ß-TUB , expresné vzorce SmCAT sa líšili od vzorov získaných pomocou dvoch stabilných referenčných génov.

Image

,

Obrázok v plnej veľkosti

diskusia

Abiotické stresové podmienky vrátane sucha, soli a ťažkých kovov prinášajú veľké straty pre produktivitu lesného hospodárstva a zvyšujú riziko pre životné prostredie. Aby sa zaručila udržateľná produktivita lesného hospodárstva a znížilo sa riziko životného prostredia, je nevyhnutné porozumieť regulácii a funkcii kľúčových génov pri rôznych abiotických stresoch. Aby sa študovali variácie génovej expresie a určili sa vzory génovej regulácie, sú nevyhnutné referenčné gény predpokladom pre presné stanovenie hladín expresie cieľových génov. qRT-PCR je spoľahlivá a presná technika na meranie hladín génovej expresie. V rastlinách sa detegovali niektoré vhodné referenčné gény pod abiotickým stresom, ako napríklad GAPDH 59, 60 a DnaJ10 . počet hodnotených referenčných génov je však obmedzený, najmä v prípade drevín.

S. matsudana je v Číne dôležitým materiálom na zalesňovanie a ekologizáciu, ktorý sa dokáže prispôsobiť drsnému prostrediu vrátane sucha, soli a ťažkých kovov. Dobré pochopenie molekulárnych mechanizmov súvisiacich s reakciami na abiotický stres v drevinách prispeje nielen k zlepšeniu produktivity lesného hospodárstva, ale tiež k zníženiu rizika pre životné prostredie. Niekoľko štúdií skúmalo schopnosť S. matsudana odolávať rôznym abiotickým stresom; Štúdium referenčných génov vo vŕbách však zaostáva za štúdiom iných hlavných druhov rastlín. Na vyriešenie tohto problému sme analyzovali expresiu 11 kandidátnych referenčných génov, piatich tradičných referenčných génov ( ACT, a-TUB1, a-TUB2, β-TUB a GAPDH ) a šiestich nových génov ( DnaJ, ARI8, MUB, HSP70, F-box a H2A ) v rôznych tkanivách, vrátane koreňov S. matsudana pri rôznych abiotických stresoch s použitím metód qRT-PCR. Najlepšie a najhoršie kandidátske referenčné gény boli ďalej overené profilovaním expresie génu SmCAT obrannej reakcie.

Použili sme päť rôznych štatistických algoritmov na stanovenie stability kandidátneho referenčného génu (génov) za rôznych podmienok abiotického stresu v S. matsudana . Výsledky uvedené v tabuľke 5 ukázali, že geNorm, NormFinder, ACt a RefFinder vo väčšine častí konzistentne hodnotili rovnaké gény ako najstabilnejšie kandidátne referenčné gény. Algoritmus BestKeeper sa líši od ostatných algoritmov, čo vysvetľuje, prečo výsledky BestKeeper ukázali najmenšiu koreláciu s ostatnými 61 . Preto sme vybrali referenčný (é) gén (y) určený pomocou geNorm, NormFinder, ΔCt a RefFinder.

a-TUB2 a DnaJ boli dva najstabilnejšie referenčné gény vo všetkých súboroch vzoriek podľa štyroch algoritmov. a-TUB2 kódujúci proteín 62 cytoskeletovej štruktúry a DnaJ kódujúci bunkový chaperón majú schopnosť opraviť tepelne indukované poškodenie proteínového zariadenia 63, 64 . Naše výsledky sú v súlade s niekoľkými predchádzajúcimi štúdiami, ktoré ukázali, že a-TUB2 a DnaJ boli stanovené ako najstabilnejšie referenčné gény v rastlinách pod abiotickým stresom; napríklad v Syntrichia caninervis za sucha, soli a namáhania ťažkými kovmi 65, Corchorus capsularis v období sucha stres 10, Buchloe dactyloides pod soľným stresom 66 a Platycladus orientalis pod soľným stresom 67 . Normalizácia pomocou viacerých referenčných génov je účinným spôsobom, ako sa vyhnúť chybným údajom, ktoré môžu vyplynúť z použitia jediného referenčného génu 68 . V tejto štúdii boli na normalizáciu génovej expresie vhodné dva najvyššie hodnotené referenčné gény, DnaJ a a-TUB2 pod stresom ťažkých kovov a a-TUB2 a MUB pod soľným stresom. Na presnú normalizáciu boli potrebné štyri referenčné gény, DnaJ, a-TUB2, MUB a ACT v období sucha. Zistilo sa, že dva referenčné gény postačujú na analýzu expresie cieľových génov v ciroku 62, jute 10 a machu 65 .

Významné rozdiely sa zistili vo vzorcoch expresie cieľového génu SmCAT, keď sa normalizoval s dvoma najstabilnejšími génmi ( a-TUB2 a DnaJ ) v porovnaní s jedným z najmenej stabilných génov ( β-TUB ) (obr. 5). Výsledky zdôrazňujú dôležitosť použitia stabilných referenčných génov na normalizáciu. Naše zistenia naznačujú, že a-TUB2 a DnaJ buď jednotlivo alebo v kombinácii sú vhodné na normalizáciu génovej expresie v S. matsudana pri rôznych abiotických stresoch . Preto odporúčame a-TUB2 a DnaJ ako najvhodnejšie referenčné gény na normalizáciu qRT-PCR expresných údajov v S. matsudana za rôznych podmienok abiotického stresu.

Pokiaľ je nám známe, toto je prvá správa o identifikácii a validácii vhodných referenčných génov pre analýzu qRT-PCR v S. matsudana pri abiotických stresoch .

záver

Na overenie vhodných referenčných génov pre normalizáciu génovej expresie v S. matsudana pri stresoch suchom, soľou a ťažkými kovmi sme vybrali 11 kandidátnych referenčných génov pomocou štyroch systematických štatistických algoritmov (geNorm, NormFinder, ΔCt a BestKeeper). Získané výsledky boli porovnané a zoradené pomocou RefFinder. Na základe analýzy stability génov sme identifikovali a-TUB2 a DnaJ ako najstabilnejšie referenčné gény pre normalizáciu génovej expresie v podmienkach sucha, solí a ťažkých kovov. Ako vhodné referenčné gény sa môžu použiť aj profily expresie a-TUB2 a DnaJ validované pomocou SmCAT . Referenčné gény identifikované v tejto štúdii uľahčia presnú a konzistentnú analýzu expresie génov tolerancie voči stresu vo vŕbách a drevinách za rôznych abiotických stresových podmienok pre funkčné genomické štúdie.

Ďalšie informácie

Ako citovať tento článok : Zhang, Y. et al . Výber vhodných referenčných génov pre kvantitatívnu analýzu génovej expresie PCR v reálnom čase v Salix matsudana pri rôznych abiotických stresoch . Sci. Rep. 7, 40290; doi: 10, 1038 / srep40290 (2017).

Poznámka vydavateľa: Springer Nature zostáva neutrálny, pokiaľ ide o nároky na jurisdikciu v uverejnených mapách a inštitucionálne pridruženie.

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplnková informácia

Komentáre

Odoslaním komentára súhlasíte s tým, že budete dodržiavať naše zmluvné podmienky a pokyny pre komunitu. Ak zistíte, že je niečo urážlivé alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte ho ako nevhodné.