Mikrorna-20a spojená s nádorom vaječníkov znižuje prirodzenú cytotoxicitu vražedných buniek znižovaním expresie sľudy / b | bunková a molekulárna imunológia

Mikrorna-20a spojená s nádorom vaječníkov znižuje prirodzenú cytotoxicitu vražedných buniek znižovaním expresie sľudy / b | bunková a molekulárna imunológia

Anonim

abstraktné

MikroRNA (miRNA) sú skupinou malých nekódujúcich regulačných RNA a zmeny v miRNA sa podieľajú na vzniku a progresii nádoru. Štúdie ukázali, že miR-20a je nadmerne exprimovaný v ľudských tkanivách rakoviny vaječníkov a že táto miRNA zvyšuje schopnosť dlhodobej bunkovej proliferácie a invázie. V tejto štúdii sa pozorovala pozitívna korelácia medzi expresiou miR-20a v sére a štádiom rakoviny vaječníkov. Zistili sme, že miR-20a sa viaže priamo na 3'-neprekladanú oblasť mRNA MICA / B, čo vedie k jeho degradácii a zníženiu hladín proteínu na plazmovej membráne. Redukcia membránovo viazaných proteínov MICA / B, ktoré sú ligandmi D (NKG2D) receptora prírodného zabijača skupiny 2 (NKG2D), ktorý sa nachádza na bunkách prirodzeného zabíjača (NK), yδ + T bunkách a CD8 + T bunkách, umožňuje nádorovým bunkám vyhnúť sa imunite - sprostredkované zabíjanie. Pozoruhodné je, že antagonizujúci účinok miR-20a zlepšil zabíjanie nádorových buniek sprostredkované NKG2D v modeloch nádorov in vitro aj in vivo . Celkovo naše dáta naznačujú, že zvýšené hladiny miR-20a v nádorových bunkách môžu nepriamo potlačiť cytotoxicitu NK buniek znížením expresie MICA / B. Tieto údaje poskytujú potenciálne spojenie medzi schopnosťou metastázovania a imunitným únikom nádorových buniek z NK buniek.

úvod

Molekuly A a B súvisiace s reťazcom MHC I. triedy (MICA a MICB, ďalej spoločne označované ako MICA / B) sú široko exprimované v epitelových nádorových bunkách a sú rozpoznávané y5 + T bunkami, CD8 + T bunkami a prírodnými zabíjačskými bunkami (NK). prostredníctvom receptora D (NKG2D) člena NK skupiny 2. Dráha NKG2D – MICA / B hrá hlavnú úlohu pri imunitnom dohľade pri identifikácii zhubných buniek. 1, 2, 3 Ligandy MICA / B a ich aktivačný receptor NKG2D hrajú dôležitú úlohu v imunitných odpovediach na nádory sprostredkovaných NK, y5 + a CD8 + T-bunkami. 4, 5 Tieto ligandy sú typicky indukované antigénom 6 spojeným s nádorom a hypoxickým stresom bežne spojeným s rakovinou. Rakovinové bunky sú však schopné redukovať hladiny týchto povrchových ligandov tým, že indukujú ich down-reguláciu a / alebo internalizáciu 8 a tým, že im spôsobujú vylučovanie ich extracelulárnych domén, čím bránia detekcii imunitnými bunkami. 9, 10 V poslednej dobe bola mRNA MICA / B detekovaná v normálnych zdravých ľudských tkanivách 11, 12 a u dospelých a normálnych embryonálnych myší. Toto zistenie naznačuje, že môžu existovať určité post-transkripčné mechanizmy na zabránenie translácie týchto mRNA u zdravých jedincov, pravdepodobne preto, aby sa predišlo autoimunite.

MikroRNA (miRNA) sú zhlukom malých nekódujúcich RNA, ktoré majú veľkosť približne 22 nukleotidov. miRNAs po transkripcii regulujú expresiu cieľovej mRNA rozpoznávaním komplementárnych miest v 3'-netranslatovanej oblasti (UTR) cieľovej mRNA, čím stimulujú autonómnu degradáciu cieľovej mRNA. Zvyšujúci sa dôkaz naznačuje, že miRNA sa pri rakovinách často menia, a preto sa predpokladá, že hrajú dôležitú úlohu pri tvorbe a vývoji nádorov. Veľké úsilie sa venovalo štúdiu klinického významu miRNA v klinických vzorkách, ako je napríklad sérum, ako potenciálnych diagnostických biomarkerov rakoviny. Predchádzajúce štúdie ukázali, že miR-20a je v ťažkých karcinómoch vaječníkov upregulovaný v porovnaní s normálnymi ovariálnymi tkanivami a že hladiny expresie miR-20a korelujú s prežitím u pacientov so závažnými karcinómami vaječníkov. 15, 16 Tieto údaje nás viedli k otázke, či miR-20a prispieva k post-transkripčnej regulácii expresie MICA / B a imunitnému úniku buniek karcinómu vaječníkov.

V tejto štúdii sme našli pozitívnu koreláciu medzi hladinou sérového miR-20a a štádiom rakoviny vaječníkov. Ďalej sme študovali účinok miR-20a na reguláciu expresie MICA / B pomocou bunkovej línie rakoviny vaječníkov SKOV3. Zistili sme, že miR-20a inhibuje expresiu MICA / B interakciou s 3'-UTR MICA / B. Ďalej sme ukázali, že nadmerná expresia miR-20a inhibovala expresiu MICA / B a NK cytotoxicitu in vivo . Dáta prezentované v tejto štúdii spolu ďalej chápu, ako môže expresia miR-20a modulovať molekulárne mechanizmy, ktoré sú základom imunitného úniku rakoviny vaječníkov.

výsledok

Zvýšená expresia miR-20a v sére pacientov s rakovinou vaječníkov koreluje s progresiou ochorenia.

Predchádzajúce štúdie využívajúce miRNA mikročipy odhalili, že hladiny miR-200a, miR-141, miR-16, miR-200b, miR-200c a miR-20a sú zvýšené (viac ako dvojnásobne), zatiaľ čo hladiny miR-100 sú nižšie u pacientov s rakovinou vaječníkov. ako pri zdravých kontrolách. 15, 16 Uvádza sa, že medzi týmito miRNAs miR-20a reguluje gény aktivácie T-buniek tak v knock-in, ako aj v knock-down T-bunkových modeloch. 22 Na skúmanie expresie miR-20a u pacientov s rakovinou vaječníkov a na stanovenie korelácie medzi hladinami miR-20a a závažnosťou ochorenia sme ďalej skúmali úlohu miR-20a vo vzorkách séra od pacientov s rakovinou vaječníkov epitelu.

Expresia miR-20a v sére sa hodnotila pomocou qRT-PCR u pacientov s ovariálnymi nádormi ( n = 34), pacientov s ovariálnymi cystami ( n = 10) a zdravých kontrolných vzoriek ( n = 20). Ako je uvedené v tabuľke 1, ACC TmiR20a bol významne nižší u pacientov ako v normálnych kontrolách ( P <0, 05), zatiaľ čo ACC TmiR20a v sére pacientov s ovariálnou cystou sa javil normálny, čo naznačuje, že hladiny miR-20a boli signifikantne vyššie u pacientov s rakovinou vaječníkov ako u kontrolných zvierat s normálnou kontrolou a s chorobou ovariálnej cysty. Aby sa vyhodnotila súvislosť medzi miR-20a a klinicko-patologickými vlastnosťami rakoviny vaječníkov, analyzovali sme hladiny miR-20a v sére pacientov s rakovinou vaječníkov klasifikovaných podľa metastáz alebo štádia Medzinárodnej federácie gynekologických a pôrodníckych (FIGO) chorôb. Hladina expresie miR-20a bola významne zvýšená u pacientov s metastázami a štádiom III-IV ( P <0, 05). Medzi expresiou miR-20a a inými charakteristikami nádoru nebola žiadna korelácia (tabuľka 1). Tieto výsledky naznačujú, že miR-20a môže súvisieť s progresiou rakoviny vaječníkov.

Tabuľka v plnej veľkosti

Expresia miR-20a a prognóza rakoviny vaječníkov

Na stanovenie toho, či je miR-20a spojená s prognózou pacientov s rakovinou vaječníkov, sa na definovanie skupín s vysokou a nízkou expresiou použila stredná hodnota (ACT = 1, 55) relatívnej sérovej miR-20a expresie všetkých pacientov ( n = 15, respektíve 19). Pacienti v skupine s vysokou expresiou mali vyššiu pravdepodobnosť kratšieho celkového prežitia ( P = 0, 048) v porovnaní s pacientmi s nízkou expresiou miR-20a (obrázok 1). To naznačuje, že miR-20a môže hrať dôležitú úlohu pri tumorigenéze vaječníkov a protinádorovej imunite.

Image

Krivky prežitia pacientov s rakovinou vaječníkov podľa stavu expresie miR-20a. Pacienti s vysokou expresiou miR-20a ( n = 15) mali signifikantne horšie prognózy ako pacienti s nízkou expresiou miR-20a ( n = 19) ( P = 0, 048; log-rank test).

Obrázok v plnej veľkosti

miR-20a down-reguluje expresiu MICA / B

Na skúmanie toho, či miR-20a bol zapojený do imunitnej regulácie zacielením na mRNA MICA / B, sme použili algoritmus TargetScan, 23, ktorý identifikoval potenciálne väzobné miesta pre miR-20a v 3'-UTR ligandov MICA / B.

Aby sa experimentálne potvrdilo, či miR-20a reguluje expresiu proteínu MICA / B v rakovinovom tkanive, uskutočnila sa in vitro funkčná štúdia na bunkách karcinómu vaječníkov SKOV3 a ES-2. Napodobeniny miR-20a a oligonukleotidy anti-miR-20a sa transfekovali do buniek a hladiny miR-20a, mRNA MICA / B a proteínov MICA / B na povrchu buniek sa analyzovali pomocou qRT-PCR a FCM (obrázok 2).,

Image

miR-20a špecificky znižuje expresiu MICA / B v bunkách ovariálneho karcinómu SKOV3. a ) Analýza polymerázovej reťazovej reakcie hladín miR-20a v bunkách SKOV3 transfektovaných miR-20a (vľavo) alebo oligonukleotidového inhibítora miR-20a (vpravo). ( b ) Hladiny mRNA MICA / B v transfekovaných bunkách SKOV3 sa analyzovali pomocou PCR v reálnom čase. Dáta sú uvedené ako priemer ± sem troch nezávislých experimentov. ( c ) Expresia MICA / B na povrchu transfekovaných buniek SKOV3 sa detegovala prietokovou cytometriou. Dáta sú uvedené ako priemer ± sd z troch nezávislých experimentov. * P <0, 05 a *** P <0, 01 oproti kontrole. PCR, polymerázová reťazová reakcia.

Obrázok v plnej veľkosti

Výsledky ukázali, že MICA / B mRNA (obrázok 2a a b) a proteín (obrázok 2c) boli významne znížené v bunkách transfekovaných miR-20a in vitro . Okrem toho downregulácia miR-20a transfekciou buniek pomocou anti-miR-20a (troj- až štvornásobne) viedla k zvýšenej expresii mRNA a proteínu MICA / B. Tieto dáta ukazujú, že miR-20a reguluje expresiu MICA / B v bunkách karcinómu vaječníkov.

miR-20a sa priamo viaže na MICA / B 3'-UTR

Aby sme otestovali, či miR-20a priamo zacieľuje MICA / B, vygenerovali sme štyri luciferázové reportérové ​​vektory svetlušiek: dva obsahujúce divoký typ MICA a MICB 3'-UTR a ďalšie dva obsahujúce MICA a MICB 3'-UTR s mutovanou miR -20a väzobné miesto (predpovedané algoritmom TargetScan; obrázok 3a a b). Tieto vektory boli transfekované do buniek SKOV3, ktoré boli tiež transfekované miR-20a (40 a 80 nM) alebo kontrolnými (necieľovými) RNA oligo.

Image

miR-20a sa priamo viaže na MICA / B 3'-UTR. ( a ) Schematické znázornenie MICA / B 3'-UTR a predpokladaných väzobných miest miR-20a (bázové pozície 207 - 213 semien v 3'-UTR MICA a bázové pozície 50–56 v 3'- UTR MICB). b ) Zarovnanie miR-20a a mutovaného 3'-UTR MICA / B. ( c ) Relatívna luciferázová aktivita po transfekcii uvedených reportérových plazmidov (MICA / B 3'-UTR alebo mutantného MICA / B mut 3'-UTR) do buniek SKOV3 exprimujúcich 40 nm hsa-miR-10b, 80 nm hsa-miR -10b alebo kontrolná miRNA. Luciferázová aktivita svetlušky bola normalizovaná na luciferázovú aktivitu Renilla a následne normalizovaná na priemernú aktivitu kontrolného reportéra. Dáta sú uvedené ako priemer ± sd z troch nezávislých experimentov. * P <0, 05 a *** P <0, 01 oproti kontrole. miRNA, microRNA; UTR, neprekladaná oblasť.

Obrázok v plnej veľkosti

Významné zníženie luciferázovej aktivity MICA a MICB sa pozorovalo v prítomnosti miR-20a, zatiaľ čo mutácie v MICA a MICB 3'-UTR tento účinok eliminovali (obrázok 3c). Tento výsledok naznačuje, že miR-20a priamo zacieľuje MICA / B na predpokladanom väzbovom mieste.

Downregulácia MICA / B pomocou miR-20a znižuje zabíjanie sprostredkované NKG2D

Ďalej sme skúmali, či miR-20a sprostredkovaná down-regulácia MICA / B ovplyvňuje biologické funkcie in vitro . Cieľové bunky SKOV3 boli transfekované miR-20a, anti-miR-20a napodobeninami alebo kontrolnými RNA oligo. Ďalej sme vopred označili transfekované bunky SKOV3 pomocou CFSE a vyhodnotili sme úlohu miR-20a v testoch NK cytotoxicity, ktoré sa uskutočňovali spoločnou kultiváciou buniek SKOV3 s NK bunkami. Ako je znázornené na obrázku 4, transfekcia s miR-20a viedla k miernemu zníženiu cytolytickej aktivity buniek NK92 pri rôznych pomeroch efektor-cieľ. Anti-miR-20a okrem toho zvrátil tieto inhibičné účinky. Celkovo tieto výsledky naznačujú, že miR-20a-sprostredkované zníženie expresie MICA / B znížilo zabíjanie NK bunkami.

Image

Downregulácia MICA / B pomocou miR-20a vedie k zníženému zabíjaniu sprostredkovanému NKG2D. a ) Dvojbodový bodový graf ukazuje živé cieľové bunky SKOV3 (ľavý horný kvadrant, Q1) značené CFSE verzus mŕtve cieľové bunky (pravý horný kvadrant, Q2) značené CFSE a PI. Bunky boli transfekované miR-Ctrl, miR-20a, anti-miR-Ctrl alebo anti-miR-20a. Je zobrazený graf, ktorý predstavuje tri nezávislé experimenty. b ) Pravý histogram predstavuje štatistické údaje uvedené v ľavom grafe (Q2 / (Q2 + Q1) × 100%). Pokus sa uskutočnil s pomerom efektor-cieľová bunka 20 μl, ako je opísané v časti „Materiály a metódy“. Dáta sú uvedené ako priemer ± sd z troch nezávislých experimentov. * P <0, 05 a *** P <0, 01 verzus kontrola. CFSE, sukcínimidylester karboxyfluorescein diacetátu; NKG2D, prírodný zabijak skupiny 2 člen D; PI, propidiumjodid.

Obrázok v plnej veľkosti

miR-20a sprostredkovalo imunitné úniky in vivo

Napriek skutočnosti, že ľudské MICA / B sú odlišné od myší, imunokompetentné myši môžu eliminovať ľudské malígne bunky cestou NKG2D – MICA / B. 21 Na vyšetrenie imunitných účinkov sprostredkovaných miR-20a in vivo sa použilo 21 myší ošetrených blokujúcou anti-NKG2D mAb (na odstránenie NKG2D + imunitných buniek). Päť hodín po injekcii rôznych zmesí buniek (bunky SKVO3 označené CFSE a HeLa bunky označené DiD) sa pripravili suspenzie signálnych buniek pľúc a význam miR-20a zacielenia MICA / B in vivo sa skúmal pomocou triedenie buniek aktivované fluorescenciou. Ako je znázornené na obrázku 5a, bunky SKOV3 (CFSE + ) a HeLa bunky (Vybrant DiD + ) sa mohli úspešne rozlíšiť pomocou FCM. Pomer buniek SKOV3 k HeLa bunkám na obrázku 5b naznačuje, že došlo k významnému obohateniu buniek SKOV3 nadmerne exprimujúcich miR-20a v pľúcach injikovaných myší v porovnaní s bunkami exprimujúcimi kontrolnú miRNA. Huba anti-miR-20a mala za následok významne nižšie prežitie nádorových buniek v pľúcach, pretože zvýšila expresiu MICA / B. Anti-NKG2D mAb odstránila pozorované rozdiely v blokovaní rozpoznávania NKG2D (obrázok 5b). Redukcia MICA / B sprostredkovaná miR-20a teda chráni nádorové bunky pred imunologickou cytotoxicitou NK buniek in vivo .

Image

Imunitné úniky sprostredkované miR-20a in vivo . ( a ) FACS analýza pre bunky označené selektantovým DID (HeLa bunky, vpravo dole) a CFSE (bunky SKOV3 transfekované miR-Ctrl, miR-20a alebo inhibítor miR-20a, vľavo hore) v jednobunkových suspenziách od pľúca izotypovej skupiny IgG. ( b ) Pomer nádorových buniek SKOV3 k HeLa v pľúcach sa vypočítal 5 hodín po injekcii do skupiny izotypu IgG a skupiny anti-NKG2D IgG. HeLa bunky nie sú účinne usmrtené myšacími NK bunkami, a preto sa použili ako vnútorná kontrola. Tento pomer odráža prežitie buniek SKOV3 transfekovaných rôznymi konštruktmi. Anti-NKG2D mAb odstránila pozorované rozdiely. Dáta sú uvedené ako priemer ± sd * P <0, 05 oproti kontrole. CFSE, sukcínimidylester karboxyfluorescein diacetátu; FACS, triedenie buniek aktivované fluorescenciou; mAb, monoklonálna protilátka; NK, prírodný zabijak; NKG2D, prírodný zabijak skupiny 2 členov D.

Obrázok v plnej veľkosti

diskusia

Aktivačný receptor NKG2D a jeho ligandy hrajú dôležitú úlohu v imunitných odpovediach na nádory sprostredkovaných NK, y5 + a CD8 + T bunkami. 14, 17 Avšak nádory vyvinuli rôzne mechanizmy, aby unikli eliminácii sprostredkovanej imunitnými bunkami, čo umožňuje relaps nádoru. Najnovšie štúdie zistili, že nádorové bunky abnormálne exprimujú množstvo miRNA a tento abnormálny expresný profil miRNA významne prispieva k imunitnému úniku nádoru. Predchádzajúce štúdie uvádzajú, že miR-20a nesúvisí iba s vývojom tumoru 26, 27, ale súvisí aj s invazívnou aktivitou v bunkách karcinómu vaječníkov. 28 V tejto štúdii sme skúmali úlohu miR-20a a jeho post-transkripčnú reguláciu MICA / B pri karcinóme vaječníkov.

Aj keď predchádzajúce štúdie odhalili, že miR-20a je vysoko exprimovaný pri rakovine vaječníkov, tieto štúdie sa zamerali hlavne na expresiu miR-20a v tkanivách. Naša štúdia potvrdzuje, že expresia miR-20a nie je iba významne vyššia u pacientov s rakovinou vaječníkov ako u normálnych kontrol, ale tiež významne súvisí s metastázami a zlou prognózou rakoviny vaječníkov. miRNA v sére, ktoré sú väčšinou odvodené z buniek s poškodenou plazmatickou membránou, 29 cirkulujú v krvi v bezbunkovej a relatívne stabilnej forme 30 a považujú sa za sľubnú novú triedu biomarkerov. 31 Sú však potrebné ďalšie klinické štúdie na úplné vyhodnotenie diagnostického potenciálu sérového miR-20a pri rakovine vaječníkov v konkrétnych prospektívnych štúdiách. V tejto štúdii uvádzame, že expresia miR-20a je významne zvýšená u pacientov s rakovinou vaječníkov s CA-125 ≤ 500 U / ml, ale nie u pacientov s CA-125> 500 U / ml, čo môže byť spôsobené individuálnymi variáciami. Sú však potrebné ďalšie klinické štúdie na úplné vyhodnotenie vzťahu CA-125 a sérového miR-20a pri rakovine vaječníkov.

Pretože hladiny miR-20a korelujú s metastázami ochorenia, predpokladali sme, že táto asociácia môže byť spôsobená downreguláciou MICR / B mRNA sprostredkovanou miR-20a. Na testovanie tejto možnosti boli bunky SKOV3 a ES-2 transfekované miR-20a, aby sa stanovil účinok expresie miR-20a na hladiny MICA / B. RT-PCR a FCM analýzy ukázali, že miR-20a znížil hladiny MICA / B mRNA a proteínu v transfekovaných bunkách. Ďalej pomocou modelu in vitro sme určili, že miR-20a cieli 3'-UTR MICA / B, čo vedie k zníženiu rozpoznávania NKG2D a následnému zníženiu zabíjania buniek K562 pomocou buniek NK. Nakoniec sme zistili, že miR-20a sprostredkovaná down-regulácia MICA / B znižuje vylučovanie NK buniek in vivo znížením rozpoznávania NKG2D.

Vzhľadom na to, že MICA / B nie je exprimovaný u myší, je ťažké vyhodnotiť imunitné úniky sprostredkované miR-20a in vivo . Nedávna práca skupiny Pinchas 21 ukázala, že myšie NK bunky by mohli in vivo významne zabíjať ľudské nádorové bunky prostredníctvom NKG2D-MICA / B dráhy. Tu sme ukázali, že transfekcia s miR-20a viedla k downregulácii MICA / B na povrchu nádorových buniek, a tak k prežitiu nádorových buniek in vivo . Ďalej sme ukázali, že kompetitívny inhibítor miR-20a (huba-miR-20a) významne vylučoval nádorové bunky in vivo . Ďalej, rozdiel v prežívaní pozorovaný v rôznych nádorových bunkách v myších pľúcach mohol byť odstránený blokovaním anti-NKG2D mAb.

Záverom sme zistili, že miR-20a sa zameriava na MICA / B, aby sa zabránilo imunitnému útoku sprostredkovanému NKG2D, a že upregulácia miR-20a pri rakovine vaječníkov znižuje expresiu MICA / B prostredníctvom interakcie s jeho 3'-UTR. Toto desenzibilizuje nádorové bunky exprimujúce nízke hladiny MICA / B k zabíjaniu NK / T-buniek. Celkovo tieto údaje naznačujú novú úlohu miR-20a pri vývoji nádoru a poskytujú nové poznatky o modulácii MICA / B počas imunitného sledovania rakoviny.

príspevky

Shuli Zhao navrhol štúdiu, vykonal experimenty, analyzoval údaje a napísal rukopis. Mengna Liu a Jingyan Xie vykonávali experimenty, pomáhali s návrhom štúdie, analyzovali údaje a komentovali rukopis. Experimenty vykonali Yujuan Li, Yunzhong Nie a Qiongyu Mi.