Znížená funkcia tet2 vedie k t-bunkovým lymfómom s vlastnosťami podobnými t-bunkám podobným folikulovému pomocníkovi | časopis o rakovine krvi

Znížená funkcia tet2 vedie k t-bunkovým lymfómom s vlastnosťami podobnými t-bunkám podobným folikulovému pomocníkovi | časopis o rakovine krvi

Anonim

predmety

  • Modely rakoviny
  • T-bunkový lymfóm

abstraktné

TET2 (desaťnásobná translokácia 2) je dioxygenáza, ktorá prevádza metylcytozín (mC) na hydroxymetylcytozín (hmC). Straty funkcie TET2 sú veľmi časté v podtypoch lymfómu T-buniek, ktoré majú vlastnosti podobné folikulovému pomocnému T (Tfh), ako je angioimmunoblastický lymfóm T-buniek (30–83%) alebo periférny lymfóm T-buniek., inak nešpecifikované (10–49%), ako aj myeloidné malignity. Tu je ukázané, že myši Tet2 so stredným vekom ( Tet2 gt / gt ) vykazujú nadmernú produkciu buniek Tfh v slezine v porovnaní s kontrolnými myšami. U myší s knockdown Tet2 sa nakoniec vyvinie lymfóm T-buniek s rysmi podobnými Tfh po dlhej latencii (medián 67 týždňov). Transcriptómová analýza odhalila, že tieto lymfómové bunky mali génovú expresiu podobnú Tfh v porovnaní so slezinnými CD4-pozitívnymi bunkami myší divokého typu. Lymfómové bunky vykazovali nižšie hustoty hmC okolo počiatočného miesta transkripcie (TSS) a vyššie hustoty mC v oblastiach TSS, génového tela a ostrovov CpG. Tieto epigenetické zmeny, pozorované pri lymfóme vyvolanom nedostatkom Tet2 , pravdepodobne prispeli k predčasnému rastu buniek podobných Tfh a následnej lymfhomagenéze. Tu opísaný myšací model naznačuje, že mutácie TET2 hrajú hlavnú úlohu pri vývoji lymfómu T-buniek s rysmi podobnými Tfh u ľudí.

úvod

V cicavčích bunkách fungujú tri proteíny TET (desať jedenásť translokácií), TET1, TET2 a TET3, ako metylcytozín dioxygenázy, ktoré bežne premieňajú metylcytozín (mC) na hydroxymetylcytozín (hmC), čo sa považuje za esenciálny medziprodukt aktívnej aj pasívnej demetylácie. procesy. 1, 2 Ďalej sa predpokladá, že hmC slúži aj ako alternatívna epigenetická značka k mC pri regulácii génovej expresie. 3, 4 Jeho biologická funkcia však zostáva nejasná. 5

Mutácie TET2 sa často vyskytujú pri myeloidných malignitách (myelodysplastické syndrómy, 14–26%; myeloproliferatívny novotvar, 7, 6–37% a akútne myeloidné leukémie, 12–43%). 6, 7, 8, 9 Straty funkcie TET2 sú spojené s aberantnými vzormi metylácie DNA pri myeloidných malignitách. 10, 11 Zaujímavé je, že mutácie TET2 sú veľmi časté v subtypoch lymfómu T-buniek, ako je angioimmunoblastický lymfóm T-buniek (AITL, 30–83%) a periférnych lymfómoch T-buniek, ak nie je uvedené inak (PTCL-NOS, 10). -49%). 12, 13, 14 sa predpokladá, že AITL vychádza z folikulárnych pomocných T (Tfh) buniek, na základe zistení z profilovania génovej expresie a imunohistochemického farbenia. 15, 16 Tfh buniek existuje vo folikuloch lymfatických uzlín a sleziny a interaguje s folikulárnymi B bunkami a bunkami prezentujúcimi antigén. 17, 18 B-bunková leukémia / lymfóm 6 ( Bcl6 ) a v-maf vtáčieho onkogénneho homológu fibrosarkómu ( cMaf ) kódujú kľúčové transkripčné faktory, ktoré riadia diferenciáciu a proliferáciu Tfh. 19 Tfh buniek exprimuje na povrchu bunky ko-stimulačné molekuly, ako je napríklad programovaná bunková smrť 1 (PD1) a indukovateľný kostimulátor T-buniek (Icos), 20, ako aj chemokínové receptory, ako napríklad chemokínový (CXC motív) receptor (5x5)., 21, 22, 23, 24, 25 PTCL-NOS je skupina heterogénnych lymfómov T-buniek, z ktorých niektoré tiež vykazujú rysy podobné Tfh.

Funkcia Tet2 bola doteraz hodnotená u rôznych knockout / knockdown myší. Bežné fenotypy pozorované po strate Tet2 sú zvýšená frekvencia frakcie negatívnych na líniu, Sca1-pozitívnych a c-Kit-pozitívnych (LSK), zvýšená konkurenčná repopulačná kapacita a sklonená diferenciácia na myeloidné línie. 14, 26, 27, 28, 29, 30 Bolo hlásené, že u niektorých myší, ktoré nevylučujú Tet2, sa vyvinuli myeloidné malignity, ktoré sa podobajú chronickej myelomonocytovej leukémii (CMML). 14, 26, 27

Tu je ukázané, že myši Tet2, ktoré sa zbavujú koňa, vyvíjajú lymfóm T-buniek s vlastnosťami podobnými Tfh. Komplexná analýza génovej expresie a analýza metylácie a hydroxymetylácie DNA odhalila epigenetické zmeny v lymfómových bunkách.

Materiály a metódy

myši

Myši s lapačom génov Tet2 , v ktorých je do druhého intrónu vložená poly-A zachytávajúca kazeta obsahujúca gén rezistencie na p-galaktozidázu / neomycín, 31 bolo kúpených od spoločnosti TransGenic Inc. (Kumamoto, Japonsko). Myši sa genotypizovali pomocou chvostovej DNA PCR s použitím primerov uvedených v doplnkovej tabuľke 7. Myši sa krížili> 8-krát na pozadí C57BL / 6. Pokusy sa uskutočňovali podľa Príručky pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat na univerzite v Tsukube.

Analýza génovej expresnej sústavy

Analýza génovej expresie bola uskutočnená so vzorkami z buniek CD4 + z myší Tet2 gt / gt vyvíjajúcich lymfóm alebo z myší divého typu (WT) s myšou GeneChip Mouse Gene 1.0 ST (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), podľa pokyny výrobcu. Prístupové číslo génového expresného omnibusu (GEO) pre údaje o mikročipoch uvedené v tomto článku je GSE52430. Viac informácií nájdete v časti Doplnkové metódy.

MeDIP a hMeDIP sekvenovanie

Protokoly sekvenovania MeDIP a hMeDIP sa uskutočňovali, ako je opísané, s malými modifikáciami. 32 Prístupové čísla DNA Data Bank of Japan (DDBJ) sú DRA001275 a DRA001277. Viac informácií nájdete v časti Doplnkové metódy. Ďalšie metódy nájdete v časti Doplňujúce informácie.

výsledok

Znížená funkcia Tet2 významne zvyšuje počet buniek podobných Tfh v slezine

Analyzovali sme homozygotné Tet2 (ďalej len Tet2 gt / gt ) myši nesúce vektor génového pasca v druhom intróne Tet2 (doplnkový obrázok Sla). 31 Reprodukovali sme rôzne nálezy opísané v predchádzajúcich dokumentoch s použitím rovnakých myší, ako napríklad 80% zníženie hladín mRNA Tet2 a 50% zníženie hladín hmC v bunkách negatívnych na líniu fetálnej pečene (FL) (doplnkové obrázky S1b a c), a zosilnené repopulačná aktivita v FL LSK bunkách iba po sekundárnej transplantácii (doplnkové obrázky S2a a b). Narodilo sa 29 30 myší Tet2 gt / gt a rástli takmer normálne s frekvenciou polovice očakávaného Mendelovského pomeru ( Tet2 gt / gt : Tet2 + / gt : Tet2 + / + = 32: 124: 70). V období medzi 40 a 40 myšami Tet2 gt / gt neboli heterozygotné myši ( Tet2 + / gt ) a Tet2 + / + žiadne významné rozdiely vo vzhľade, počte kompletných krvných buniek a pomeroch granulocytov, T buniek a B buniek v periférnej krvi. a 60 týždňov veku (doplnkové obrázky S3a a b).

Pri hodnotení vo veku 40 až 60 týždňov boli hmotnosti sleziny myší Tet2 gt / gt významne vyššie ako hmotnosti myší Tet2 + / gt a Tet2 + / + (179, 8 ± 72, 3 mg, 97, 0 ± 10, 6 mg a 108, 5 ± 26, 1 mg, (Obrázok 1a). Jedna z 10 myší Tet2 gt / gt sa vyvinula s výraznou splenomegáliou (> 300 mg). Farbenie hematoxylínom-eozínom (HE) ukázalo zachované folikulárne štruktúry, ktoré mali u niektorých myší Tet2 gt / gt zväčšené zárodočné centrá (obrázok 1b).

Image

Vyrastanie buniek podobných Tfh v slezinách 40 až 60 týždňov starých myší Tet2 gt / gt . a ) Hmotnosti sleziny myší Tet2 + / + ( n = 10), Tet2 + / gt ( n = 3) a Tet2 gt / gt ( n = 10) (priemer ± sd). * P < 0, 05, ** P < 0, 01. b ) hematoxylíno-eozínové farbenie rezov slezinou. Reprezentatívne čísla boli uvedené. Čierne stĺpce označujú 500 μm. ( c ) Analýza splenocytov na bunkovom povrchu u myší Tet2 + / + ( n = 10), Tet2 + / gt ( n = 3) a Tet2 gt / gt ( n = 10) (priemer ± sd). * P < 0, 05. ( d ) Absolútny počet splenocytov v každej frakcii ( Tet2 + / + n = 6, Tet2 + / gt n = 3, Tet2 gt / gt n = 6) (priemer ± sd). * P < 0, 05, ** P < 0, 01. ( e ) Reprezentatívne čísla frakcií CD4 + CD44 + PD1 + a CD4 + PD1 + Cxcr5 + v slezine 40 - až 60-týždňových Tet2 + / + , Tet2 + / gt a Tet2 gt / gt myší. ( f ) Pomery frakcií CD4 + CD44 + PD1 + a CD4 + PD1 + Cxcr5 + v slezine Tet2 + / + ( n = 9), Tet2 + / gt ( n = 3) a Tet2 gt / gt ( n = 9) myši (priemer ± sd). ** P < 0, 01. g ) Absolútny počet bunkových frakcií CD4 + CD44 + PD1 + a CD4 + PD1 + Cxcr5 + v slezine Tet2 + / + ( n = 6), Tet2 + / gt ( n = 3) a Tet2 gt / gt ( n = 6) myši (priemer ± sd). * P < 0, 05, ** P < 0, 01. ( h ) Imunofluorescenčné farbenie sleziny vo veku 40 až 60 týždňov v Tet2 + / + , Tet2 + / gt a Tet2 gt / gt . CD4 (zelená), PD1 (červená) a Cxcr5 (fialová) boli zafarbené kontrastným farbením DAPI. Biele stĺpce označili 20 um.

Obrázok v plnej veľkosti

Ďalej sme použili prietokovú cytometriu na analýzu fenotypov splenocytov a nepozorovali sme žiadne rozdiely v pomeroch CD4 + T buniek a B220 + B lymfocytov medzi myšami Tet2 gt / gt , Tet2 + / gt a Tet2 + / + , hoci podiel CD3 + T buniek bola mierne, ale významne znížená u myší Tet2 gt / gt v porovnaní s myšami Tet2 + / + . Populácia Gr1 + Mac1 + granulocytov bola mierne, ale významne zvýšená u myší Tet2 gt / gt v porovnaní s populáciou myší Tet2 + / gt a Tet2 + / + (obrázok 1c). Absolútny počet buniek sa zvýšil vo všetkých frakciách myší Tet2 gt / gt v porovnaní s frakciami myší Tet2 + / gt a Tet2 + / + (obrázok 1d). Ďalej sme pozorovali významné zvýšenie pomeru frakcií CD4 + CD44 + PD1 + u myší Tet2 gt / gt v porovnaní s pomermi myší Tet2 + / gt a Tet2 + / + (obrázky la a f). Pomer frakcie CD4 + PD1 + Cxcr5 + bol významne vyšší u myší Tet2 gt / gt ako u myší Tet2 + / + (obrázok 1f). Absolútny počet frakcií CD4 + CD44 + PD1 + a CD4 + PD1 + Cxcr5 + sa významne zvýšil u Tet2 gt / gt v porovnaní s počtom u myší Tet2 + / gt a Tet2 + / + (obrázok 1g). PD1 je ko-stimulačná molekula exprimovaná na Tfh bunkách, ktoré sú v skutočnosti označené spoločnou expresiou CD4, PD1 a Cxcr5 u myší. 33 Podobným spôsobom ako vyššie uvedená analýza, imunofluorescenčné farbenie tkanív sleziny tiež naznačovalo zvýšenie buniek Tfh podobných u myší Tet2 gt / gt (obrázok 1h). Celkovo naše výsledky naznačujú, že znížená funkcia Tet2 spôsobuje vyrastanie buniek podobných Tfh v slezine vo veku 40 - 60 týždňov. Extramedulárna hematopoéza u Tet2- knockout / down myší, ako je to opísané v iných, 14, 26, 27, 30, nebola v našej analýze zrejmá, hoci tu bola tendencia k zvýšeniu erytroidných prekurzorových buniek a k štatisticky významnému zvýšeniu LSK buniek v sleziny myší Tet2 gt / gt v porovnaní s myšami iných genotypov (doplnkový obrázok S4a).

U myší Tet2 gt / gt sa vyvíja lymfóm T-buniek so znakmi podobnými Tfh

Ďalej sme analyzovali Tet2 gt / gt myši staršie ako 60 týždňov a zistili sme, že u piatich zo siedmich myší sa vyvinula výrazná splenomegália, mnohopočetné opuchnuté lymfatické uzliny a viac uzlov v pečeni a pľúcach (stredný vek, 67 týždňov) (obrázky 2a - c). Zafarbenie HE ukázalo, že folikulárne štruktúry v slezinách myší Tet2 gt / gt vyvíjajúcich nádor boli úplne zničené v dôsledku invázie veľkých pleomorfných buniek vykazujúcich nepravidelne tvarované jadrá (obrázok 2c). Tieto nálezy naznačujú, že u myší Tet2 gt / gt sa vyvinul lymfóm. Vykonali sme imunofluorescenčné farbenie, aby sme preskúmali fenotyp infiltrujúcich buniek, čo demonštruje, že väčšina buniek exprimovala CD4 +, PD1 + a Cxcr5 + (obrázok 2d). Aby sme potvrdili, či sú nádormi lymfóm T-buniek, skúmali sme preusporiadanie receptorov T-buniek (TCR) pomocou DNA z CD4 + T buniek v slezinách a lymfatických uzlinách vyvíjajúcich nádory a zistili sme, že nádorové CD4 + T bunky demonštrovali odlišné vzory preskupenia v TCR Vp / Jp2. Ďalej, nádorové bunky CD4 + T pochádzajúce zo slezinných a opuchnutých lymfatických uzlín myši vykazovali identické vzorce preskupenia TCR (obrázok 2e, vzťahujúce sa na tabuľku 1). Dospeli sme teda k záveru, že u myší Tet2 gt / gt sa vyvinul lymfóm T-buniek.

Image

Vo veku myší Tet2 gt / gt sa vyvinul lymfóm T-buniek so znakmi podobnými Tfh. ( a ) Myšia Tet2 gt / gt vyvíjajúca nádor vykazuje značnú splenomegáliu (vľavo). Izolovaná slezina (horná pravá) a abdominálne lymfatické uzliny (pravá dolná) od myši Tet2 + / + a nádoru Tet2 gt / gt, ktorá sa vyvinula z nádoru. ( b ) Kumulatívne krivky incidencie vývoja nádoru u myší Tet2 + / + ( n = 5) a Tet2 gt / gt ( n = 7) (starších ako 60 týždňov). Stredný vek pri nástupe bol 67 týždňov. c ) HE farbenie rezov zo sleziny, pečene a pľúc u myší Tet2 + / + (horná) a nádorov Tet2 gt / gt (stredná a dolná). Bodová čiara označuje léziu nádorov. Čierne stĺpce v hornom a strednom paneli označujú 200 μm, v dolných paneloch 10 μm. ( d ) Imunofluorescenčné farbenie sleziny vo veku (> 60 týždňov) Tet2 + / + , vo veku Tet2 + / gt a nádor vyvíjajúcich sa Tet2 gt / gt myší. CD4 (zelená), PD1 (červená) a Cxcr5 (fialová) boli zafarbené kontrastným farbením DAPI. Biele stĺpce označujú 20 μm. ( e ) Analýza preskupenia TCRp. Sú znázornené preskupenia TCR Vp / Jp2. M, marker; C, kontrola; SP, sleziny nesúce nádor; LN, opuchnutá lymfatická uzlina od myší Tet2 gt / gt, ktoré sa vyvíjajú nádorom . Čísla označujú jednotlivé myši Tet2 gt / gt (vzťahujúce sa na tabuľku 1). Pravý panel vykazoval vzory preskupenia TCR v slezine a opuchnutej lymfatickej uzline myši No.3 Tet2 gt / gt .

Obrázok v plnej veľkosti

Tabuľka v plnej veľkosti

Ďalej sme charakterizovali Tet2 gt / gt myši vyvíjajúce lymfóm. Nezistili sa žiadne významné rozdiely v počte bielych krviniek a koncentrácii hemoglobínu v periférnej krvi myší Tet2 gt / gt , Tet2 + / gt a Tet2 + / + , zatiaľ čo počet trombocytov u myší Tet2 gt / gt vyvíjajúcich sa v lymfóme bol významne nižší ako ako u myší Tet2 + / + (obrázok 3a). Hmotnosť sleziny myší Tet2 gt / gt vyvíjajúcich lymfóm bola významne vyššia ako hmotnosť myší Tet2 + / gt a Tet2 + / + (1466 ± 1086 mg, 139, 3 ± 45, 0 mg, respektíve 165 ± 83 mg) (obrázok 3b) ). V slezinách boli CD4 + pomocné T-bunkové frakcie významne zvýšené u Tet2 gt / gt myší v porovnaní s frakciami Tet2 + / gt a Tet2 + / + myší (obrázok 3c). Frakcia B-buniek B220 + bola významne znížená u myší Tet2 gt / gt v porovnaní s frakciou myší Tet2 + / + . Vo frakcii myeloidných buniek Gr1 + / Mac1 + nebol významný rozdiel. CD4 + T bunky boli väčšinou pozitívne na CD44 a PD1 av menšej miere na Cxcr5 (obrázok 3d). Percento CD4 + PD1 + Cxcr5 + Tfh-podobných bunkových frakcií bolo významne vyššie ako percento myší s ostatnými genotypmi. Medzi starými myšami Tet2 + / + a Tet2 + / gt (doplnkový obrázok S4b) neboli žiadne rozdiely v prekurzore erytroidu a frakcii LSK v slezinách.

Image

Charakteristika myší Tet2 gt / gt, ktoré sa vyvíjajú lymfómom . a ) Počty bielych krviniek (WBC), koncentrácie hemoglobínu (Hb) a počet krvných doštičiek (Plt) vo veku Tet2 + / + ( n = 5), vo veku Tet2 + / gt ( n = 3) a v lymfóme vyvíjajúcom sa Tet2 gt / gt ( n = 4) myši staršie ako 60 týždňov. Čierne stĺpce označujú stredné hodnoty. * P < 0, 05. b ) Hmotnosti sleziny myší Tet2 + / + ( n = 5), Tet2 + / gt ( n = 3) a Tet2 gt / gt ( n = 5) vyvíjajúcich sa v lymfóme a Tet2 gt / gt nevyvíjajúcich sa lymfómov ( n = 2). Čierne stĺpce označujú stredné hodnoty. * P < 0, 05, ** P < 0, 01. ( c ) Analýza splenocytov na bunkovom povrchu u Tet2 + / + ( n = 5), Tet2 + / gt ( n = 3) a lymfocytov vyvíjajúcich Tet2 gt / gt ( n = 4) myší (priemer ± sd). * P < 0, 05. ( d ) Reprezentatívne čísla analýz bunkového povrchu sleziny od myší Tet2 + / + (horná) a sleziny a lymfatických uzlín (LN) od lymfocytov vyvíjajúcich sa Tet2 gt / gt (stredná a dolná) starších ako 60 týždňov. Graf ukazuje percentá frakcií podobných Tfh ( Tet2 + / + n = 5, Tet2 + / gt n = 3 a Tet2 gt / gt n = 4; stredná hodnota ± sd). * P < 0, 05, ** P < 0, 01.

Obrázok v plnej veľkosti

V klinickom prostredí pacienti s AITL často vykazujú polyklonálnu hypergamaglobulinémiu. Hladiny imunoglobulínu v sére u myší Tet2 + / + a Tet2 gt / gt však nepreukázali významný rozdiel (doplnkový obrázok S5).

Celkovo tieto výsledky ukazujú, že u myší Tet2 gt / gt sa vyvíjajú lymfómy T-buniek, ktoré vykazujú znaky charakteristické pre bunky podobné Tfh, ale tieto lymfómy T-buniek nevykazujú patologické alebo klinické nálezy relevantné pre ľudský AITL. PTCL-NOS s funkciami podobnými Tfh 13 môže byť najbližším náprotivkom.

Lymfómové bunky vykazujú profily génovej expresie podobné profilom Tfh buniek

Profily génovej expresie CD4 + buniek pochádzajúcich zo slezinových nádorov myší Tet2 gt / gt verzus CD4 + buniek z normálnej sleziny WT (ďalej označované ako lymfómové bunky verzus kontrolné CD4 + bunky) boli hodnotené pomocou kyotojskej encyklopédie génov a genómov ( KEGG), zdroj 34 a analýza obohatenia génov (GSEA). 35 Keď sa prehľadalo 903 upregulovaných génov (> 2-násobne) a 896 downregulovaných génov (<0, 5-násobne), KEGG vyniesla obohatené pojmy, ako napríklad „interakcia cytokín-cytokín“ a „línia hematopietických buniek a imunitná odpoveď“ (doplnkové tabuľky S1 a S2).

Pre GSEA nebola génová sada regulovaná Tfh nedostupná v BIOCARTA, a preto sa musela novo pripraviť výberom 21 génov na základe predchádzajúcich mikročipových analýz. 36, 37 Génové sady Th1 / Th2 dráhy boli prevzaté z BIOCARTA na analýzu GSEA. Tfh-regulované gény boli významne obohatené v lymfómových bunkách v porovnaní s kontrolnými CD4 + bunkami ( P- hodnota 0, 0020, FDR Q- hodnota 0, 0027, NES 1, 869) (obrázok 4a). Oproti tomu gény spojené s diferenciáciou Thl / 2 boli obohatené v kontrolných CD4 + bunkách ( P- hodnota = 0, 0169, FDR Q- hodnota = 0, 0169, NES-1, 702) (Obrázok 4b). Na overenie podpisu podobného Tfh v lymfómových bunkách sme vykonali PCR v reálnom čase pre reprezentatívne mfy spojené s Tfh, ako sú Bcl6 , cMaf , PD1 , Icos a Cxcr5 . Hladiny transkriptov všetkých týchto molekúl boli v lymfóme významne vyššie ako v kontrolných bunkách CD4 + (obrázok 4c). Naopak, transkripčné hladiny Tbx21 a Gata3 , ktoré kódujú hlavné transkripčné faktory regulujúce diferenciáciu Th1 a Th2, boli porovnateľné alebo mierne nižšie v lymfóme (obrázok 4d). Okrem toho imunofluorescenčné farbenie odhalilo, že mnoho buniek bolo spolu farbených na CD4 a Bcl6 alebo cMaf v tkanive sleziny vyvíjajúcej sa v lymfóme (obrázok 4e).

Image

Tfh podobné génové expresné vzorce v lymfómových bunkách. ( a ) GSEA analýza CD4 + buniek zo slezín Tet2 + / + ( n = 2) v porovnaní s lymfocytmi vyvíjajúcimi Tet2 gt / gt ( n = 2) myšami, ukazujúca súbor génov spojený s 21 Tfh-regulovanými génmi. NES znamená normalizované skóre obohatenia. ( b ) analýza GSEA porovnávajúca bunky CD4 + z myší Tet2 + / + ( n = 2) a Tet2 gt / gt ( n = 2) vyvíjajúcich sa v lymfóme použitím génovej sady z dráh Th1 a Th2. ( c ) expresia mRNA stanovená analýzou CD4 + buniek v reálnom čase z buniek Tet2 + / + ( n = 6) a buniek z myší Tet2 gt / gt ( n = 5) vyvíjajúcich sa v lymfóme (priemer ± sd). * P < 0, 05, ** P < 0, 01. ( d ) PCR analýza Tbx21 a Gata3 transkriptov v reálnom čase v CD4 + bunkách z Tet2 + / + ( n = 6) a lymfom vyvíjajúcich Tet2 gt / gt ( n = 5) myší (priemer ± sd). * P < 0, 05. e ) Imunofluorescenčné farbenie Bcl6 (horná) a cMaf (dolná) u lymfocytov vyvíjajúcich sa vo veku a vo veku WT slezín. V horných paneloch CD4 (červená) a Bcl6 (zelená) s protifarbením DAPI. V dolných paneloch CD4 (zelená) a cMaf (fialová) s kontrastným farbením DAPI. Biele stĺpce ukazujú 30 μm.

Obrázok v plnej veľkosti

Lymfómové bunky vykazujú aberantné metylačné a hydroxymetylačné vzorce v celom genóme

Aby sme preverili potenciálne epigenetické zmeny v lymfómových bunkách, vykonali sme metylovanú imunoprecipitáciu DNA (MeDIP) a hydroxymetylovanú imunoprecipitáciu DNA (hMeDIP) kombinovanú s vysoko výkonným sekvencovaním, pričom sme použili tri nezávislé vzorky pre lymfóm a kontrolné bunky CD4 + . V génovo orientovanej analýze priemerná hladina mC vykazovala podobný obrazec v lymfómových bunkách a kontrolných bunkách CD4 +, zatiaľ čo hladina hmC bola v lymfómových bunkách mierne znížená. Priemerná hladina mC, zameraná okolo TSS, vykázala mierny pokles hneď za TSS, ale nárast smerom k oblasti génového tela v lymfómových bunkách. Na porovnanie, pokles priemernej hladiny hmC bol pozoruhodný medzi TSS a 5 k bp za TSS v lymfómových bunkách (obrázok 5a). Potom sme skúmali distribúciu vysoko obohatených oblastí mC a hmC. Regióny, v ktorých bola analýza založená na modeli pre skóre ChIP-Seq (MACS)> 5, sa považovali za vysoko obohatené regióny. 38 V týchto oblastiach bola v lymfómových bunkách v porovnaní s kontrolnými CD4 + bunkami zvýšená metylácia v TSS oblastiach (TSS ± ​​1 k bp, TSS ± ​​5 k bp), ostrovčekoch a ostrovoch CpG ( P = 0, 013, 0, 006, 0, 006). a 0, 022). Hydroxymetylácia bola znížená v TSS oblastiach v lymfómových bunkách v porovnaní s kontrolnými CD4 + bunkami ( P = 0, 018, respektíve 0, 006) (obrázok 5b).

Image

Genómová mC a hmC analýza CD4 + buniek sleziny z Tet2 + / + a lymfocytov vyvíjajúcich Tet2 gt / gt . ( a ) Priemerné hladiny mC (horné) a hmC (nižšie) v CD4 + splenocytoch od myší Tet2 + / + ( n = 3) a lymfocytov vyvíjajúcich Tet2 gt / gt ( n = 3). Ľavé grafy označujú génovo orientovanú distribúciu mC a hmC; pravé grafy ukazujú distribúciu mC a hmC okolo miesta začiatku transkripcie (TSS). TTS, miesto ukončenia transkripcie. Čierna umožňuje označiť oblasti v rozdieloch medzi lymfómovými bunkami a kontrolnými bunkami. b ) Distribúcia oblastí obohatených o mC a hmC (skóre MACS> 5) v TSS ± ​​1 k bp, TSS ± ​​5 k bp, v oblastiach génového tela a ostrovoch CpG v CD4 + splenocytoch z Tet2 + / + ( n = 3) a lymfóm vyvíjajúce Tet2 gt / gt ( n = 3) myši. ( c ) Boli vybrané top 2555 gény vykazujúce zvýšenú metyláciu v génovom tele v lymfómových bunkách v porovnaní s kontrolnými CD4 + bunkami, ako aj top gény 2500 a 903 vykazujúce vyššiu expresiu v lymfóme v porovnaní s kontrolnými CD4 + bunkami; 448 a 118 génov boli spoločné pre obe skupiny. Génová ontologická analýza (GO) sa uskutočňovala s použitím týchto génov. Každý termín bol zobrazený. ( d ) Boli vybrané top 2639 gény vykazujúce zníženú hydroxymetyláciu v génovom tele v lymfómových bunkách v porovnaní s kontrolnými CD4 + bunkami, ako aj top 2500 a 903 gény vykazujúce vyššiu expresiu v lymfóme v porovnaní s kontrolnými CD4 + bunkami. 248 a 57 génov boli spoločné pre obe skupiny. GO analýza sa uskutočňovala s použitím týchto génov.

Obrázok v plnej veľkosti

Ďalej sme zlúčili dva zoznamy génov, prvý pre upregulovanú génovú expresiu a druhý pre aberantnú depozíciu metylácie alebo hydroxymetylácie. Všeobecne je metylácia DNA v promótorovej oblasti úzko spojená s inaktiváciou génovej expresie. Na rozdiel od toho je známe, že aberantná akumulácia metylácie v génovom tele je spojená s upregulovanou transkripciou. 39 Nádorové bunky v našom myšacom modeli lymfocytov T-buniek vykazovali vyrastanie buniek podobných Tfh a lymfómové bunky vykazovali zvýšenú reguláciu v génoch príbuzných Tfh. Vybrali sme teda 2555 génov (horných 10% z celkových génov), ktoré vykazovali vyššiu hustotu mC v oblastiach génového tela v lymfómových bunkách v porovnaní s kontrolnými CD4 + bunkami (priemerný rozdiel v počte značiek podľa MACS> 7). Nezávisle sme vybrali 2 500 vysoko exprimovaných génov (horných 10% z celkových génov) a prvých 903 génov s násobkom expresie> 2 v lymfómových bunkách v porovnaní s kontrolnými CD4 + bunkami. V týchto dvoch skupinách, 448 a 118 génov, v uvedenom poradí, splnili obe kritériá zvýšenia mC v tele génu a násobnej zmeny v génovej expresii. Analýza génovej ontológie (GO) vyzdvihla niekoľko obohatených pojmov spojených s onkogenézou, ako je regulácia bunkovej smrti a anti-apoptózy pre 448 génov (doplnková tabuľka S3) a delenie buniek, bunkový cyklus a proces bunkového cyklu (doplnková tabuľka S4). pre 118 génov (obrázok 5c).

Podobne sme vybrali 2639 génov (horných 10% z celkových génov) (priemerný rozdiel v počte značiek podľa MACS <- 3), ktoré vykazovali nižšiu hustotu hmC v oblastiach TSS ± ​​1 k bp v lymfómových bunkách v porovnaní s kontrolnými CD4 + bunkami, vo svetle najnovšej správy preukazujúcej, že hmC v promótorovej oblasti negatívne reguluje génovú expresiu. 40 Keď boli analyzované rovnaké 2500 a 903 vysoko exprimované gény, 248 respektíve 57 génov splnilo obidve kritériá zvýšenia hmC pri TSS-1 k bp a násobnú zmenu v génovej expresii (obrázok 5d). GO analýza získala obohatené termíny, ako je imunitná reakcia a regulácia aktivácie lymfocytov (doplnková tabuľka S5) a bunková smrť a smrť (doplnková tabuľka S6) pre gény 248 a 57, v danom poradí.

Tieto analýzy naznačujú, že zoznam génov prekrývajúci sa vysoko metylované gény v génovom tele a zvyšujúce sa gény v lymfómových bunkách je spojený s onkogenézou a že zoznam génov prekrývajúci sa menej hydroxymetylované gény v TSS a zvyšujúce sa gény v lymfómových bunkách sú spojené s imunitným systémom.

Bcl6 bol jedným zo 448 génov spojených so zmenou mC, ktorá vznikla pri našich analýzach génov súvisiacich s Tfh obohatených o lymfómové bunky. Sekvenovanie MeDIP lokusu Bcl6 odhalilo výrazne zvýšenú hustotu mC v prvom intróne v lymfóme v porovnaní s kontrolnými CD4 + bunkami (obrázok 6a). Zmena hustoty mC v prvom intróne bola potvrdená kvantitatívnym MeDIP (qMeDIP) (obrázok 6b). Analýza hmC opísaná vyššie odhalila, že PD1 a Cxcr5 patria medzi gény súvisiace s Tfh. Vrcholy hmC boli znížené v TSS ± ​​1 k bp génov PD1 a Cxcr5 (doplnkové obrázky S6a a S6c). Kvantitatívne hMeDIP tiež vykazoval tendencie poklesu hmC v TSS ± ​​1 k bp obidvoch génov, ale neexistoval štatistický význam (doplnkový obrázok S6b a S6d).

Image

Stav metylácie v Bcl6 u myší Tet2 + / + a lymfocytov vyvíjajúcich Tet2 gt / gt a myší v bunkách EL4 s liečbou decitabínom. ( a ) Výsledky MeDIP sekvenovania lokusu Bcl6 v CD4 + bunkách od myší Tet2 + / + ( n = 3) a lymfocytov vyvíjajúcich Tet2 gt / gt ( n = 3). Prvý intrón Bcl6 bol hypermetylovaný v lymfómových bunkách (plocha medzi červenými čiarkovanými čiarami s čiernou umožňuje). ( b ) Kvantitatívna analýza MeDIP v prvom intróne Bcl6 v CD4 + bunkách z Tet2 + / + ( n = 4) a lymfóm vyvíjajúcich Tet2 gt / gt ( n = 3) myší (priemer ± sd). Hladina mC u myší Tet2 gt / gt bola v tejto oblasti významne zvýšená v porovnaní s hladinami u myší Tet2 + / + . * P < 0, 05. ( c ) Bisulfitové sekvenovanie v prvom intróne Bcl6 lokusu v CD4 + bunkách z Tet2 + / + a lymfocytov vyvíjajúcich Tet2 gt / gt myší. Sú uvedené reprezentatívne údaje z dvoch nezávislých experimentov. ( d ) Bisulfitové sekvenovanie Bcl6 int1-S v EL4 myších lymfómových bunkách EL4 ošetrených decitabínom alebo bez neho ( n = 3). Sú uvedené reprezentatívne údaje z dvoch nezávislých experimentov. e ) Hladiny Bcl6 mRNA v bunkách EL4 ošetrených decitabínom alebo bez neho na základe analýzy PCR v reálnom čase ( n = 3) (priemer ± sd). Sú uvedené reprezentatívne údaje z troch nezávislých experimentov. ** P < 0, 01.

Obrázok v plnej veľkosti

Tieto výsledky nás viedli k ďalšej analýze prvého intrónu génu Bcl6 , ktorý bol hlásený ako oblasť intronového tlmiča ( Bcl6 int1-S), ktorej tlmiaca aktivita závisí od jeho stavu metylácie v bunkovej línii ľudských B-bunkových lymfómov., 41 BCL6 má rozhodujúcu úlohu pri vývoji Tfh buniek. 20 Bisulfitové sekvenovanie odhalilo zvýšenie hustoty modifikovaného cytozínu na prvom intróne v lymfóme v porovnaní s kontrolnými bunkami (obrázok 6c), čo zodpovedá sekvencii MeDIP (obrázok 6a).

Demetylácia prvého intrónu Bcl6 vyvolaná decitabínom znižuje expresiu mRNA v bunkách EL4

Aby sme určili, či sa v bunkách lymfómu T-línie vyskytuje metylačná regulácia expresie Bcl6 , skúmali sme expresiu a stav metylácie Bcl6 mRNA v bunkách EL4, bunkovej línii lymfómu myších T-buniek. Bisulfitové sekvenovanie odhalilo, že takmer všetky cytozíny nachádzajúce sa v CpG sekvenciách boli metylované na Bcl6 int1-S v EL4 bunkách. Po ošetrení buniek EL4 demetylačným činidlom decitabínom sa hladiny metylovaných cytozínov znížili (obrázok 6d). V súlade s tým sa hladiny transkriptu Bcl6 znižovali spôsobom závislým od dávky decitabínu (obrázok 6e). Tento výsledok podporuje názor, že hustota metylovaného cytozínu na Bcl6 int1-S pozitívne reguluje transkripciu Bcl6 v T bunkách.

Často sa vyskytujúce mutácie s mutáciou TET2 pri hematologických malignitách sa nedetegujú exómovým a cieleným sekvencovaním

Aby sme preskúmali ďalšie mutácie v lymfómových bunkách, uskutočnili sme exómové sekvenovanie v lymfómových bunkách vyvinutých u myší Tet2 gt / gt (vzorka č. 5 v tabuľke 1). Päť génových mutácií bolo identifikovaných a validovaných Sangerovým sekvencovaním, ale žiadna z týchto mutácií nebola hlásená v súvislosti s ľudským periférnym lymfómom T-buniek (tabuľka 2). Naproti tomu mutácie Flt3 , Npm1 , Dnmt3a , Idh2 a Rhoa , o ktorých je známe, že koexistujú s mutáciami TET2 v rôznych ľudských hematologických malignitách, neboli identifikované cieleným sekvencovaním v počte vzoriek nádorov 1 až 5 (doplnkový obrázok S7). ).

Tabuľka v plnej veľkosti

diskusia

Tu uvádzame nový myšací model lymfómu T-buniek s Tfh-podobnými vlastnosťami a dlhou latenciou po proliferácii ne-neoplastických Tfh-podobných CD4 + T-buniek. Znížená funkcia Tet2 pravdepodobne prispieva k narušenej premene mC na hmC, čo je nevyhnutný sprostredkovateľ v demetylačnom procese. Genómová metylačná analýza lymfómových buniek odhalila abnormálnu akumuláciu mC. Ďalšia analýza naznačovala, že jedným z dôležitých cieľov pre rast buniek typu Tfh by mohlo byť zvýšenie hladiny metylácie na Bcl6 int1-S.

Heterozygotné mutácie v Roquinovom géne, ktorý kóduje proteín, ktorý sa viaže a znižuje stabilitu Icos mRNA, tiež podporujú T-bunkový lymfóm sprevádzaný Tfh vlastnosťami u myší. Vo vzorkách humánnych AITL však neboli identifikované roquinové mutácie. 12, 44, 45, 46 Vzhľadom na to náš model myši rekapituluje ľudskú T- lymfomagenézu bližšie ako Roquinov model. Napriek tomu sa nepozorovali iné charakteristiky ľudskej AITL, ako je polyklonálna hypergamaglobulinémia, proliferácia vysokých endotelových venúl a infiltrácia eozinofilov a B buniek. Náš model napodobňuje PTCL-NOS s funkciami podobnými Tfh u ľudí.

Bolo hlásené, že Bcl6 riadi diferenciáciu Tfh-buniek. 20 Bcl6- deficientných T buniek sa nedokáže vyvinúť na Tfh bunky a nemôže udržať odozvy zárodočných centier, zatiaľ čo nútená expresia Bcl6 v CD4 + T bunkách podporuje expresiu Cxcr5 a PD1 , ktoré kódujú markery Tfh buniek. Ďalej sa u transgénnych myší konštitutívne exprimujúcich proteín Bcl6 v lymfocytoch vyvíjajú lymfómy B a T-buniek. V tomto modeli si vývoj lymfómu vyžadoval dlhé obdobie latencie a incidencia sa výrazne zvýšila podávaním N -etyl- N -nitrozomočoviny (ENU), o ktorej je známe, že indukuje mutácie DNA. 47 V tomto článku sme ukázali, že u myší Tet2 gt / gt sa vyvinul lymfóm s dlhou latenciou, podobne ako u transgénnych myší Bcl6 . Zhoršená izolácia Tet2 alebo zosilnený Bcl6 teda môže vyvolať premalígny stav, ale nemusí byť dostatočný na vyvolanie rozvoja lymfómu u myší. Vzhľadom na to, že somatické mutácie TET2 sa vyskytujú u 5, 6% starších žien so skosenou X-inaktiváciou bez hematologických malignít, môže sa na rozvoj lymfómu vyžadovať 48 ďalších mutácií. Nedávno sme uviedli, že 38 zo 46 (82, 6%) klinických AITL vzoriek malo mutácie v TET2 v celej kódujúcej oblasti a že 32 zo 46 (69, 5%) vzoriek malo mutácie v TET2 aj v rodine A homológov ras ( RHOA ). Mutácie RHOA sa akumulovali v aminokyselinovej polohe 17. Iné skupiny tiež hlásili vysokú frekvenciu mutácií RHOA u pacientov s AITL. 42, 43 V našich vzorkách myších lymfómov sa však nezistila mutácia G17 RHOA , ani žiadne ďalšie často sa vyskytujúce mutácie s mutáciami TET2 v ľudských hematologických malignitách. Genomická evolúcia lymfómu T-buniek v našom myšom modeli bola iná ako u ľudí.

DNA získaná zo vzoriek AML nesúcich mutácie v IDH1 / 2 , ktorá reguluje funkciu TET2, je hypermetylovaná. 10 DNA z difúznych vzoriek veľkých lymfocytov B-buniek nesúcich mutácie TET2 tiež vykazuje hypermetyláciu. Na rozdiel od toho, stav hydroxymetylácie sa u žiadnych hematologických malignít neposudzoval vo veľkom rozsahu. Je známe, že hmC je zvlášť obohatený v TSS oblastiach génov v ES bunkách, čo naznačuje, že hmC funguje v transkripčnej regulácii. Výrazná redukcia hmC v TSS oblastiach lymfómových buniek, ktorá je tu uvedená, naznačuje, že zhoršená funkcia TET2 by mohla okrem zníženej demetylácie zmeniť transkripciu prostredníctvom zníženia epigenetickej značky hmC.

V súhrne sme dospeli k záveru, že u myší Tet2 gt / gt sa vyvíja lymfóm T-buniek so znakmi podobnými Tfh s epigenetickými zmenami. Hypermetylácia Bcl6 int1-S pravdepodobne prispieva k zvýšeniu regulácie Bcl6 a rastu buniek podobných Tfh. Demetylačné činidlá, ako je azacitidín a decitabín, sú údajne účinné pri liečbe MDS. 51, 52 Tieto látky sa môžu tiež zamerať na T-bunkové lymfómy, najmä na tie, ktoré majú mutácie v epigenetických regulátoroch.

prírastky

DDBJ / GenBank / EMBL

  • DRA001277

Génový expresný Omnibus

  • GSE52430

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplnková informácia

    Doplňujúce informácie sú priložené k tomuto dokumentu na webovej stránke časopisu Blood Cancer Journal (//www.nature.com/bcj).