Náhodná mutagenéza hypertermofilného archeónu pyrococcus furiosus s použitím transpozície námornou cestou in vitro a prirodzenej transformácie | vedecké správy

Náhodná mutagenéza hypertermofilného archeónu pyrococcus furiosus s použitím transpozície námornou cestou in vitro a prirodzenej transformácie | vedecké správy

Anonim

predmety

  • Archaealská genetika
  • Archaeal gény

abstraktné

Transpozičná mutagenéza je mocným nástrojom na identifikáciu funkcie génov, odhalenie esenciálnych génov a všeobecne na odhalenie genetickej podstaty živých organizmov. Mutagenéza sprostredkovaná transpozónmi sa však úspešne uplatnila iba na obmedzený počet archaálnych druhov a nikdy nebola hlásená v termočlánkoch . Tu uvádzame náhodné inzerčné mutagenézy v hypertermofilnom archeológiu Pyrococcus furiosus . Stratégia využíva prirodzenú transformovateľnosť derivátov kmeňa COM1 kmeňa P. furiosus a transpozíciu založenú na Marineri in vitro . Transpozón nesúci genetický marker sa náhodne transponuje in vitro do genómovej DNA, ktorá sa potom používa na prirodzenú transformáciu P. furiosus. Reakcia transpozície v malom meradle bežne generuje niekoľko stoviek až dvetisíc transformantov. Južná analýza a sekvenovanie ukázali, že získané mutanty obsahujú jedinú a náhodnú inzerciu genómu. Polyploidia bola hlásená u Thermococcales a P. furiosus je podozrivý, že je polyploidný. Približne polovica mutantov získaných pri prvom výbere je však homozygotná pre inzerciu transpozónu. Na získanie génovej konverzie pôvodne heterozygotných mutantov postačili dve kolá izolácie na selektívnom médiu. Táto stratégia transpozičnej mutagenézy značne uľahčí funkčné skúmanie genómov Thermococcales .

úvod

Teraz je dobre známe, že Archaea predstavuje taxonomickú doménu odlišnú od baktérií, ich prokaryotického náprotivku. Najnovšia fylogenetická analýza dokonca naznačuje doménu Bacteria-Archaea, ktorá je doménou dvoch domén života, v ktorých eukaryoty našli svoj pôvod v oblasti Archaeal 1, 2 . Dokonca aj na začiatku objavenia Archaea ich fenotypové vlastnosti odlíšili od baktérií, zatiaľ čo naznačovali podobnosť s eukaryotmi. Skutočne sa zistilo, že Archaea je necitlivý na väčšinu liekov zameraných na 70S, ako je streptomycín, ale bol citlivý na lieky zacielené na 80S, ako je anisomycín 3 . Ďalšie štúdie potvrdili, že Archaea zdieľal mnoho funkcií s eukaryou, vrátane ich ribozomálnych proteínov 4 . Z praktického hľadiska sú izolované archaealné makromolekulárne systémy, ako je ribozóm, jednoduchšie a ľahšie študovateľné ako ich eukaryotické náprotivky. Archaea tak umožnila rýchlejšie pochopenie mnohých eukaryálnych procesov 4 . Archaea nie je ani zďaleka zjednodušujúce verzie eukaryotov, má veľmi jedinečné vlastnosti spojené s ich schopnosťou prosperovať pri extrémnych tlakoch pH, ​​teploty, slanosti a hydrostatických tlakoch. Tieto vlastnosti sú biologicky a biochemicky zaujímavé a Archaea robí jeden z najdôležitejších zdrojov pre biotechnologické a priemyselné aplikácie 5, 6 . Prístup k tomuto zdroju však zostáva ťažký aj vo veku genomiky. Archaálne genómy sú prevažne anotované zo znalosti bakteriálnych a eukaryálnych procesov. Výsledkom je vysoká frakcia génov, pre ktorú nie je možné priradiť biochemickú funkciu, a napríklad v niektorých rodinách, ako sú termokoky 7, 8, 9, môže prekročiť 60%.

Funkčné skúmanie archaálnych organizmov zostáva obmedzené nedostatkom vhodných genetických nástrojov. Toto je obzvlášť zrejmé u extrémofilov, ktorých extrémne rastové podmienky bránia použitiu genetických nástrojov vyvinutých v mezofilných organizmoch a tiež spôsobujú, že bežne používané selektívne činidlá sú neúčinné 10 . Objav prvých archaealných plazmidov umožnil prvý významný krok vo vývoji nástrojov pre archaealskú genetiku a do dnešného dňa je pre hlavné skupiny Archaea 11 k dispozícii niekoľko replikačných plazmidov, expresných vektorov a transformačných postupov. V súčasnosti je však dostupných len niekoľko metód na generovanie náhodnej mutagenézy a identifikáciu génov, ktoré sú predmetom záujmu v necharakterizovaných biologických procesoch pomocou genetických skríningov. K dnešnému dňu sú náhodné mutagenézy prístupné iba štyrom archaálnym druhom a všetky sú mezofilné druhy. Prvé dva systémy boli vyvinuté pre halofilný Haloarcula hispanica 12, 13 a metanogén Methanosarcina acetivorans 14 vytvorením natívnej inzerčnej sekvencie alebo hmyzieho transpozónu Mariner. Nedávno bol Methanococcus maripaludis , ďalší metanogén, mutagénovaný veľmi efektívne s použitím derivátu Tn5 transformáciou buniek zmesou transpozónu a transpozázy 15 . Posledný systém je založený na transpozícii Mu in vitro, po ktorej nasleduje chemická transformácia mutagénovaných fragmentov do stredne silného halofilného genómu Haloferax Volcanii 16 . Doteraz teda neexistuje žiadny náhodný prístup mutagenézy pre termofilnú archaea.

Transpozícia in vitro má veľký potenciál pre náhodnú mutagenézu najextrémnejšej archaea, pretože nevyžaduje, aby transpozón fungoval v druhoch, ktoré sa majú mutagenézovať. Dodávka DNA v archaea, ktorá sa spolieha na chemickú transformáciu, elektroporáciu, sféroplastovú transformáciu, lipozómy alebo konjugáciu s Escherichia coli, je však často veľmi neefektívna11. V dôsledku toho môže byť ťažké získať veľkú knižnicu mutantov. U niektorých archaálnych druhov je absorpcia DNA veľmi uľahčená schopnosťou spontánne absorbovať extracelulárnu DNA, čo umožňuje integráciu do genómu a následnú genetickú transformáciu. Táto prirodzená transformácia sa vyskytuje pri nízkych frekvenciách v metanogénoch 17, 18, acidofiloch 19 a v hypertermofiloch Thermococcus kodakarensis 20, T. barophilus 21 a Pyrococcus furiosus 22 . U tohto posledného druhu vykazuje geneticky sledovateľný variant s názvom COM1 pozoruhodnú prirodzenú kompetenciu, pričom transformačné frekvencie dosahujú 103 transformantov na μg DNA 22 . COM1 je tiež uracilový auxotrof v dôsledku delécie génu PF1114 ( ApyrF ) 22, 23, ktorý umožňuje účinný výber transformantov na selektívnom médiu bez uracilu, pri použití génu divokého typu PF1114 ako selekčného markera. Miestne špecifická integrácia uracilového prototropného markera sa môže získať, ak je jeho sekvencia synteticky lemovaná cieľovou sekvenciou. Táto stratégia sa vo veľkej miere využívala na generovanie inzerčných alebo delečných mutantov P. furiosus v jedinom kroku 22, 23, 24 . Výber prototrofie uracilu v kombinácii s účinnou prirodzenou transformáciou COM1 teda umožňuje získať cieľové mutanty vo veľkom počte. Pri náhodnom vložení markera uracilnej protofy do genómovej DNA mohla prirodzená transformovateľnosť COM1 s touto mutagénnou DNA generovať knižnice náhodných mutantov.

V tejto štúdii sme opísali vývoj prístupu k vytvoreniu náhodnej mutantnej knižnice pre transpozón pre Pyrococcus furiosus . Tento prístup kombinoval dva kroky: po prvé, in vitro transpozičná mutagenéza genomickej DNA P. furiosus s použitím systému založeného na námorných trasách na vytvorenie knižnice transpozónov vložených do náhodných miest DNA; a po druhé, prenos náhodne mutovaných lokusov na chromozóm P. furiosus prirodzenou transformáciou. Vysoké prirodzené frekvencie transformácie nám umožnili generovať knižnice niekoľkých tisíc mutantov P. furiosus . Je zaujímavé, že tento postup má potenciál prispôsobiť sa iným archaálnym druhom.

Výsledky a diskusia

Parametre ovplyvňujúce transformáciu a výber transformantov na pevnom médiu

Aby sa maximalizovala účinnosť konštrukcie náhodnej knižnice mutagenézy pre P. furiosus , najprv sme sa snažili optimalizovať podmienky, aby sa zvýšila účinnosť transformačných experimentov. Výber transformantov P. furiosus prirodzenou transformáciou vyžaduje rast na minimálnom pevnom médiu 22 . Toto definované minimálne médium je postihnuté relatívne nízkou účinnosťou pokovovania, pričom iba 20% buniek tvorí kolónie 25 . Toto minimálne definované médium obsahuje ako zdroje uhlíka cellobiózu a aminokyseliny a pri zvýšených teplotách môžu reagovať za vzniku Maillardových reakčných produktov, ktoré inhibujú archaálny rast26. Tvorba hnedých farebných Maillardových reakčných produktov je vysoko závislá od teploty. Po inkubácii skutočne dochádza k výraznej zmene farby rastového média. Čím vyššia je teplota, tým tmavšia farba a pomalší rast P. furiosus . Pretože P. furiosus môže rásť od 70 do 103 ° C 27, hodnotili sme účinnosť pokovovania pri 98 ° C v porovnaní s 80 ° C, čo je dostatočne nízka teplota na zníženie Maillardových reakčných produktov, ale stále dostatočná na umožnenie rastu P. furiosus , hoci pomalším tempom (čas zdvojnásobenia ~ 2 h oproti ~ 1 h). Hodnotili sme tiež tri rôzne spôsoby nanášania na platne: sklenené guľôčky, plastový rozptyľovač alebo priame nanášanie tekutých kultúr na platne. Techniky pokovovania majú obmedzený vplyv na účinnosť pokovovania pri 98 ° C a sú v rozsahu od 15% pri pokovovaní plastovým nanášačom do 25% pri pokovovaní sklenenými guľôčkami (obrázok 1A). Tieto relatívne nízke účinnosti pokovovania sú porovnateľné s predchádzajúcimi správami 22, 25, 28 . Na rozdiel od toho sme dosiahli účinnosť pokovovania až 82% inkubáciou doštičiek pri 80 ° C (obr. 1A) a roztieraním sklenenými guľôčkami. Pre každú metódu pokovovania sme pozorovali 3 až 4-násobné zlepšenie pri 80 ° C v porovnaní s inkubáciou pri vysokej teplote. Toto je ďalší dôkaz, že výskyt Maillardovej reakcie, ktorá je doložená zhnednutím rastového média, bude pravdepodobne zodpovedný za nízku účinnosť pokovovania na minimálnom médiu pri 98 ° C. V následných experimentoch sa pokovovanie uskutočňovalo použitím sklenených guľôčok alebo špinenia a inkubácia doštičiek pri 80 ° C. Potom sme vyhodnotili, či by prirodzené frekvencie transformácie mohli byť ovplyvnené abiotickými alebo biotickými parametrami, o ktorých je známe, že ovplyvňujú prirodzenú transformáciu v baktériách, napríklad pH a rastová fáza. Zistili sme, že transformačné frekvencie sa menili viac ako rádovo s hodnotou pH, s optimom pri pH 6, 2 až 6, 5 (obr. 1 B). Pre niektoré prirodzene kompetentné baktérie môže fáza rastu zohrávať pri prirodzenej transformácii veľkú úlohu; frekvencie transformácie P. furiosus však neboli závislé od fázy rastu (obr. 1C). Takže maximálny počet transformantov P. furiosus COM1 sa môže získať transformáciou kultúr stacionárnej fázy cez noc, selekciou na doštičkách pri pH 6, 5 a inkubáciou pri 80 ° C. Všetky experimenty uvedené ďalej boli uskutočnené s použitím týchto podmienok.

Image

( A ) Účinnosť nanášania povlakov pomocou sklenených guľôčok, plastového nanášacieho zariadenia a nanášania škvŕn pri dvoch inkubačných teplotách (80 ° C a 98 ° C). Chybové stĺpce označujú štandardnú odchýlku od priemeru troch nezávislých experimentov. ( B ) Transformačné frekvencie ako funkcia pH pomocou priľahlých oblastí 1500 bp. Transformačné reakcie obsahovali 2 μg DNA na 1 ml kultúry. 100 ul alebo 200 ul bunkovej kultúry ( 108 buniek / ml) sa zmiešalo s 200 ng alebo 400 ng DNA. Frekvencie transformácie sa vypočítajú ako pomer CFU na selektívnom médiu (bez uracilu) vydelený CFU na neselektívnom médiu (s uracilom) na μg DNA. Chybové stĺpce predstavujú štandardnú odchýlku od priemeru ôsmich nezávislých experimentov. ( C ) Transformačné frekvencie ako funkcia fázy rastu. Rast sa monitoroval každé dve hodiny počas 24 hodín. Bunky zozbierané z kultúry v čase zodpovedajúcom exponenciálnemu rastu (4 h), strednému logu (8 h), postexponenciálnemu (12 h) a stacionárnej fáze (24 h) sa použili na transformáciu za rovnakých podmienok ako na paneli B Chyby predstavujú štandardnú odchýlku od priemeru troch technických replík. ( D ) Transformačné frekvencie ako funkcia veľkosti homológnych hraničných oblastí. Frekvencie boli normalizované podľa počtu kópií génu pyrF . Chybové stĺpce označujú štandardnú odchýlku od priemeru piatich nezávislých experimentov.

Obrázok v plnej veľkosti

Genomická DNA je najúčinnejšou molekulou pre transformáciu P. furiosus

Kmeň P. furiosus COM1 je prirodzene kompetentný na príjem genomickej, cirkulárnej a lineárnej DNA 22, 23 . Účinnosť rekombinácie v P. furiosus COM1 umožňuje transformáciu s génom pyrF s veľmi krátkymi homológnymi oblasťami, malými ako 40 bp23 . Dlhšie homologické oblasti do 1 kb zvýšili počet získaných transformantov o tri rády 23 . Na vytvorenie veľkého počtu náhodných mutantov bolo rozhodujúce určiť typ a veľkosť molekuly DNA, ktorá bola najúčinnejšia v pokusoch transformácie. Táto molekula DNA sa následne stane terčom náhodnej mutagenézy in vitro . Aby sme to dosiahli , porovnali sme účinnosť génu pyrF , buď prenášaného na produkty PCR alebo na genomickej DNA (gDNA), aby sme vytvorili transformanty doplnením delécie pyrF v COM1. Na produktoch PCR sme menili veľkosť homológnych oblastí lemujúcich selektovateľný marker pyrF od 500 bp do 3 kb. Dĺžka týchto homológnych oblastí je maximálna, keď je pyrF nesený na gDNA. Ako sa očakávalo z literatúry, počet transformantov získaných s produktmi PCR sa zvyšoval s dĺžkou homológie a dosiahol niekoľko tisíc transformantov s iba 200 ng DNA zmiešanou so 100 μl bunkovej suspenzie (~ 107 buniek). Je zaujímavé, že najlepšie transformačné frekvencie sa získali pomocou gDNA (obr. 1D), čo nám umožňuje generovať niekoľko tisíc mutantov na μg gDNA. Účinná transformácia buniek P. furiosus pomocou gDNA je ďalšou indikáciou toho, že DNA je skutočne absorbovaná a integrovaná do genómu pomocou aktívneho procesu prirodzenej transformácie. Ďalej naznačuje, že gDNA predstavuje najlepší substrát pre in vitro náhodnú mutagenézu tohto druhu.

Transpozícia genómovej DNA in vitro a transformácia v P. furiosus .

Prirodzená transformovateľnosť P. furiosus genómovou DNA ponúka možnosť implementovať in vitro stratégiu náhodnej transpozónovej mutagenézy, ako už bolo opísané pre prirodzene transformovateľné baktérie 29, 30 . V tejto stratégii je genómová DNA podrobená in vitro transpozónovej mutagenéze s hyperaktívnou formou námornej Himar1 transpozázy (MarC9) 31 a vhodným mini-transpozónom. Mutagenizovaná gDNA je opravená a použitá na transformáciu prirodzene kompetentných druhov (obr. 2A). Na implementáciu tejto stratégie v P. furiosus sme skonštruovali vektor obsahujúci transpozón ( pNG -Tn- pyrF ) s voliteľným markerom ( Pgdh-pyrF ) ohraničeným dvoma invertovanými tandemovými opakovacími sekvenciami (IRL, IRR) špecifickými pre transpozázu MarC9 Himar1 (Obr. 2A a Doplnkový obr. S1). Aby sa zaistilo, že vloženie transpozónu účinne naruší otvorený čítací rámec, pridali sa k invertovaným opakovaniam stop kodóny vo všetkých možných čítacích rámcoch. Transpozón obsahuje kópiu génu pyrF divokého typu pod transkripčnou kontrolou promótora glutamát dehydrogenázy ( gdh ; PF1602) s krátkou terminátorovou sekvenciou (T1) z génu hpyA1 na 3 'konci génu 22, 23 (Obr. 2A). Hyperaktívna MarC9 Himar1 transpozáza rozpoznáva miesta IRL a IRR a transponuje intervenujúcu DNA pomocou mechanizmu cut-and-paste do cieľovej DNA v miestach TA 32 . Pri inkubácii s plazmidom pNG -Tn- pyrF obsahujúcim transpozón transponáza vyreže transpozón, vynechá hlavný reťazec plazmidu a náhodne ho transponuje do dodanej gDNA (obr. 2B). Transpozičná udalosť zanecháva jednovláknové medzery v každom spojení transpozón-chromozóm a tie sa opravujú pomocou T4 DNA polymerázy a E. coli DNA ligázy (obr. 2A, B). Na účely tejto prihlášky bolo dôležité použiť cieľovú genómovú DNA izolovanú z uracilového auxotrofného kmeňa P. furiosus, ktorému chýbalo pyrF marker použitý v transpozóne. Ďalej, aby sa umožnilo použitie výslednej knižnice na ďalšie následné aplikácie, ktoré by mohli vyžadovať druhý genetický marker, rozhodli sme sa použiť kmeň P. furiosus JFW002, ktorý je tiež tryptofánovým auxotrofom, ktorý obsahuje deléciu v biosyntetických génoch tryptofánu ( trpAB ) 23 . Genomová DNA JFW002 ( COM1ApyrF A trpAB ) sa transponovala in vitro s použitím plazmidu pNG -Tn- pyrF obsahujúceho transpozón a purifikovanej MarC9 Himar1 Mariner transposázy (obrázok 2B). Transponovaná genómová DNA sa potom použila na transformáciu buniek JFW002 s použitím uracilovej prototrofie na výber pyrF markeru. V porovnaní s genomickou DNA, ktorá nesie pyrF na svojom pôvodnom mieste, transpozón-mutagénovaná genómová DNA s náhodne vloženým pyrF poskytla transformanty s iba mierne nižšou frekvenciou transformácie (obr. 2C). Jeden transformačný experiment s použitím 2 až 4 ml kultúry a 2 až 4 μg transponovanej DNA generoval od 700 do 2400 transformantov (obr. 2D). Kombináciou štyroch experimentov sme získali knižnicu asi 5000 mutantov. P. furiosus tak môže byť účinne a reprodukovateľne transformovaný genómovou DNA, ktorá bola podrobená in vitro transpozónom sprostredkovanej mutagenéze.

Image

( A ) Všeobecná stratégia na vytvorenie mutantnej knižnice P. furiosus pomocou transpozičnej mutagenézy in vitro . Transpozáza MarC9 (tmavo zelené krúžky) rozpoznáva miesta IRL / IRR (v červenej farbe) na hraniciach kazety P gdh-pyrF (nesené plazmidom pNG -Tn- pyrF ) a transponuje ju mechanizmom cut-and-paste do genómová DNA (gDNA). Transponovaná gDNA sa opraví pomocou T4 DNA polymerázy a E. coli DNA ligázy a použije sa na transformáciu uracilu a trytofánového auxotrofu JFW02. ( B ) Elektroforéza agarózového gélu in vitro transpozičnej reakcie. Dráha 1, samotný plazmidový donor transpozónu pGN-Tn-pyrF; dráha 2, genomická DNA kmeňa JFW002 samotná; dráha 3, transpozičná reakcia obsahujúca genómovú DNA, donorový plazmid pGN-Tn-pyrF a MarC9 transposáza. Vyrezanie transpozónu z plazmidu pNG -Tn- pyrF, ktorý je donorom transpozónu, sa môže preukázať výskytom pruhu vo veľkosti lineárneho plazmidu bez transpozónu (N, nicked plazmid; L, lineárny plazmid; B, kostra plazmidu s transpozón bol vyrezaný; SC, supercoiled plazmid). (C ) Transformačné frekvencie P. furiosus JFW002 transformované in vitro transponovanou gDNA. Chybové stĺpce predstavujú štandardnú odchýlku od priemeru štyroch nezávislých experimentov. ( D ) Príklad transformačnej reakcie s gDNA nanesenou na selektívnu platňu minimálneho média a inkubovanú 5 dní pri 80 ° C.

Obrázok v plnej veľkosti

Prirodzená transformácia P. furiosus mutantizovanou genómovou DNA in vitro generuje mutanty náhodného inzercie

Za účelom skúmania povahy a dynamiky transpozónových inzercií sme vyčistili 12 mutantov a pomocou PCR amplifikácie sme potvrdili prítomnosť kazety Pgdh-pyrF . Na overenie prítomnosti a počtu kópií transpozónu sa tieto mutanty analyzovali Southern hybridizáciou s použitím sondy špecifickej pre transpozón (obr. 3A). Jeden dominantný fragment bol detegovaný vo všetkých izolátoch, čo naznačuje, že každý obsahoval jedinečnú inzerciu transpozónu. Okrem toho každý z 12 testovaných mutantov predstavoval špecifickú veľkosť hybridizačného fragmentu, čo naznačuje náhodnú transpozíciu do genómu P. furiosus JFW02 (obr. 3A). Miesta transpozónovej inzercie boli identifikované pomocou PCR kolónie s jedným primérom. Zistili sme, že všetky inzerčné udalosti sa vyskytovali v TA miestach a ich poloha sa nachádza v celom genóme P. furiosus JFW02 (obr. 3B). Vo všetkých 12 skúmaných mutantoch transpozón prerušil otvorený čítací rámec naznačujúci nepodstatnú povahu zodpovedajúcich génov (tabuľka 1 a doplnkový obrázok S2).

Image

( A ) Southern blot analýza 12 izolovaných a purifikovaných mutantov sondovaných génom pyrF . Dráhy 1 - 12: purifikované náhodne vybrané mutanty inzercie transpozónu; pNG -Tn- pyrF : pozitívna kontrola; JFW002: negatívna kontrola. ( B ) COM1 distribúcia genómu transpozónových inzercií. Génové mená (PFxxxx) podľa génovej nomenklatúry pre P. furiosus DSM 3638. ( C ) Typická dynamika génovej konverzie transpozónových inzercií monitorovaných pomocou PCR (známa inzercia). Kvôli meroploidii nemusia všetky genómy mutantných buniek obsahovať mutovanú alelu (červená šípka, mutovaná alela; zelená šípka, alela divokého typu). Konverzia môže vyžadovať až tri za sebou nasledujúce subkultúry v kvapalnom selektívnom médiu. ( D ) Konverzná dynamika skupiny mutantov stanovená nanesením na minimálne médium s uracilom alebo bez neho. Mutanty, v ktorých je génová konverzia neúplná, by mohli po nanesení na neselektívne médium (ura +) vytvárať uracil-auxotrofné potomstvo. Pomer 100% ura + CFU a ura - CFU naznačuje, že všetky kópie buniek genómu obsahujú transpozón pyrF .

Obrázok v plnej veľkosti

Tabuľka v plnej veľkosti

Polyploidia bola navrhnutá ako spoločný znak celej Euryarchaeoty 34 . Počet kópií chromozómov u člena rodiny Thermococcales T. kodakarensis bol stanovený v rozsahu od 9 do 17 kópií 35 . Počet kópií genómu nebol experimentálne stanovený na P. furiosus , ale ako druh úzko príbuzný s T. kodakarensis sme predpokladali, že P. furiosus bude tiež polyploidný. Prirodzená transformácia P. furiosus s náhodne transponovanou DNA teda môže spočiatku generovať merodiploidnú situáciu, keď je jedna kópia génu inaktivovaná, zatiaľ čo ostatné alely zostávajú divého typu. Počas prvých niekoľkých generácií buniek po transformácii s transponovanou DNA môže dôjsť k génovej konverzii, ak sa udržiava selekčný tlak, čo vedie k jednej mutovanej alele vo všetkých chromozomálnych kópiách. Skúmali sme dynamiku génovej konverzie po počiatočnej izolácii transpozičných mutantov na selektívnom médiu. Pomocou PCR analýzy sme zistili, že 6 z 12 testovaných mutantov už vykazovalo iba mutovanú alelu v počiatočnom štádiu kolónie. Pre zostávajúce mutanty postačovali na dosiahnutie génovej konverzie dve až tri pasáže v selektívnom kvapalnom médiu (obr. 3C). Je zaujímavé, že mutanty, v ktorých je génová konverzia neúplná, by mohli po nanesení na neselektívne médium generovať uracil-auxotrofné potomstvo. Tento fenotyp sme použili na vyhodnotenie génovej konverzie skupiny mutantov, ktorú nemožno vyhodnotiť technikami založenými na PCR, ktoré sa používajú pre izolované mutanty, a zistili sme, že tri pasáže v tekutom selektívnom médiu stačili na zvýšenie percentuálneho podielu buniek, ktoré nie sú schopné generovať uracil- auxotrofné potomstvo od 60% do takmer 100% (Obr. 3D). To je v súlade s mierami premeny pozorovanými u iných archaálnych druhov 34, 36, 37, 38 .

závery

Uvádzame tu, že vysoko efektívnu prírodnú kompetenciu hypertermofilného archeologického nálezu P. furiosus možno využiť na ľahké a rýchle získanie tisícov mutantov na generovanie náhodnej knižnice mutantov. Počet získaných mutantov závisí od účinnosti pokovovania a od parametrov zvyšujúcich účinnosť prirodzenej transformácie, ako je inkubačná teplota a pH. Táto technika by mala umožniť vytvorenie usporiadaného súboru inzerčných mutantov. V kombinácii s fenotypovým skríningom umožní efektívna náhodná mutagenéza v P. furiosus identifikáciu nových dráh a špecifických funkcií, ako to bolo už niekoľko desaťročí v baktériách Bacteria a Eucarya. Prípadne by rozšírenie protokolu umožnilo vytvorenie saturačnej knižnice inzerčnej mutagenézy, ktorá by sa mohla použiť na definovanie esenciálnych a neesenciálnych génov P. furiosus . Okrem toho by sa tu uvedená metóda mohla použiť na iné archaálne druhy, iba s jedným obmedzením, napr. Existencia účinného transformačného protokolu. Prirodzená transformácia predstavuje niekoľko výhod, pretože nevyžaduje chemickú alebo fyzikálnu zmenu buniek a je účinná pri intaktnej gDNA s vysokou molekulovou hmotnosťou. Avšak u druhov, ktoré neabsorbujú účinne gDNA prirodzene, mutagenéza in vitro by sa mohla uskutočniť aj na fragmentovanej gDNA a potom dodaná do buniek pomocou iných spôsobov transformácie.

Materiály a metódy

Kmene, médiá a podmienky rastu

Kmene použité v tejto štúdii sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1. Plazmidy použité v tejto štúdii sú uvedené v doplnkovej tabuľke S2. Kmeňy boli pestované anaeróbne v definovanom médiu s cellobiózou 25 ako zdrojom uhlíka a doplnené 20 uM uracilu pre kmene COM1 a JFW002 22 . Médium bolo pripravené ako bolo opísané skôr. Kvapalné kultúry boli naočkované 1 až 2% inokulom alebo jednou kolóniou v 5 až 50 ml média v 50 až 100 ml fľašiach séra odplynených tromi cyklami vákua a dusíka, znížené pridaním Na2S (0, 1% konečne) koncentrácia) a inkubované pri 98 ° C. Tuhé médium sa pripravilo zmiešaním ako 50:50 kvapalného média pri 2X koncentrácii s 1, 6% (hmot./obj.) Gelrite® (SERVA) solubilizovaným varom vo vode; obidva roztoky sa udržiavali pri 95 ° C tesne pred zmiešaním. Médium bolo naliate do sklenených Petriho misiek ihneď po zmiešaní. Doštičky sa naliali a naočkovali aeróbne a potom sa vložili do anaeróbnych nádob z nehrdzavejúcej ocele (Schuett Biotec) s jedným vreckom Gaspak® EZ Anaerobe (Becton Dickinson and Company, USA). Tieto vrecká vytvárajú anaeróbne podmienky v nádobe elimináciou 02 za menej ako 2 hodiny a produkciou CO2 za menej ako 24 hodín. Nádoby sa inkubovali 4 dni pri 98 ° C alebo 6 dní pri 80 ° C. Aby sa otestoval vplyv pH na frekvenciu transformácie, pripravilo sa definované médium s celobiózou pri 2X koncentrácii zmiešaním všetkých zložiek a úpravou na uvedené pH pomocou 1 M NaOH alebo 1 M HCI. Purifikácia medziproduktov sa uskutočnila nanesením 10-3 riedení transformovaných kultúr na selektívne doštičkové médium (bez uracilu) a odobratím izolovaných kolónií do selektívneho kvapalného média.

Účinnosť pokovovania

Hustota nočných kultúr P. furiosus bola stanovená počítaním v počítacej komore Thoma. Na odhadnutie účinnosti nanášania na platne a životaschopnosti buniek sa riedenia 10-3, 10-4 a 10-5 počiatočnej kultúry naniesli na platne pomocou plastového rozmetávača alebo sklenených guľôčok alebo nanesením 10 ul riedenia. Účinnosť nanášania bola vypočítaná ako pomer počtu kolónií pozorovaných na doštičkách k celkovému počtu buniek stanovený počítaním v Thoma komore.

Transformácia P. furiosus COM1

Na prirodzenú transformáciu sa alikvóty kultúry P. furiosus , typicky pestované do fázy strednej logaritmickej fázy (~ 108 buniek / ml, stanovené počítaním v počítacej komore Thoma) v definovanom tekutom médiu pri pH 6, 5 (s výnimkou experimentu na obr. 1B, kde boli testované rôzne pH), boli zmiešané s DNA, aby sa získala konečná koncentrácia 2 μg / ml, ako bolo opísané skôr 22 . Rutinne sme použili 100 μl alebo 200 μl bunkovej kultúry ( 108 buniek / ml) zmiešanej s 200 ng alebo 400 ng DNA. Zmesi boli nanesené na selektívne tuhé médium bez uracilu s použitím sklenených guľôčok. Desaťnásobné sériové riedenia sa pripravili v 1X bázických soliach 22 a naniesli sa na selektívne (s použitím riedení 10-1 a 10-2 ) a neselektívnych doštičiek (s použitím riedení 10-3, 10-4 a 10 -5 ) na výpočet frekvencií transformácie. Doštičky sa umiestnili prevrátené do anaeróbnych pohárov a inkubovali sa pri 80 ° C počas 5–6 dní alebo pri 98 ° C počas 3–4 dní. Frekvencia transformácie bola vypočítaná ako pomer počtu CFU počítaných na selektívnom médiu (bez uracilu) vydelený počtom CFU počítaných na neselektívnom médiu (s uracilom). Konštrukty DNA použité ako substráty pre prirodzenú transformáciu sa vyrábali PCR amplifikáciou génu pyrF z gDNA divého typu s použitím rôznych dĺžok homologických oblastí v rozsahu od 500 bp do 3 000 bp, amplifikovaných s použitím nasledujúcich súborov primérov: pyrF_500F / pyrF_500R, pyrF_1000F / pyrF_1000R, GL061 / GL062 22, pyrF_2000F / pyrF_2000R, pyrF_3000F / pyrF_3000R (doplnková tabuľka S3).

Izolácia genómovej DNA

Bunky z 2 ml kultúry P. furiosus cez noc boli pozbierané a suspendované v 100 ul pufra A (25% sacharóza, 50 mM Tris-HCI, 40 mM EDTA, pH 7, 4). Potom sa pridalo 250 ul 6 M guanidínium HCl-20 mM Tris, pH 8, 5 a zmesi sa inkubovali pri 70 ° C počas 5 minút. Genomická DNA bola extrahovaná zmesou fenol-chloroform-izoamylalkohol (25: 24: 1; pufrovaná pri pH 8), vyzrážaná etanolom a suspendovaná v 50 ul 10 mM Tris pufra, pH 8, 0. Alternatívne bola genómová DNA purifikovaná z 5 ml kultúry cez noc pomocou súpravy Promega Wizard® Genomic DNA Purification Kit podľa pokynov výrobcu.

Konštrukcia pNG -Tn- pyrF , plazmidu s transpozónom pre transpozíciu in vitro .

Kazeta P gdh-pyrF , obsahujúca 283-bp časť intergénnej oblasti upstream od gdh (PF1602) spojenú s génom pyrF a terminátor T1 z histónového génu hpyA1 (PF1722), bola amplifikovaná z plazmidovej DNA pJFW070 23 pomocou primérov Tn_pyrF_for (obsahujúcich IRL sekvencia a sekvencia nesúca stop kodóny vo všetkých 6 možných čítacích rámcoch) a Tn_pyrF_rev (obsahujúca IRR sekvenciu a sekvencia nesúca stop kodóny vo všetkých 6 možných čítacích rámcoch). Produkt PCR bol purifikovaný a klonovaný do vektora pJET1.2 / tupý pomocou klonovacej súpravy CloneJET PCR podľa pokynov výrobcu (Thermo Scientific, # K1231). Výsledný plazmid, pomenovaný pNG -Tn- pyrF , sa použil na transpozíciu in vitro . Bunky E. coli DH5a boli transformované chemickou transformáciou. Plazmidová DNA bola izolovaná z tekutých kultúr pomocou QIAprep spinových minipreparačných kolón (Qiagen). Plazmidové konštrukty sa potvrdili reštrikčnou analýzou a Sangerovým sekvencovaním. Úplná sekvencia pNG -Tn- pyrF je k dispozícii na požiadanie.

MarC9 transpozáza purifikácia a in vitro transpozícia genómu DNA P. furiosus

Transponáza MarC9 bola purifikovaná podľa skôr publikovanej metódy 39 . Stručne, kmeň E. coli DH5a A pir nesúci plazmid kódujúci indukovateľný gén kódujúci MarC9 (hyperaktívna Mariner transpozáza) fúzovaný s proteínom viažucim maltózu (MBP) sa kultivoval v LB a nadmerná expresia MBP-MarC9 sa indukovala pre 2 hodiny pridaním IPTG (izopropyl-p-D-1-tiogalaktopyranozidu) počas exponenciálnej fázy. Bunky sa lyžovali sonikáciou a lyzát sa naniesol na kolónu s amylózovou živicou. MBP-MarC9 sa eluoval pridaním tlmivého roztoku obsahujúceho maltózu, rozdelil sa na alikvóty a uložil sa pri -80 ° C. Typickým čistením sa získalo 100 ug purifikovaného MBP-MarC9 pri koncentrácii 500 ug / ml. Transpozičné reakcie sa tiež uskutočňovali, ako je opísané, s malými modifikáciami 31, 39, 40 . Transpozičné reakcie sa uskutočňovali v tlmivom roztoku obsahujúcom 10% glycerolu, 25 mM HEPES pH 7, 9, 250 μg purifikovaného a tepelne inaktivovaného hovädzieho sérového albumínu, 2 mM DTT, 100 mM NaCI a 5 mM MgCI2. Optimálna koncentrácia MarC9 pre reakciu sa stanovila empiricky uskutočňovaním transpozičných reakcií s 1 μg genómovej DNA, 1 μg plazmidu pNG -Tn- pyrF a rozsahom dvojnásobne sa zvyšujúcich koncentrácií transpozázy, po čom nasledovali 2 hodiny inkubácie pri 30 ° C. ° C. Reakčné produkty sa separovali gélovou elektroforézou a vizualizovali sa sfarbením etídiumbromidom. Aktivita transpozázy sa môže hodnotiť analýzou konverzie plazmidu z formy supercoilu na tri ďalšie formy: nicked (jedna alebo obidve IRs rozrezané na jednom vlákne), lineárna (break s dvoma vláknami v jednom IR) a skrátená lineárna ( IR zárezy aj úplne excidovaný transpozón) (obr. 2B). Pozorovanie týchto troch foriem už bolo opísané a dlhšie inkubačné obdobie nemenilo ich relatívne množstvo. Vysoké koncentrácie transpozázy nezlepšujú množstvo plazmidových kostrových reťazcov s úplne vyrezaným transpozónom, ale indukujú zjavnú degradáciu gDNA, pravdepodobne z dôvodu nešpecifickej aktivity transpozázy na miestach podobných IR v chromozóme. Na rozdiel od protokolov na purifikáciu natívnej MarC9 transpozázy z inklúznych teliesok 40 sa pri vyčistenom MBP-MarC9 nepozorovala žiadna kontaminujúca aktivita nukleázy.

Transpozícia genómovej DNA na prirodzenú transformáciu sa uskutočnila na 10 μg plazmidu a 10 μg gDNA. Objemy pufra a transpozázy boli príslušne upravené. Po transpozícii bola reakcia inaktivovaná zahrievaním na 75 ° C počas 10 minút, potom bola DNA purifikovaná extrakciou fenol-chloroformom a zrážaním etanolom. Transpozičné spojenia v DNA boli opravené, ako už bolo opísané, vyplnením spojení s T4 DNA polymerázou a opravou nicku s DNA ligázou E. coli .

Transformácia P. furiosus s transpozónovou mutagénnou DNA

Transponovaná a opravená DNA sa použila na prirodzenú transformáciu v kmeni P. furiosus JFW002. Kultúra cez noc sa pestovala na ~ 108 buniek / ml (stanovené počítaním v komore na počítanie Thoma) v minimálnom tekutom médiu s uracilom. 2 až 4 ml kultúry sa ochladili na ľade a odstreďovali sa pri 4000 ot./min. Počas 10 minút. Bunková peleta sa resuspendovala v 100 - 200 μl 1X bázických solí (1/20 pôvodného objemu kultúry). Bunková suspenzia sa zmiešala s transponovanou DNA v pomere 1 μg DNA na 108 buniek. V každom transformačnom experimente sa použilo približne 2 až 4 μg DNA. Zmesi boli nanesené na selektívne tuhé médium bez uracilu s použitím 100 ul zmesi na platňu so sklenenými guľôčkami.

Southern-blot analýza transpozičných mutantov

Približne 1 μg gDNA sa štiepil reštrikčným enzýmom Hind III (Thermo Scientific) a rozdelil sa na 0, 8% agarózovom géli po dobu 1 hodiny pri 80 V. Genomické DNA fragmenty sa preniesli z gélu na membránu Hybond-N + (Amersham) s použitím alkalický kapilárny prenos. Membrána sa blokovala 1 hodinu pri 42 ° C v ECL Gold Hybridization Buffer (Amersham) doplnenom 0, 5 M NaCl a 5% (hm./obj.) Jednoreťazcovej spermatickej DNA z lososa. Hybridizácia sa uskutočňovala pri 42 ° C cez noc v ECL Gold Hybridization Buffer, hybridizačná sonda sa označila pomocou súpravy ECL Direct Labelling and Detection System kit (Amersham). Premývanie, označovanie a detekcia sa uskutočňovali podľa pokynov výrobcu pomocou súpravy ECL Direct Labelling and Detection System kit (Amersham). Sonda bola produkovaná pomocou PCR plazmidovej DNA pNG -Tn- pyrF použitím primérov pyrF-1_F a pyrF-2_R (doplnková tabuľka S3).

Identifikácia transpozičných inzertných miest

Amplifikácia PCR na potvrdenie prítomnosti transpozónovej inzercie sa uskutočňovala s použitím primérov pyrF_1_F a pyrF_2_R (doplnková tabuľka S3). Na identifikáciu miest transpozónovej inzercie 33 bola použitá PCR s jedným primérom. PCR sa uskutočňovala nasledovne: počiatočná denaturácia genómovej DNA testovaných mutantov (98 ° C, 5 minút), 20 cyklov s vysokou prísnosťou (98 ° C, 10 s; 50 ° C, 30 s; 72 ° C, 90 s), 30 cyklov s nízkou prísnosťou (98 ° C, 10 s; 30 ° C, 30 s; 72 ° C, 90 s) a 30 cyklov s vysokou prísnosťou (98 ° C, 10 s; 50 ° C, 30 s; 72 ° C, 90 sekúnd), nasledovalo konečné predĺženie pri 72 ° C počas 7 minút. Primer pyrF _P1 (doplnková tabuľka S3) je navrhnutý tak, aby hybridizoval 118 párov báz v protismere od obrátenej tandemovej repetície (ITR). Potom sa uskutoční druhé kolo PCR s použitím desaťnásobného riedenia a vyššie uvedenej reakcie PCR s primérom pyrF_P2 (doplnková tabuľka S3), ktorá hybridizuje 20 párov za pyrF_P1. Táto PCR reakcia bola odoslaná na Sangerove sekvenovanie (GATC-biotech, Germany) s použitím primeru pyrF_seq.

Ďalšie informácie

Ako citovať tento článok : Guschinskaya, N. et al . Náhodná mutagenéza hypertermofilného archeologického nálezu Pyrococcus furiosus pomocou transpozície námornou cestou in vitro a prirodzenej transformácie. Sci. Rep. 6, 36711; doi: 10, 1038 / srep36711 (2016).

Poznámka vydavateľa: Springer Nature zostáva neutrálny, pokiaľ ide o nároky na jurisdikciu v uverejnených mapách a inštitucionálne pridruženie.

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplnková informácia

Komentáre

Odoslaním komentára súhlasíte s tým, že budete dodržiavať naše zmluvné podmienky a pokyny pre komunitu. Ak zistíte, že je niečo urážlivé alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte ho ako nevhodné.