Nábor adenomatóznej polypózy coli a β-katenínu do axín-puncty | onkogén

Nábor adenomatóznej polypózy coli a β-katenínu do axín-puncty | onkogén

Anonim

abstraktné

Supresor tumoru adenomatóznej polypózy coli (APC) je multifunkčný proteín, ktorý sa podieľa na regulácii Wnt signalizácie a cytoskeletálnej dynamiky. O tom, ako APC riadi tieto rozdielne funkcie, je málo známe. V tejto štúdii sme použili APC- a axín-fluorescenčné fúzne proteíny na skúmanie interakcií medzi týmito proteínmi a ukázali, že funkčne odlišné populácie APC sú tiež priestorovo oddelené. Axin-RFP tvorí cytoplazmatické punkčné štruktúry podobné endogénnym axinovým punktom. Axin-RFP prijíma komplexné proteíny deštrukcie p-katenínu, vrátane APC, p-katenínu, glykogénsyntázy kinázy-3-ß (GSK3-ß) a kazeínkinázy-1-a (CK1-a). Nábor do sekvenátorov APC z axínu-RFP puncta zo zhlukov pri bunkových rozšíreniach a to bráni jeho funkciám spojeným s mikrotubulami. Interakcia medzi APC-GFP a axín-RFP v cytoplazmatickej punkcii je priama a dramaticky mení dynamické vlastnosti APC-GFP. Nábor APC do axínovej puncty však nie je nevyhnutne potrebný na degradáciu p-katenínu. Namiesto toho je na degradáciu p-katenínu potrebná tvorba axínového puncta, sprostredkovaná doménou DIX. Mutant axinADIX netvoril puncta, ale stále sprostredkoval nábor deštrukčných komplexných proteínov a fosforyláciu p-katenínu. Dospeli sme k záveru, že existujú odlišné súbory APC a že tvorba axínu puncta, skôr ako komplexu axín / APC, je nevyhnutná na deštrukciu p-katenínu.

úvod

Signalizácia Wnt riadi rozhodujúce fázy pri rozhodovaní o bunkových osudoch, vývoji a udržiavaní tkanív a bola identifikovaná ako kľúčová signálna dráha pri rakovine (Logan a Nusse, 2004; Schneikert a Behrens, 2007). Keď je signalizácia Wnt potlačená, skeletový proteínový axín a tumor-supresorová adenomatózna polypóza coli (APC) tvoria komplex, ktorý podporuje fosforyláciu p-katenínu glykogénsyntázovou kinázou-3-p (GSK3-p), ktorá sa následne zameriava na p- katenínom na ubikvitináciu pomocou ßTrCP a deštrukciou proteazómom (Aberle a kol., 1997; Orford a kol., 1997; Kitagawa a kol., 1999). Stimulácia Wnt a mutácie APC narušujú komplex APC / axín a vedú k zvýšeným hladinám p-katenínu v jadre a cytoplazme (Munemitsu a kol., 1995). Je známe, že p-katenín interaguje s členmi rodiny transkripčných faktorov Tcf, aby aktivoval transkripciu génov zapojených do proliferácie a bunkovej transformácie (Korinek a kol., 1997).

Funkcia APC v regulácii Wnt / ß-katenínu bola podrobne skúmaná a aberantná aktivácia β-katenínu v dôsledku skrátených mutácií v APC sa považuje za ústrednú udalosť pri rakovine hrubého čreva (Polakis, 1997, 2000; Nathke, 2004). Priestorová a časová regulácia interakcií APC so signalizačnými zložkami Wnt a cytoskeletom je však menej dobre pochopená. APC je lokalizovaný na bazálnej plazmatickej membráne v spojení s mikrotubulami na periférne konce bunkových extenzií (Nathke a kol., 1996; Barth a kol., 2002). Toto rozdelenie APC poukazuje na hlavnú úlohu APC v cytoskeletálnych funkciách spojených s migráciou buniek. APC sa viaže na mikrotubuly (Munemitsu a kol., 1994; Su a kol., 1995) a reguluje ich rast a stabilitu (Kita a kol., 2006) a je spojený s aktínovým cytoskeletom prostredníctvom interakcií s efektorom Rac1 / Cdc42. proteín IQGAP1 (Watanabe a kol., 2004), Rac-špecifický výmenný faktor Asef (Kawasaki a kol., 2000) a Rho efektor mDia (Wen a kol., 2004). B-katenín sa nedávno podieľa na zhlukovaní APC na bunkových výčnelkoch (Sharma a kol., 2006). Nie je však jasné, či konce mikrotubulov naplnených APC sú miestami „deštrukčného“ komplexu axínu / P-katenínu / GSK3-ß / APC, alebo či táto funkcia prebieha kdekoľvek inde v bunke.

Subcelulárne umiestnenie axínu je menej dobre definované ako APC. V prípade Xenopus sa predpokladá, že fyziologická koncentrácia axínu je mimoriadne nízka (Lee et al., 2003), čo sťažuje detekciu na subcelulárnej úrovni. Endogénny axín bol detegovaný v malých, bodkovaných cytoplazmatických štruktúrach, ktoré sa po pôsobení LiCl (ktoré inhibuje GSK3-ß, napodobňujúcu Wnt aktiváciu) redistribuujú na veľké agregáty (Levina a kol., 2004; Wiechens a kol., 2004). ). Ektopicky exprimovaný rekombinantný axín je lokalizovaný v cytoplazmatických vezikulách alebo punktách (Fagotto a kol., 1999; Smalley a kol., 1999; Schwarz-Romond a kol., 2005). Je známe, že C-koncová DIX doména axínu sprostredkuje samo-asociáciu, ktorá sa považuje za dôležitú pre reguláciu p-katenínu (Hsu a kol., 1999; Kishida a kol., 1999; Sakanaka a Williams, 1999). a nedávno sa ukázalo, že sa spája s polymérmi, ktoré sú potrebné na tvorbu punkcie (Schwarz-Romond a kol., 2007a, 2007b). Tiež sa navrhuje, aby sa axín uvoľňoval z a do jadra (Wiechens a kol., 2004) a že sa spájal s mikrotubulami a reguloval ich stabilitu prostredníctvom rozpadnutých (Dvl) (Ciani a kol., 2004).

Aj keď sa ukázalo, že APC a axín interagujú pomocou imunoprecipitácie (Hart a kol., 1998), subcelulárne umiestnenie tejto interakcie nebolo dobre definované. Je možné, že iba malá časť APC sa asociuje s komplexom axínu. Posledné biochemické údaje poukazujú na existenciu diskrétnych populácií APC, kde komplex APC / axín / P-katenín je oddelený od interakcií APC s mikrotubulami (Penman et al., 2005). Tieto štúdie naznačujú, že priestorová regulácia APC aj axínu je dynamický proces, ale komplexná tvorba na subcelulárnej úrovni sa neskúmala. V tejto štúdii sme použili APC- a axín-fluorescenčné fúzne proteíny na štúdium axínovej regulácie subcelulárnej lokalizácie APC a na preskúmanie dynamických interakcií týchto proteínov v živých bunkách cicavcov. Preskúmali sme, či boli do axínovej puncty prijatí ďalšie proteíny komplexného deštrukcie, β-katenín, GSK3-β a kazeínkináza-1-α (CK1α) a či je na tvorbu komplexu potrebná tvorba axínového puncta, sprostredkovaná DIX doménou axínu. degradácia p-katenínu. Naše dáta ukazujú, že existujú odlišné subcelulárne súbory APC, ktoré axín redistribuuje APC z mikrotubulárnych bunkových rozšírení na cytoplazmatické axínové puncty, a že to bráni mikrotubulovým funkciám APC. Ukazujeme, že axín prijíma deštrukčné komplexné proteíny a že tvorba Axin puncta, skôr ako komplexu axín / APC, je kritická pre degradáciu p-katenínu.

výsledok

Na štúdium subcelulárnej lokalizácie a dynamických vlastností axínu sme hodnotili lokalizáciu endogénneho aj rekombinantného axínu fúzovaného s monomérnym červeným fluorescenčným proteínom (RFP) (obrázok 1a). Použitím komerčne dostupnej polyklonálnej protilátky proti axínu sme pozorovali endogénny axín v zreteľnom punkte v cytoplazme buniek psích obličiek Madin-Darby (MDCK) (obrázky 1b a c). Endogénny aj rekombinantný axín puncta boli rovnomerne distribuované v cytoplazme (obrázky 1b – e), čo je v súlade s predchádzajúcimi správami o endogénnom axíne v bunkách HEK293 (Levina a kol., 2004; Wiechens a kol., 2004) a rekombinantnom axíne (Fagotto a kol. a kol., 1999; Smalley a kol., 1999; Schwarz-Romond a kol., 2005, 2007b). Axin-RFP bol lokalizovaný do cytoplazmatického punktu, keď bol exprimovaný v MDCK (obrázok le) aj v HEK293 T bunkách (doplnkové obrázky S1, S2). Podobne epitopom značený axín-HA (obrázok 1d) vytvoril cytoplazmatický punkt, čo naznačuje, že monomérny RFP tag neovplyvnil jeho distribúciu.

Image

Lokalizácia axínu v cytoplazmatickej punkcii. a ) Schematické znázornenie doménových štruktúr fúznych proteínov axín, axín ARGS a axín APIX-RFP a APC-GFP. ( b, c ) Endogénny axín je lokalizovaný v cytoplazmatických punkciách v bunkách psích obličiek Madin – Darby (MDCK). Bunky boli fixované a imunofarbené na endogénny axín protilátkami proti axínu-1. c ) vysoké zväčšenie cytoplazmatického punktu endogénneho axínu. ( d ) MDCK bunky prechodne exprimujúce axín-HA boli fixované a imunofarbené anti-HA protilátkami. ( e ) MDCK bunky exprimujúce axín-RFP. Zobrazené sú jednotlivé konfokálne sekcie.

Obrázok v plnej veľkosti

Axin prijíma APC do cytoplazmatického punktu

Endogénny APC koncentrovaný v zhlukoch na koncoch mikrotubulov v subkonfluentných epitelových bunkách (Nathke a kol., 1996; Barth a kol., 2002; Obrázok 2a). Prechodne exprimovaný APC-GFP bol tiež koncentrovaný v rôznych zhlukoch na periférnych koncoch mikrotubulov v MDCK bunkách (obrázok 2b), napodobňujúc farbenie endogénneho APC v týchto bunkách (obrázok 2a). V niektorých bunkách APC-GFP tiež zdobil sieť mikrotubulov (pozri obrázok 2f). Naopak, v bunkách exprimujúcich axín-RFP bol endogénny APC redistribuovaný do cytoplazmatického punktu, zhodného s axínom (obrázok 2c, šípky). V bunkách neexprimujúcich axín-RFP sa APC lokalizoval v klastroch pri bunkových rozšíreniach (obrázok 2c, šípky). Expresia mutantného proteínu AxinRGS-RFP (obrázok la), ktorý sa neviaže na APC (Behrens a kol., 1998; Hart a kol., 1998; Kishida a kol., 1998), ale vytvára podobné bodky ako axín divokého typu, mala žiadny vplyv na lokalizáciu endogénneho APC (obrázok 2d, šípky), potvrdzujúci, že premiestnenie APC závisí od väzby na axín. Podobne, keď sa APC-GFP koexprimoval s axínom-RFP, APC-GFP sa redistribuoval z koncov buniek do bodiek štruktúr obsahujúcich axín-RFP (obrázok 2e). Koexpresia APC-GFP s mutantným axínom ARGS-RFP opäť neviedla k redistribúcii APC (obrázok 2f). Podobné výsledky sa získali v HEK293 T bunkách (doplnkové obrázky SI a S2). Axín má teda schopnosť prijímať APC do cytoplazmatickej puncty.

Image

Nábor adenomatóznej polypózy coli (APC) do cytoplazmatickej axinovej puncty. a ) Endogénne APC a b ) APC-GFP sa lokalizujú na konce mikrotubulov v zhlukoch v bunkách psích obličiek Madin – Darby (MDCK). Jadrá APC (anti-APC) / APC-GFP, p-tubulínové jadrá (4, 6-diamidino-2-fenylindol; DAPI) modré. Zobrazené sú konfokálne obrázky s jednou sekciou. APC (vľavo); kompozitný obrázok (stred), stupnica 20 μm; vložka (vpravo) pri väčšom zväčšení klastrov APC, stupnica stupnice, 5 μm. c ) V prítomnosti endogénneho APC endogénneho RFP sa redistribuuje do axínového puncta. ( d ) MDCK bunky exprimujúce axinARGS-RFP. Bunky boli fixované a imunofarbené pomocou protilátok proti APC (zelené). Zobrazené sú jednokomorové konfokálne kompozitné obrazy, stupnica mierky 20 μm. APC sa deteguje pri špičkách buniek v netransfekovaných a axinovaných RGS-RFP bunkách (šípky c, d ). Výrazné APC puncta sú prítomné v bunkách exprimujúcich axín-RFP ( c, šípky), ale žiadny APC nebol asociovaný s axin ARRS-RFP puncta ( d ). ( e ) APC-GFP sa prijíma do axin-RFP puncta v MDCK bunkách. ( f ) APC-GFP nie je prijímaný do axin ARRS-RFP puncta. Zobrazené sú kompozitné obrazy projekcií buniek série Z zobrazených pomocou laserového skenovacieho konfokálneho mikroskopu. Mierka stupnice 20 μm. g - j ) Prijímanie APC do punkcie axínu-RFP zabraňuje zostaveniu mikrotubulov po depolymerizácii mikrotubulov. Bunky MDCK boli inkubované na ľade počas 1 hodiny, aby depolymerizovali mikrotubuly, a potom pri 30 ° C počas 1 minúty, fixované a imunofarbené. g ) Tvorba vretienka mikrotubulov sa vyskytuje v bunkách neexinujúcich expresiu. ( h ) V bunkách exprimujúcich axín-RFP je zostava vretena mikrotubulov znížená. ( i ) Tvorba vretien mikrotubulov v bunkách exprimujúcich axinARG-RFP. j ) Netransfekované bunky axínu a axínu ARGS-RFP sa hodnotili na prítomnosť alebo neprítomnosť mikrotubulárnych vretien. Zostava vretena mikrotubulov bola znížená v axín-RFP, ale nie v bunkách axinRGS-RFP. ( k - n ) Meranie interakcie APC-GFP a axínu-RFP v nanorozmeroch pomocou FRET-FLIM vo frekvenčnej oblasti. Zobrazené sú fluorescenčné obrazy APC-GFP a obrazy celoživotnej fluorescencie pre: ( k ) APC-GFP exprimovaný samostatne; ( l, m ) APC-GFP koexprimovaný s ( l ) axínom-RFP a ( m ) axínom ARGS-RFP. Fluorescencia APC-GFP koncentrovaná na špičkách buniek (šípky); Fluorescencia APC-GFP v intracelulárnom punkte so zodpovedajúcimi depresiami vo fluorescenčných časoch (šípky). Mierka stupnice 20 μm. n ) Priemerný čas fluorescencie APC-GFP v zhlukoch pri bunkových extenziách a vo vnútri intracelulárnych punkcií v bunkách exprimujúcich APC-GFP a axín-RFP. Štatistická analýza odhalila, že životnosť fluorescencie v punkcii bola znížená v porovnaní s životnosťou fluorescencie v zhlukoch pri bunkových extenziách ( *** P <0, 0001).

Obrázok v plnej veľkosti

Aj keď endogénny APC bol detegovaný v axín-RFP puncta, APC nemohol byť detegovaný v endogénnom axínovom puncte pozorovanom v MDCK bunkách (obrázky 1b a c): ani jeden endogénny axín nie je v dostatočnej koncentrácii (Lee et al., 2003) na umožňujú nábor APC alebo APC je prítomný na úrovni pod prahom detekcie. Preto sme skúmali hladiny axínu potrebné na oddeľovanie APC od bunkových rozšírení. Relatívne úrovne expresie axínu-RFP: APC-GFP sa merali na základe celkovej intenzity fluorescencie v jednotlivých bunkách a korelovali s lokalizáciou APC buď v punkcii alebo mikrotubulách (doplnkové obrázky S2C a D). Rozptylové grafy odhalili dva odlišné dátové zoskupenia zodpovedajúce APC lokalizované do siete mikrotubulov iba vtedy, keď bola expresia axínu nízka, a APC lokalizované do axínových puncta so zvyšovaním hladiny axínu (doplnkový obrázok S2D). Tieto dáta naznačujú, že prahová úroveň expresie axínu je potrebná na to, aby APC prerozdelil do punkty.

Ďalej sme skúmali, či nábor APC z klastrov na koncoch špičiek mikrotubulov do axínovej puncty ovplyvňuje funkcie APC spojené s mikrotubulami. Uvádza sa, že prítomnosť APC na mikrotubulách plus konce v bunkových rozšíreniach stabilizuje a podporuje rast mikrotubulov (Kita et al., 2006). Strata APC vedie k zníženým výčnelkom buniek a zníženej stabilite mikrotubúl (Kroboth a kol., 2007). Skúmali sme aktivitu mikrotubulov v netransfekovaných bunkách MDCK transfekovaných axínom-RFP a axinARGS-RFP. Bunky sa inkubovali na ľade počas 1 hodiny, aby sa depolymerizovali mikrotubuly a potom sa vyvolala polymerizácia mikrotubulov inkubáciou pri 30 ° C a následnou rýchlou fixáciou (obrázky 2g – j). Po 1 min inkubácie pri 30 ° C sa vytvorili mikrotubulárne astry v netransfekovaných bunkách (obrázok 2g) a po 5 minútach sa mikrotubuly repolymerizovali (nezobrazené). Na rozdiel od toho v bunkách exprimujúcich axín-RFP došlo k významnému zníženiu zostavenia mikrotubulov a po 1 min sa nevytvorili mikrotubulárne astry (obrázok 2h). Zostavenie mikrotubúl v bunkách exprimujúcich axinARGS-RFP bolo podobné kontrolným bunkám (obrázok 2i). Kvantifikovali sme tieto rozdiely spočítaním počtu buniek s mikrotubulovými zárodkami (vretená; Obrázok 2j). Menej ako 25% buniek exprimujúcich axín-RFP tvorilo astery za 1 minútu v porovnaní s viac ako 95% v netransfekovaných bunkách a 75% v bunkách exprimujúcich axín-ARGS (obrázok 2j). Expresia axínu-RFP teda inhibovala aktivitu APC na zostavenie mikrotubulov. Toto nebol priamy účinok nadmernej expresie axínu, pretože sa vyžadovala väzba APC a nábor do axínovej puncty. Sekvenovanie APC do axínovej puncty preto posunie bunkovú populáciu APC z miesta a funkcie spojenej s mikrotubulami.

Priama interakcia medzi APC-GFP a axin-RFP v rámci puncta

Aby sme určili, či kolokalizácia APC a axínu v axinovom puncte zahŕňa priamu interakciu, merali sme fluorescenčný rezonančný prenos energie (FRET) medzi APC-GFP a axin-RFP pomocou fluorescenčnej celoživotnej zobrazovacej mikroskopie (FLIM). Zníženie životnosti APC-GFP v prítomnosti axínu-RFP naznačuje FRET, čo znamená, že dva fluorofory sú od seba vzdialené 10 nm (obrázky 2k – n). Fluorescenčná životnosť GFP fluoroforu v bunkách exprimujúcich APC-GFP samotná bola relatívne jednotná, s hodnotami životnosti v očakávanom rozmedzí 2 - 2, 25 ns pre GFP (obrázok 2k; priemerná životnosť 2, 03 ± 0, 03 ns ( n = 11), obrázok 2n). ). Životnosť fluorescencie bola nezávislá od intenzity fluorescencie, a teda od množstva APC-GFP v zhlukoch. Keď sa axín-RFP koexpresoval s APC-GFP, redistribúcia APC-GFP na intracelulárny axínový puncta bola sprevádzaná znížením fluorescenčnej životnosti APC-GFP (obrázok 2l, šípky, priemerná životnosť 1, 61 ± 0, 03 ns, n = 82; obrázok); 2n) indikuje priamu interakciu. Koexpresia APC-GFP s mutantným proteínom AxinRGS-RFP nemala žiadny vplyv na životnosť APC-GFP (obrázky 2m a n). Interakcia medzi axínom-RFP a APC-GFP je preto špecifická, ako ukazujú štúdie mapovania koprecipitácie a delécie (Behrens a kol., 1998; Hart a kol., 1998) a vyskytuje sa skôr v cytoplazmatickej punkcii, ako na koncoch mikrotubulov.,

Dynamické správanie APC-GFP je ovplyvňované axin-RFP

Už skôr sa ukázalo, že APC označený GFP sa pohybuje po sieti mikrotubulov smerom k svojim plusom na okraji bunkových rozšírení (Mimori-Kiyosue a kol., 2000). Preto sme skúmali, či väzba na axín zmenila dynamiku pohybu APC v bunke (obrázok 3; doplnkový materiál (filmy 1A – C)). APC-GFP bol primárne lokalizovaný na špičkách mikrotubulov s určitou dekoráciou siete mikrotubulov, keď bol prítomný vo vyšších hladinách (obrázok 3a, prerušovaná šípka; doplnkový materiál (film 1A); pozri tiež doplnkový obrázok S2B). Pohyb ľudského APC-GFP bol konzistentný s pohybom Xenopus APC (Mimori-Kiyosue a kol., 2000) a tiež sa akumuloval v špecifických štruktúrach, pravdepodobne spojených s mikrotubulami (obrázok 3a; šípky; doplnkový materiál (film 1A))).

Image

Axin obmedzuje dynamické správanie adenomatóznej polypózy coli (APC). Časosběrná analýza APC-GFP a axínu-RFP. Statické snímky z (doplnkový materiál (filmy 1A – C)) APC-GFP a axínu-RFP v živých T bunkách HEK293. Sú zobrazené zlúčené obrazy signálu GFP a červeného fluorescenčného proteínu (RFP). Uplynutý čas je uvedený v ľavom hornom rohu panela ( a ) (min: s). ( a ) APC-GFP (film 1A). Prerušované šípky označujú dekoráciu mikrotubulovej siete; šípky označujú pohyb GFP pozdĺž mikrotubulov. Zhluk štruktúr APC-GFP v niekoľkých špecifických oblastiach (jednoduché hviezdičky); zdá sa, že niektoré zhluky rastú a pohybujú sa pozdĺž mikrotubulov pred rozptýlením (dvojité hviezdičky) alebo dokonca zmiznutím (šípky). ( b - d ) koexpresia APC-GFP a axín-RFP. ( b ) film 1B. GFP signál je teraz lokalizovaný v cytoplazmatickej punkcii, ktorá sa zhoduje s axínom, na zlúčenom obrázku je znázornená ako žltá. Veľké (šípky) a menšie (šípky) axin puncta demonštrujú oscilačný pohyb (film 1B). Hviezdičky označujú bodky, ktoré sa zdajú byť oddelené na červené a zelené častice a potom sa zlúčia do žltej. ( c ) Bunka vľavo od filmu 1C (a pri väčšom zväčšení v d ), demonštruje dva GFP punkty, ktoré sa prekrývajú s RFP (vizualizované ako žlté), označené symbolom otvorenej šípky. Táto bunka tiež vykazuje APC-GFP dekoráciu siete mikrotubulov (prerušované šípky) a akumuláciu častíc GFP ( * ), ktoré sa zdajú byť pohybované pozdĺž mikrotubulov pred dispergovaním ( ** ). Zdá sa, že nižšia hladina expresie axínu v tejto bunke ovplyvňuje iba relatívne malú časť APC-GFP; APC-GFP neviazaný na axín sa pohybuje pozdĺž mikrotubulov podobným spôsobom ako APC-GFP exprimovaný samostatne. Toto sledovanie APC-GFP je vizualizované vo filme 1C. e ) Analýza sledovania jednotlivých častíc (SPT) APC-GFP a axínu-RFP. Dávka stredného štvorca (MSD) v závislosti na čase pre zvýraznenú časticu ( * ) podstupujúcu riadený pohyb z ( a ) (zelené trojuholníky) a zvýraznenú časticu z ( d ) (otvorená šípka) podstupujúci obmedzený pohyb (červené diamanty a vložka) ). ( f ) Difúzne a rýchlostné koeficienty z SPT analýzy.

Obrázok v plnej veľkosti

Na rozdiel od toho, keď APC-GFP bol koexprimovaný s axínom-RFP a premiestnený do punkcie, už neexistovalo žiadne zistiteľné sledovanie ani koordinovaný alebo riadený pohyb APC-GFP (obrázky 3b – d; doplnkový materiál (filmy 1B a C))., Namiesto toho boli APC-GFP aj axín-RFP obmedzené na bodky a na mieste sa zdajú oscilovať. Analýza sledovania jednotlivých častíc (SPT) z časosběrných snímok odhalila rýchlu difúziu voľného APC-GFP, zatiaľ čo častice APC-GFP v punkte axínu-RFP sa pohybovali trikrát pomalšie (obrázok 3f). Naša analýza zahŕňa kombinovanú difúziu a riadený pohyb. Dráhy častíc boli stanovené z časosběrných snímok, ktoré sú vyjadrené ako stredné štvorcové posunutie (MSD) ako funkcia času (obrázok 3e). Tvar grafu MSD verzus čas poskytuje informácie o rýchlosti a type pohybu. Lineárne znázornenie naznačuje náhodnú Brownianovu difúziu a zakrivenie smerom hore označuje nasmerovaný pohyb a zakrivenie nadol znamená obmedzený pohyb. SPT analýza preukázala, že v 11 zo 17 miest obsahujúcich APC-GFP bola analyzovaná smerová zložka, čo bolo dokázané vzostupným zakrivením v MSD ​​verzus čas (graf 3e, zelené trojuholníky). Na rozdiel od toho, keď sa APC-GFP kolonizoval s axínom-RFP, vyrovnanie MSD verzus čas ukazuje na obmedzený pohyb (obrázok 3e, červené diamanty a vložka). Väčšie (obrázok 3b, šípky) aj menšie bodky (obrázok 3b, šípka) vykazovali podobné oscilačné správanie. Poloha a pohyb APC-GFP viazaného na axín-RFP bol teda obmedzený v porovnaní s rýchlym, riadeným pohybom voľného APC-GFP.

Dynamické správanie APC-GFP koexprimovaného s axínom-RFP sa analyzovalo v bunkách, ktoré exprimovali rôzne hladiny axínu-RFP (obrázky 3c a d; doplnkový materiál (film 1C)). Bez ohľadu na úrovne expresie axínu-RFP bola dynamika APC-GFP riadená tým, či sa APC-GFP viazal na axín-RFP alebo nie. V bunkách exprimujúcich vysoké hladiny axínu-RFP (obrázok 3c, šípka) bola väčšina APC-GFP kolonizovaná pomocou axínu-RFP a jej pohyb bol zodpovedajúcim spôsobom obmedzený. V bunkách exprimujúcich nízke hladiny axínu-RFP bola iba malá časť celkového APC-GFP kolokalizovaná s axínom-RFP, avšak všetky tieto podiely mali obmedzený pohyb (obrázky 3c a d, otvorené šípky). Na rozdiel od toho sa väčšina APC-GFP v týchto bunkách neviazala na axín a dynamika tohto pomeru bola ekvivalentná s dynamikou APC-GFP v bunkách, ktoré neboli transfekované axínom-RFP (doplnkový materiál (film 1C)); obrázky 3c a d, prerušovaná šípka). Axín teda ovplyvňuje dynamiku APC-viazaného na axín, ale nemá žiadny vplyv na pomer, ktorý nie je viazaný. To naznačuje, že v bunke môžu koexistovať dve populácie APC, jedna asociovaná s mikrotubulou a druhá asociovaná s axin-punctou.

Nábor deštrukčných komplexných proteínov do axin puncta

Aby sme určili, či axin puncta predstavuje komplex deštrukcie p-katenínu (Schneikert a Behrens, 2007), skúmali sme schopnosť axínu-RFP získavať endogénny p-katenín, GSK3-β a CK1-α do axínovej puncty (obrázok 4). Pôvodne sme potvrdili, že prechodná expresia rekombinantného axínu viedla k downregulácii p-katenínu v bunkách SW480, čo je bunková línia rakoviny hrubého čreva, ktorá obsahuje iba skrátené APC (obrázok 4a), ako už bolo uvedené (Behrens et al., 1998; Hart a kol.); a kol., 1998). Táto downregulácia bola spôsobená degradáciou sprostredkovanou proteazómami, pretože inhibícia proteazómu pomocou MG132 viedla k akumulácii p-katenínu v punkte obsahujúcej axín (obrázok 4a, šípky). V bunkách MDCK bol podiel β-katenínu zameraného na degradáciu maskovaný veľkou populáciou β-katenínu asociovaného s membránou, preto sme použili fosfo-špecifické β-katenínové protilátky, ktoré detegujú pS45 / pT41 / pS37 / pS33-β-katenín. (fosfo-p-katenín) na vizualizáciu zásoby p-katenínu, ktorý je zameraný na degradáciu (obrázok 4b). Inhibícia proteazómu umožnila akumulovanie fosfo-p-katenínu v puncte obsahujúcom axín (obrázok 4b, šípky), z čoho vyplýva, že axin puncta predstavuje deštrukčný komplex. Podobne inhibícia GSK3-p v bunkách SW480 vyústila do zvýšeného p-katenínu zhodného s axinovým bodom (doplnkový obrázok S3A), čo ďalej implikovalo axínový bod ako miesto deštrukčného komplexu. Endogénne GSK3-p a CK1-a sa tiež získavali na puncta obsahujúce axín-RFP v MDCK bunkách (obrázky 4c a d). Podobne bol GSK3-P prijatý na axín-RFP puncta v bunkách SW480 (doplnkový obrázok S3B). Na rozdiel od p-katenínu hladiny GSK3-p neboli regulované deštrukčným komplexom, pretože kvantifikácia celkovej fluorescenčnej intenzity GSK3-p neukazuje žiadny rozdiel medzi netransfekovanými a bunkami transfekovanými axin-RFP (obrázok 4e). Súhrnne tieto výsledky ukazujú, že endogénne deštrukčné komplexné proteíny, GSK3-P, CK1-a a APC, sa všetky prijímajú do axínovej puncty. Nábor p-katenínu sa pozoroval iba vtedy, ak sa jeho degradácia inhibovala vypnutím proteazómu, čo znamená, že sa puncta zúčastňuje na funkčnom deštrukčnom komplexe.

Image

Nábor p-katenínu, glykogénsyntázy kinázy-3-ß (GSK3-ß) a kazeínkinázy-1-a (CK1-a) v bunkách exprimujúcich axín-RFP. ( a ) SW480 a ( b ) bunky psích obličiek madin-Darby (MDCK) exprimujúce axín-RFP boli ošetrené proteazómovým inhibítorom MG132 a imunofarbené protilátkami proti β-katenínu pre bunky SW480 ( a ) alebo fosfo-β-katenínom ( P-P-cat) pre bunky MDCK ( b ). Zobrazené sú konfokálne obrazy β-katenínu alebo P-ß-mačky, axínu-RFP a zložené obrazy (β-katenínu alebo P-ß-mačky - zelené, axínové-RFP - červené, jadro - modré v ( a )) na kontrolu. a ošetrené bunky. Šípky označujú bunky exprimujúce axín-RFP; šípky označujú p-katenín alebo P-p-masku zhodný s axínom-RFP. ( c ) GSK3-P a ( d ) CK1-a sa prijímajú na axín-RFP puncta v MDCK bunkách. Znázornené sú konfokálne obrazy MDCK buniek exprimujúcich axín-RFP a imunofarbené protilátkami proti GSK3-ß ( c ) alebo CK1-a ( d ). Zložené obrázky ukazujú GSK3-ß alebo CK1-α - zelený, axínový-RFP - červený. Mierka, 20 μm. ( e ) Merala sa intenzita fluorescencie GSK3p z jednotlivých MDCK buniek s expresiou a bez expresie axínu-RFP. Zobrazené hodnoty sú priemer a sem intenzity fluorescencie GSK3p z najmenej 50 buniek.

Obrázok v plnej veľkosti

Prijímanie β-katenínu do axínovej puncty nevyžaduje APC plnej dĺžky

Degradácia p-katenínu po prechodnej expresii axínu v bunkách SW480 (Behrens a kol., 1998; Hart a kol., 1998; obrázok 4a) je trochu prekvapujúca, pretože bunky SW480 obsahujú skrátený proteín APC, ktorý nie je schopný viazať axín., To znamená, že expresia axínu umožňuje vytvorenie funkčného deštrukčného komplexu v neprítomnosti neporušeného APC, ale relatívna dôležitosť axínu a APC pri tvorbe deštrukčného komplexu a mechanizmus, ktorým expresia axínu vedie k degradácii p-katenínu, sa ešte nedosiahla. boli objasnené. Skúmali sme požiadavku na APC v bunkách iných ako SW480. Mutant axínu AGGS, ktorý sa neviaže na APC, bol stále schopný down-regulovať p-katenín v bunkách SW480 (doplnkový obrázok S4) a rekrutovať fosfo-p-katenín a GSK3-p v MDCK bunkách (obrázok 5). Podobne ako pri axíne-RFP divokého typu sa fosfo-p-katenín detegoval v axin ARGS puncta (obrázok 5a) a hladiny fosfo-p-katenínu sa zvýšili v týchto punktách obsahujúcich axin AGGS v prítomnosti inhibítorov proteazómu (obrázok 5b). Podobne bol GSK3-p tiež prijatý do punkty obsahujúcej axín ARGS (obrázok 5c). Dospeli sme k záveru, že napriek tomu, že je APC prijatý do deštrukčného komplexu, nie je nevyhnutne potrebný na vytvorenie funkčného deštrukčného komplexu.

Image

Nábor axínu β-katenínu a glykogénsyntázy kinázy-3-β (GSK3-β) nevyžaduje adenomatóznu polypózu coli (APC). ( a ) Kontrolné alebo ( b ) bunky Madin-Darby psích obličiek (MDCK) ošetrené MG132 exprimujúce axinARGS-RFP boli imunologicky farbené protilátkami proti fosfo-β-katenínu (P-β-mačka). ( c ) Bunky exprimujúce axinARGS-RFP boli imunofarbené protilátkami proti GSK3-p. Zobrazené sú konfokálne obrazy P-ß-cat alebo GSK3-ß, axinARRS-RFP a kompozitné obrazy (P-ß-cat alebo GSK3-β - zelený, axín-RFP - červený). Šípky označujú fosfo-p-katenín alebo GSK3-p súčasne s axinom RGS-RFP. Mierka: 20 μm.

Obrázok v plnej veľkosti

Tvorba axin puncta je nevyhnutná na degradáciu ß-katenínu, ale nie na fosforyláciu

Nedávno sa ukázalo, že domény DIX tak Dvl2, ako aj axínu, sprostredkúvajú samopolymerizáciu a tvorbu puncty (Schwarz-Romond a kol., 2007a, 2007b). Preto sme skúmali, či je na zostavenie deštrukčného komplexu potrebná polymerizácia axínu a tvorba puncty a či ovplyvňujú nábor a degradáciu β-katenínu. Predchádzajúce štúdie ukázali, že doména DIX je dôležitá pre reguláciu ß-katenínu (Kishida et al., 1999; Sakanaka a Williams, 1999), ale tiež sa uvádza, že delécia domény DIX neovplyvňuje schopnosť axínu. na zmenu lokalizácie p-katenínu (Nakamura et al., 1998). Testovali sme schopnosť axínu APIX-RFP získavať p-katenín v bunkách ošetrených inhibítormi proteazómu (obrázok 6). Ako sme už predtým uviedli, výsledkom expresie axínu-RFP bola deštrukcia p-katenínu (obrázok 6a, vľavo), ktorej bolo zabránené inhibíciou proteazómu, čo viedlo k detekcii p-katenínu v axínovej punkcii (obrázok 6a, vpravo). Zistili sme, že axinADD netvoril punctu, ale namiesto toho bol rozptýlený difúzne v cytoplazme (obrázok 6b), čo je konzistentné s predchádzajúcimi správami, že doména DIX je potrebná na účinnú tvorbu puncty (Schwarz-Romond a kol., 2007b). Dôležité je, že expresia axínu APIX-RFP neviedla k zníženiu p-katenínu, ale namiesto toho bol p-katenín prevažne cytosolický s distribúciou, ktorá odzrkadľovala distribúciu axínu APD (obrázok 6b). Zdá sa teda, že axin AIX vylučuje p-katenín, ale to nevedie k jeho degradácii. Inhibícia proteazómu nemala výrazný účinok na distribúciu alebo hladiny p-katenínu, čo naznačuje, že na účinné odbúravanie p-katenínu je potrebná tvorba axínového punktu. Aby sa určilo, či je potrebná tvorba axínu puncta na fosforyláciu ß-katenínu, skúmali sme, či sa fosfo-ß-katenín v cytoplazme sekvestroval po expresii axínu APIX. Skutočne sme zistili zvýšenú cytoplazmatický fosfo-ß-katenín v bunkách axinAIX v porovnaní s netransfekovanými okolitými bunkami, v bunkách SW480 aj MDCK (obrázky 6c a d). Kvantifikácia intenzity fluorescencie potvrdzuje, že hladiny cytoplazmatického fosfo-P-katenínu sa zvyšujú v bunkách exprimujúcich axin AIX (obrázok 6e). AxinADIX preto získaval p-katenín, GSK3-p a CK1 (ako vyplýva z fosforylácie p-katenínu asociovaného s axinDDIX). AxinΔDIX je tiež schopný získavať APC. APC sa translokuje zo zhlukov na koncoch mikrotubulov v časti MDCK buniek exprimujúcich axin AIX. Tento nábor nie je taký efektívny ako nábor prostredníctvom Axin puncta (doplnkový obrázok S5). Tieto výsledky naznačujú, že axin AIX, ktorý stále obsahuje väzbové miesta pre p-katenín, APC, GSK3-P a CK1-a, stále uľahčuje fosforyláciu p-katenínu pomocou GSK3-P, ale proteazómová degradácia je blokovaná v neprítomnosti punkcie.

Image

Tvorba Axin puncta je potrebná na degradáciu p-katenínu, ale nie na fosforyláciu p-katenínu. ( a ) Expresia axínu-RFP v bunkách SW480 viedla k degradácii p-katenínu v kontrolných bunkách (v ľavých paneloch), zatiaľ čo p-katenín bol rekrutovaný na axínové puncta v bunkách ošetrených MG132 (pravé panely). ( b ) AxinDIX-RFP netvoril punctu a vyústil do sekvestrácie p-katenínu v cytoplazme, ale nie k degradácii tak v kontrolných bunkách, ako aj v bunkách SW480 ošetrených MG132. Doména DIX je potrebná na tvorbu punkcie a degradáciu p-katenínu. Expresia AxinADIX v bunkách ( c ) SW480 a ( d ) psích obličiek Madin-Darby (MDCK) viedla k sekvestrácii P-ß-mačky v kontrolných (ľavých paneloch) a bunkách ošetrených MG132 (vpravo). Zobrazené sú konfokálne obrazy β-katenínu ( a, b ) alebo P-ß-mačky ( c, d ) a zložené obrazy (β-katenínu, P-ß-mačky - zelené, axínové-RFP, axínové-DIX-RFP - červené, jadrá (46-diamidino-2-fenylindol; DAPI) --lue). Šípky označujú bunky exprimujúce axin AIX, kde sú zvýšené cytoplazmatické P-P-mačky, prerušované šípky označujú netransfekované bunky. Našli sme len málo dôkazov o tvorbe puncta axinDIX-RFP v bunkách SW480 alebo MDCK. Mierka, 20 μm. ( e ) Merala sa intenzita fluorescencie cytoplazmatického P-P-cat z jednotlivých buniek SW480 (ľavý graf) a MDCK (vpravo) s axinom AIX a bez neho. Zobrazené hodnoty sú priemerné ± sem cytoplazmatickej intenzity fluorescencie P-ß-mačky. Všimnite si, že inhibícia proteazómu mala malý účinok na cytoplazmatickú sekvestráciu ß-katenínu.

Obrázok v plnej veľkosti

diskusia

V tomto článku navrhujeme novú paradigmu na zostavenie komplexu deštrukcie p-katenínu. Expresiou axínu-RFP sme dokázali zachytiť proteíny mimo iných subcelulárnych miest a vytvoriť komplex deštrukcie p-katenínu v spojení s axin puncta. Naše výsledky ukazujú, že axín prijíma APC do cytoplazmatickej puncty, kde je jeho pohyb obmedzený v dôsledku väzby axínu a jeho schopnosť regulovať zostavenie mikrotubulov je výrazne znížená. Avšak v bunkách, ktoré nadmerne exprimujú axín, nábor a degradácia p-katenínu v axínovom puncte nevyžaduje APC. Nábor p-katenínu, GSK3-p a CK1-a do axínového puncta znamená, že axínový puncta tvorí miesto klasického deštrukčného komplexu p-katenínu. Axín puncta, sprostredkovaný doménou DIX, sa nevyžaduje na získavanie deštrukčných komplexných proteínov alebo fosforyláciu p-katenínu, avšak degradácia p-katenínu sa nevyskytuje, pokiaľ sa nevytvoria punkty. Sme presvedčení, že axín je dôležitý pri nábore APC, β-katenínu a GSK3-ß a že axínové puncta sú rozhodujúce pre degradáciu β-katenínu.

Schopnosť axínu tvoriť punctu bola publikovaná už skôr (Fagotto a kol., 1999; Smalley a kol., 1999; Schwarz-Romond a kol., 2005) a nedávne štúdie ukazujú, že tvorba punkcie je dynamický proces sprostredkovaný proteínom. oligomerizácia alebo polymerizácia (Schwarz-Romond a kol., 2007a, 2007b). Naše údaje poskytujú dôkaz o existencii endogénneho axínového punktu, čo je v súlade s detekciou malých štruktúr punktu alebo škvŕn s axínovými protilátkami v bunkách 293 (Levina a kol., 2004; Wiechens a kol., 2004). Ukázalo sa, že doména DIX axínu sprostredkuje sebazostavenie in vitro a prispieva k signalizačnej funkcii axínu (Kishida et al., 1999; Sakanaka a Williams, 1999), ale nie je potrebná na nábor do Dvl2 puncta (Schwarz- Romond a kol., 2007b). Namiesto toho naše údaje teraz ukazujú, že doména DIX axínu je nevyhnutná pre tvorbu axínových punkcií a degradáciu p-katenínu. Polymerizácia Dv2 bola navrhnutá tak, aby zabezpečovala vysokú lokálnu koncentráciu Dv12, a tým podporovala nábor svojich väzobných partnerov (Schwarz-Romond a kol., 2007b). Naproti tomu axín prijal ďalšie zložky deštrukčného komplexu v neprítomnosti tvorby punkcie, čo naznačuje, že dynamická polymerizácia do zostáv s vysokou lokálnou koncentráciou axínu nie je nevyhnutná pre nábor svojich väzobných partnerov. P-katenín je tiež správne fosforylovaný, keď sa viaže na monomérny axín AIX. Monomérny axín AIX môže preto stále pôsobiť ako skafold pre zložité zostavenie a fosforyláciu p-katenínu, ale nie degradáciu p-katenínu. Tvorba punkcie sa môže vyžadovať pri nábore, umiestňovaní a / alebo aktivácii zariadenia na ubikvitináciu škatule Skp1 / Cul 1 / F (Hart a kol., 1999; Latres a kol., 1999; Winston a kol., 1999). V súčasnosti prebiehajú experimenty, aby sa zistilo, či je potrebná tvorba puncty na nábor p-TrCP, ubikvitináciu p-katenínu alebo proteazomálnu degradáciu.

Navrhujeme, že axín podporuje tvorbu komplexu APC / axín na presnom subcelulárnom mieste, ktoré je odlišné od koncentrácie a funkcie APC na špičkách mikrotubúl. Tento koncept je podporený identifikáciou najmenej dvoch funkčne odlišných proteínových komplexov obsahujúcich APC (Penman et al., 2005). Tu uvádzame dôkazy pre dve odlišné subcelulárne populácie APC s rôznymi funkciami. Pri rozšírení mikrotubúl APC reguluje dynamiku zostavenia mikrotubulov, zatiaľ čo v axin puncta komplex APC / axin potencuje deštrukciu p-katenínu. Naša demonštrácia, že axín presmeruje APC od koncov mikrotubúl, čo bráni zostaveniu mikrotubulov, naznačuje, že funkcie APC v regulácii dynamiky mikrotubulov a stability β-katenínu sú priestorovo oddelené.

Axin môže riadiť umiestnenie a pohyb APC, ale zdá sa, že APC neovplyvňuje distribúciu axínu. V Drosophila sa APC tiež prijíma do cytoplazmatickej punkcie po nadmernej expresii axínu (Cliffe et al., 2003). Zdá sa, že množstvo axínu v bunke mení rovnováhu medzi APC naviazaným na axín a APC spojeným s mikrotubulami. Aj keď je uvedená fyziologická koncentrácia axínu nízka (Lee a kol., 2003), aj nízke koncentrácie axínu (vrátane endogénneho axínu) tvoria punktu, čo naznačuje vysokú lokálnu koncentráciu. Je pravdepodobné, že populácie APC sa riadia skôr tým, či je alebo nie je viazaný axín, a nie koncentráciou axínu. Dôležité je, že naše údaje ukazujú, že väzba na axín obmedzovala difúziu a rýchlosť APC-GFP a bránila riadenému pohybu (Mimori-Kiyosue a kol., 2000; Dayanandan a kol., 2003; Langford a kol., 2006). Zmenená dynamika APC naviazaného na axín podporuje naše zistenia, že komplex axín / APC je odlišný od rýchlo sa pohybujúcej populácie APC v mikrotubuliach. Skutočne sme zistili, že expresia axínu zmenila funkciu mikrotubulov, a to záviselo od väzby APC. Nedávno sa uvádza, že Dvl2 mení dynamické správanie axínu, pravdepodobne mení afinitu k axínu a niektorým z jeho ligandov (Schwarz-Romond a kol., 2007b). Obmedzený pohyb APC v axínovom puncte pravdepodobne odráža veľkosť polymerizovaného komplexu axínu a / alebo zmenený konformačný stav v dôsledku interakcií, ktoré sa líšia od populácie APC interagujúcich s mikrotubulami.

Je prekvapujúce, že nábor APC k axínu sa zdá byť postačujúci na degradáciu p-katenínu (táto štúdia; Hart a kol., 1998; Kishida a kol., 1999). Ukázalo sa však, že APC ovplyvňuje hladiny p-katenínu (Munemitsu a kol., 1995). Môže sa stať, že endogénne hladiny axínu nie sú dostatočné na reguláciu hladín p-katenínu v neprítomnosti štandardného APC, ale zvýšený axín môže nezávisle podporovať degradáciu p-katenínu. Skutočne, nadmerná expresia proteínov Dvl vedie k Wnt-nezávislej signalizácii (Kishida a kol., 1999; Smalley a kol., 1999; Park a kol., 2005), ktorá je závislá od domény Dvl DIX (Schwarz-Romond a kol., 2007b). V Xenopus je pre kanonickú signalizáciu dôležitá miestna koncentrácia Dvl (Park a kol., 2005). Podobne vynútená oligomerizácia LRP6 indukuje Wnt signalizáciu a obchádza požiadavku na Dvl (Cong a kol., 2004; Bilic a kol., 2007).

Úloha APC v regulácii p-katenínu je dobre zdokumentovaná: skrátené mutácie v APC vedú k zvýšeným hladinám p-katenínu (Schneikert a Behrens, 2007). Už skôr sme však ukázali, že stabilná expresia APC v bunkách SW480 vedie k zníženej transkripčnej signalizácii ß-katenínu / Tcf v dôsledku translokácie ß-katenínu na periférii bunky a nie k významným zmenám v celkovom množstve β-katenínu (Faux a kol., 2004). Navrhujeme, že axín, skôr než APC, je rozhodujúcim hráčom pri degradácii ß-katenínu a APC môže prispievať reguláciou cytoplazmatického β-katenínu dostupného pre deštrukčný komplex alebo ovplyvňovaním rýchlosti degradácie β-katenínu. APC je mutovaný vo väčšine rakovín hrubého čreva a je najvýznamnejším supresorom nádoru v hrubom čreve. Vzhľadom na funkcie APC v bunkovej migrácii, priľnavosti buniek a chromozomálnej stabilite (Fodde, 2003) je nádorová supresorová aktivita APC a jej úloha pri Wnt signalizácii pravdepodobne zložitejšia než jednoduchá regulácia jadrových hladín β-katenínu (Polakis), 2000; Clevers, 2006). Výzvou je teraz zistiť, ako sú aktivity APC v cytoskelete spojené s Wnt signalizáciou a potlačením nádoru.

Materiály a metódy

Protilátky a plazmidy

Boli použité nasledujúce protilátky: anti-APC (APC2, vyrobené v našom laboratóriu (Catimel et al., 2006)), anti-APC (H290; Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA), anti-CK1a (Santa Cruz), anti-axín-1 (Zymed, San Francisco, CA, USA), anti-fosfo-p-katenín (Cell Signaling, Danvers, MA, USA, 9561, pS33, pS37, pT41 a 9565, pT41, pS45), anti -P-katenín (19920/610153; BD Transduction Laboratories, San Jose, CA, USA), anti-GSK3β (G22320; BD Transduction Laboratories), anti-aktín (klon AC-40; Sigma, St Louis, MS, USA)., anti-P-tubulín (klon 2.1; Sigma) a anti-HA (262K # 2362; Cell Signaling). Aby sa vytvoril C-terminálne značený APC-GFP, zosilnený GFP sa subklonoval ako fragment Bam Hl / Not 1 do pEF-mycAPC (Faux a kol., 2004) po odstránení STOP. Expression of GFP at the C terminus did not compromise the localization of APC nor, as shown previously (Sharma et al., 2006), its colocalization with binding proteins β-catenin, EB1, KAP3a and DLG-1, suggesting that the C-terminal GFP does not interfere with APC interactions at its C terminus. For expression of axin-mRFP, the cDNA encoding monomeric RFP (mRFP1) (Campbell et al., 2002), gift from Dr Mark Prescot (Monash University, Australia), was subcloned into pDsRed1-N1 (Clontech, Mountain View, CA, USA), replacing DsRed1 (referred to as pDsRed-mRFP1). The cDNAs encoding full-length mouse axin1 isoform1, 125–956 aa (Zeng et al., 1997), was amplified from pCS2-6myc mouse axin (gift of Dr Frank Costantini, Columbia University Medical Centre, NY, USA) and an N-terminally extended mouse axin1 isoform1 (12–956), was amplified from pCS2_MT-mouse axin (gift of Dr Daniel Capelluto, Denver, USA) and both were subcloned into pDsRed-mRFP1. Both forms of axin-RFP formed puncta and were capable of recruiting APC-GFP. AxinΔRGS-RFP (aa 190–353 deleted) and axinΔDIX-RFP (aa 875–956 deleted) deletion constructs were created in two parts and subcloned into pDsRed-mRFP1 (Figure 1).

Cell culture, transfections and treatments

MDCK and HEK293 T cells were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) and 1% penicillin/streptomycin. SW480 cells (Leibovitz et al., 1976) were grown in RPMI supplemented with 0.00108% 10–2 thioglycerol, 0.1 U/ml insulin, 50 μg/ml hydrocortisone, 10% FCS and 1% penicillin/streptomycin. Cells were plated on 1.5 mm optical glass coverslips in 35 mm dishes. HEK293 T cells were plated on coverslips coated with fibronectin (1 μg/ml). MDCK cells were transfected using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA); SW480 and HEK293 T cells were transfected using FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) with 0.1–2 μg plasmid DNA per dish. Microtubule assembly experiments were performed as described (Nakamura et al., 2001). Transfected MDCK cells were incubated on ice for 60 min, and then at 30 °C for 0.5, 1, 2 and 5 min and cells were fixed rapidly and immunostained as described (Faux et al., 2004). For inhibition of the proteasome, cells were treated with 15 μ M MG132 (Sigma) or dimethyl sulphoxide control, 6 h at 37 °C. Antibody dilutions were as follows: 1:200 for axin, APC, GSK3-β, CK1-α; 1:400 for β-catenin; anti-pS33, pS37, pT41- and pT41, pS35-phospho-β-catenin antibodies were diluted 1:200 and combined to assess phosphorylated β-catenin (P-β-cat), 1:500 for fluorescently-labelled AlexaFluor-488, -405 or -532 secondary antibodies (Molecular Probes Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). In the case of phospho-β-catenin antibodies, all experiments were performed with anti-pS33, pS37, pT41- and pT41, pS35-phospho-β-catenin antibodies separately and together with identical results, hence staining with combined antibodies are shown. Where indicated, nuclei were visualized using 46-diamidino-2-phenyl indole (Molecular Probes).

Confocal fluorescence microscopy and image analysis

Direct fluorescence (GFP and RFP) and immunofluorescence staining were detected in successive focal planes using Bio-Rad MRC-1024 dual system (Hemel Hempstead, UK) and Nikon C1 confocal microscopes. Double- and triple-label images were detected using standard filter sets and laser lines. Cells were imaged with Nikon Plan Apo × 60 (NA1.4) or Nikon TIRF × 100 (NA1.45) oil immersion lenses. Fluorescence intensity measurements were performed using ImageJ (NIH, Bethesda, USA). Following background subtraction, individual cells were selected and mean fluorescence intensity measured and multiplied by selected area to obtain total fluorescence. For quantitative cytoplasmic fluorescence, the fluorescence intensity of four randomly selected areas of identical size taken from the cytoplasm of individual cells were measured and mean fluorescence intensity determined using ImageJ software.

Fluorescence lifetime imaging micrsoscopy analysis

FLIM experiments were carried out as described (Clayton et al., 2005; Hanley and Clayton, 2005). The phase and modulation were determined from a series of images taken at 12 phase settings using software provided by the manufacturer and converted to phase lifetimes with correction for photobleaching as described (van Munster and Gadella, 2004). Fluorescein dianion (lifetime 4.1 ns) was used as a reference (Magde et al., 1999). Two approaches were used to analyse the FLIM data. In the first approach the decrease in APC-GFP lifetime in a FLIM image was used to infer the existence of FRET between APC-GFP and axin-mRFP in axin puncta but not elsewhere in the cell or not in control cells. In the second approach APC-GFP at cellular protrusions were distinguished from cytoplasmic axin-puncta-associated APC-GFP and the mean phase lifetime in those two regions were determined for a number of cells. The cellular population average and standard deviations were used in an unpaired t -test to determine whether the lifetimes in the different regions were statistically different with a 95% confidence interval.

Time-lapse imaging and analysis

APC-GFP and N-terminally extended axin(12–956)-RFP transfected HEK293 T cells were imaged 24 h post transfection in indicator-free DME containing 10% FCS in an humidified atmosphere containing CO 2 saturation at 37 °C using a BioRad MRC-1024 dual system confocal microscope (see above) equipped with a Nikon Plan Apo × 60 water immersion with coverslip correction collar (NA1.2). Time-lapse images were collected sequentially over 60–90 cycles every 12–15 s and saved as uncompressed AVI files. Single particles from time-lapse images were filtered and tracked using the ImageJ plugin 'Spot Tracker' (Sage et al., 2005). The analysis of the trajectories follows essentially the same approach as the Cherry laboratory (Wilson et al., 1996). For each track through i images, the MSD is calculated for different time intervals n dt, n =1, 2,

,

, n being the number of images between which the displacement is computed, and dt is the time interval between images. These calculations were made up to n < i /2 to prevent insufficient averaging from overlapping segments of the track. The MSD values were plotted as a function of time ( n dt) and the particle mobility assigned to simple diffusion (diffusion coefficient D, Equation b), diffusion+directed motion (velocity v , Equation b) (Saxton and Jacobson, 1997) motion or an approximation to constrained diffusion ( v is an imaginary number in Equation b).

Image

Image

Doplnková informácia

Obrázkové súbory

  1. 1.

    Doplnkový obrázok S1

  2. 2.

    Doplnkový obrázok S2

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplnkový obrázok S3

  2. 2.

    Doplnkový obrázok S4

  3. 3.

    Doplnkový obrázok S5

videá

  1. 1.

    Supplementary Mov1

  2. 2.

    Supplementary Mov2

  3. 3.

    Supplementary Mov3

    Doplňujúce informácie sprevádzajú dokument na webovej stránke Oncogene (//www.nature.com/onc)