Agonista muskarínového acetylcholínového receptora butac sprostredkuje antipsychotické účinky prostredníctvom subtypu m4 | neuropsychofarmakologie

Agonista muskarínového acetylcholínového receptora butac sprostredkuje antipsychotické účinky prostredníctvom subtypu m4 | neuropsychofarmakologie

Anonim

predmety

  • farmakológia
  • psychóza

abstraktné

Tvorba zlúčenín selektívnych na podtypy muskarínových acetylcholínových receptorov (mAChR) bola náročná a vyžaduje si použitie nefarmakologických prístupov, ako sú napríklad geneticky upravené zvieratá, aby sme si prehĺbili naše porozumenie potenciálu, ktorý majú členovia skupiny podtypov muskarínového receptora ako cieľové terapeutické lieky. Bolo preukázané, že agonista muskarínového receptora „BuTAC“ bol na zvieracích modeloch psychózy účinný, hoci konkrétny podtyp receptorov zodpovedný za takúto aktivitu nebol jasný. Hodnotíme tu in vitro funkčnú agonistickú a antagonistickú aktivitu BuTAC pomocou testu, ktorý poskytuje priamu mieru aktivácie G proteínu. Ďalej používame paradigmu podmienenej reakcie na vyhýbanie sa, model in vivo predpovedajúci antipsychotickú aktivitu a modely myšej genetickej delécie na skúmanie toho, ktorý presynaptický podtyp mAChR sprostredkuje antipsychotické účinky BuTAC. Naše výsledky ukazujú, že BuTAC in vitro pôsobí ako úplný agonista na M2AChR a čiastočný agonista na receptoroch M1 a M4, s úplnou antagonistickou aktivitou na M3- a M5AChR. V teste podmienenej vyhýbacej sa reakcii na myši (CAR) vykazuje BuTAC atypický profil podobný antipsychotike selektívnym znižovaním reakcií na vyhýbanie sa pri dávkach, ktoré nevyvolávajú zlyhanie úniku. Výsledky CAR s použitím M2 - / -, M4 - / - a M2 / M4 (M2 / M4 - / - ) myší zistili, že účinky BuTAC sa takmer úplne stratili u M2 / M4 - / - myší s dvojitým knockoutom a účinnosť BuTAC bol u M4 - / - posunutý doprava v porovnaní s myšami divokého typu a M2 - / - . Myši M2 / M4 - / - nevykazovali žiadnu zmenenú citlivosť na antipsychotické účinky haloperidolu alebo klozapínu, čo naznačuje, že tieto zlúčeniny sprostredkujú svoje pôsobenie v CAR mechanizmom, ktorý nie je sprostredkovaný mAChR. Tieto údaje podporujú úlohu podtypu M4AChR pri sprostredkovaní antipsychotickej aktivity BuTAC a implikujú agonizmus M4AChR ako potenciálny nový terapeutický mechanizmus na zmiernenie symptómov spojených so schizofréniou.

ÚVOD

Všetky v súčasnosti dostupné antipsychotické lieky zdieľajú antagonizmus dopamínového D2 receptora ako spoločný mechanizmus účinku (Wadenberg et al, 2001). Napriek tomu, že D2 antagonisty sú účinné, majú významné vedľajšie účinky, ako aj významné medzery v reakcii na liečbu. Zostáva teda značná neuspokojená klinická potreba účinných liekov s novými mechanizmami pôsobenia so zlepšenou účinnosťou a zníženými profilmi vedľajších účinkov.

Muskarínový cholinergný systém má potenciál ako nový terapeutikum pre schizofréniu: muskarínové antagonisty sa používajú na potlačenie extrapyramidálnych vedľajších účinkov spojených so silnými antagonistami dopamínu D2 a muskarínové agonisty sa považujú za účinné pri liečbe pozitívnych a negatívnych symptómov a kognitívnych deficitov u schizofrénnych pacientov ( Bymaster a kol., 2002). Najnovšia malá placebom kontrolovaná dvojito zaslepená klinická štúdia s muskarínovým agonistom xanomelínom zlepšila pozitívne a negatívne symptómy a kognitívne deficity schizofrenikov rezistentných na liečbu (Shekhar et al, 2008). Aj keď bol xanomelín u pacientov v tejto štúdii relatívne dobre tolerovaný, neselektívne muskarínové agonisty spôsobujú parasympatické vedľajšie účinky, ktoré obmedzujú ich klinické využitie.

V súčasnosti existuje päť známych podtypov muskarínových acetylcholínových receptorov (mAChR) (M1 – M5AChR), z ktorých všetky patria do nadrodiny receptorov spojených s G-proteínmi triedy A (Feldman et al, 1997; Kristiansen, 2004). Vysoké hustoty prevažne postsynapticky lokalizovaného subtypu M1AChR a presynapticky lokalizovaných subtypov M2- a M4AChR sa našli v limbických a predných mozgových oblastiach zapletených do patofyziológie schizofrénie, ako je mozgová kôra, hippocampus a striatum, čo naznačuje, že môžu byť sľubné ciele. vývoj nových antipsychotických liekov (Bernard a kol., 1992; Bymaster a kol., 2003a; Felder a kol., 2000; Hersch a kol., 1994; Woolf, 1991).

BuTAC je ligand mAChR, o ktorom sa už predtým zistilo, že vykazuje účinnosť na zvieracích modeloch predpovedajúcich antipsychotickú aktivitu pri schizofrénii (Bymaster a kol., 1998; Jones a kol., 2005; Rasmussen a kol., 2001). Presné podtypy mAChR zodpovedné za antipsychotické účinky však zostávajú nevyriešené. Technológia génového cielenia priniesla knockoutované myši s deléciami špecifických mAChR, ktoré pomohli pri vymedzení úloh, ktoré hrajú rôzne podtypy mAChR vo fyziologických aj farmakologických procesoch (Bymaster et al, 2003b). Takéto geneticky modifikované zvieratá sa tu použili na určenie úlohy presynaptických podtypov mAChR (M2- a M4AChR) pri sprostredkovaní antipsychotických účinkov BuTAC.

Historicky bol BuTAC a štrukturálne podobný PTAC opísaný ako čiastočný agonista preferujúci M2- / M4AChR s antagonistickou aktivitou M1- / M3- / M5AChR a obe zlúčeniny vykazujú účinnosť na zvieracích modeloch predpovedajúcich antipsychotickú aktivitu pri schizofrénii (Bymaster a kol., 1998; Jones a kol., 2005; Rasmussen a kol., 2001). Naše výsledky in vitro funkčných testov načrtnuté tu mierne revidujú tento historický profil selektivity pre BuTAC. Testovanie funkčnej aktivity mAChR pomocou metódy zachytávania protilátok pre aktiváciu G-proteínu ukazuje, že BuTAC vykazuje úplnú agonistickú aktivitu na M2AChR a ekvipotentnú čiastočnú agonistickú aktivitu na M1- a M4AChR. Okrem toho BuTAC vykazuje úplnú antagonistickú aktivitu na M3- a M5AChR. Pri použití myší, ktorým individuálne chýbajú M2AChR, M4AChR alebo M2- a M4AChR, demonštrujeme, že BuTAC je účinný v podmienenom paradigme reakcie na vyhýbanie sa, model predpovedajúci účinnosť podobnú antipsychotikám a že M4AChR je dôležitým účinkom sprostredkujúcim podtyp u tento test.

VÝSLEDKY

Funkčné účinky BuTAC na subtypy mAChR

Funkčná selektivita BuTAC stanovená väzbou GTP- y- [35S] sa porovnávala s klozapínom a haloperidolom v piatich podtypoch ľudských muskarínových receptorov (tabuľka 1). BuTAC vykazoval úplnú agonistickú aktivitu pri M2AChR (pEC50 = 9, 56 ± 10, 26 M;% Emax = 136, 53 ± 17, 20%) a čiastočnú agonistickú aktivitu v subtypoch M1- a M4AChR (pEC 50 = 9, 22 ± 9, 80 a 10, 27 ± 10, 31 M, % Emax = 33, 56 ± 6, 29 a 35, 53 ± 11, 51%, obrázok la, b, a d). BuTAC preukázal sprievodný čiastočný antagonizmus v subtypoch M1 a M4 (pIC50 = 9, 03 ± 10, 01 a 9, 19 ± 9, 13, v danom poradí;% inhibície = 57, 27 ± 2, 35 a 57, 55 ± 3, 22%, obrázok la a d), ako aj úplnú antagonistickú aktivitu pri M3 a M5 AChRs (pIC50 = 8, 55 ± 8, 59 a 8, 29 ± 8, 16 M;% inhibície = 100 ± 0 a 96, 31 ± 3, 87%). Na rozdiel od profilu aktivity BuTAC typický antipsychotický haloperidol nevykazoval žiadnu agonistickú aktivitu v žiadnom z piatich podtypov mAChR a vykazoval slabú čiastočnú antagonistickú aktivitu na M1-, M2- a M4AChR (pICso = 4, 65 ± 5, 08, 4, 45 ±). 4, 92, resp. 4, 59 ± 5, 04 M;% inhibície = 69, 97 ± 4, 11, 79, 11 ± 4, 14 a 90, 12 ± 17, 12%). Atypický antipsychotický klozapín vykazoval slabý parciálny agonizmus pri M2AChR (pEC 50 = 6, 63 ± 6, 95 M;% Emax = 25, 78 ± 3, 78%) a vykazoval takmer úplný antagonizmus vo všetkých ostatných podtypoch mAChR (M1-, M3-, M4- a M5AChR;% inhibície = 89, 92 ± 6, 85, 95, 06 ± 2, 80, 97, 94 ± 1, 15, respektíve 93, 88 ± 6, 35%).

Tabuľka v plnej veľkosti

Image

Účinok BuTAC na väzbu GTP- y - [35S] v membránach pripravených z CHO buniek heterológne exprimujúcich hM1-hM5AChRs (panely a – e). Agonistické% Emax dáta sú vyjadrené ako percento maximálneho signálu pozorovaného v prítomnosti neselektívneho ortosterického mAChR agonistu oxotremorínu-M (100 μM) a% inhibičných údajov predstavuje relatívny antagonizmus agonistickej reakcie pozorovaný s použitím experimentálne určeného EC90. koncentrácia ACh; údaje o účinnosti sú vyjadrené ako priemer ± SD najmenej troch samostatných experimentov, z ktorých každý sa vykonáva dvakrát. Acetycholín sa použil v antagonistických testoch namiesto oxotremorínu-M, aby presnejšie predstavoval potenciálnu inhibíciu endogénnej signalizácie.

Obrázok v plnej veľkosti

  • Stiahnite si snímku aplikácie PowerPoint

Reakcia na podmienené vyhýbanie sa dvojnásobnej myši M2 / M4 - / - (zmiešané pozadie)

Je prekvapujúce, že antipsychotické účinky BuTAC boli takmer neprítomné u myší, ktorým chýbali M2- a M4AChR (zmiešané genetické pozadie), a vykazovali> 100-násobné zníženie citlivosti na účinky BuTAC potláčajúce vylúčenie (obrázok 2a). Hlavné účinky genotypu a dávky boli pozorované na percentá vyhýbavých reakcií (F 1, 22 = 425, 57, P <0, 0001; F 3, 63 = 125, 17, P <0, 0001), ako aj na významnú interakciu dávka x genotyp (F 3, 63 = 77, 23, P <0, 0001). Post hoc analýzy odhalili, že hoci BuTAC potláčal vyhýbanie sa reakcii u myší WT pri dávkach 0, 03, 0, 1, 0, 3, 1 a 3 mg / kg v porovnaní s ich kontrolnou dávkou vehikula, vyhýbanie sa reagovalo u myší M2 / M4 - / - bolo potlačené iba pri dávka 3 mg / kg vzhľadom na kontrolu s vehikulom a BuTAC potlačili vyhýbanie sa reakcii vo väčšej miere u myší WT v porovnaní s myšami M2 / M4 - / - v dávkach 0, 03 mg / kg a vyšších. U percent M2 / M4 - / - a WT myší (všetky P > 0, 05) neboli pozorované žiadne významné hlavné účinky alebo interakcie.

Image

Účinky BuTAC, haloperidolu a klozapínu na priemerné (± SEM) percento podmienených reakcií na vyhýbanie sa a zlyhanie úniku u M2 / M4 dvojitého knockoutu (M2 / M4 - / - ) a WT myší. (a) BuTAC vyvolal antipsychotické účinky u myší divokého typu (WT), ako bolo demonštrované potlačením odpovede na vyhýbanie sa závislosti od dávky. Naproti tomu myši M2 / M4 - / - vykazovali> 100-násobné zníženie citlivosti na antipsychotické účinky BuTAC (* P <0, 05, M2 / M4 - / - oproti kontrolám WT). Podrobné porovnania dávok a genotypov sú uvedené vo výsledkoch. Neboli pozorované žiadne významné rozdiely v percentách zlyhania úniku medzi M2 / M4 - / - a WT myšami, čo naznačuje zníženú náchylnosť k produkcii extrapyramidálnych vedľajších účinkov ( P s> 0, 05). (b) Antipsychotické účinky haloperidolu sa u myší M2 / M4 - / - nezmenili, čo naznačuje nedostatok genotypových alebo interakčných účinkov na vyhýbanie sa reakcii medzi myšami M2 / M4 - / - a WT. Haloperidol v závislosti od dávky zvýšil zlyhanie úniku u myší M2 / M4 - / - a WT, čo je v súlade s jeho sklonom vytvárať extrapyramidálne vedľajšie účinky u ľudí. Podrobné porovnania dávok a genotypov sú uvedené vo výsledkoch. c) Antipsychotické účinky klozapínu sa u myší M2 / M4 - / - nezmenili, čo naznačuje nedostatok genotypových alebo interakčných účinkov na vyhýbanie sa reakcii medzi myšami M2 / M4 - / - a WT. Klozapín významne nezvýšil zlyhanie úniku u myší M2 / M4 - / - alebo WT. Podrobné porovnania dávok a genotypov sú uvedené vo výsledkoch.

Obrázok v plnej veľkosti

  • Stiahnite si snímku aplikácie PowerPoint

Myši M2 / M4 - / - a WT vykazovali podobnú senzitivitu k antipsychotickým účinkom haloperidolu aj klozapínu (obrázok 2b, respektíve c). Hlavný účinok dávky sa zistil na percentuálnu reakciu na vyhýbanie sa myši u myší, ktoré dostávali haloperidol (F3 , 44 = 189, 79, P <0, 0001), čo ukazuje na potlačenie závislé od dávky v neprítomnosti hlavného účinku alebo interakcie genotypu (všetky P > 0, 05). Post-hoc analýzy odhalili, že haloperidol potlačil vyhýbanie sa reakcii u myší WT v dávkach 0, 3, 1 a 3 mg / kg a u myší M2 / M4 - / - v dávkach 0, 1, 0, 3, 1 a 3 mg / kg, v porovnaní s ich príslušnými dávkami vehikula. Hlavný účinok dávky sa zistil aj na percentuálny podiel zlyhania úniku (F2 , 31 = 12, 89, P <0, 0001) v neprítomnosti hlavného účinku alebo interakcie genotypu (všetky Ps > 0, 05), pričom post hoc analýzy ukázali, že haloperidol na dávke závislé zlyhania úniku u M2 / M4 - / - a WT myší pri najvyššej koncentrácii (3 mg / kg).

Hlavný účinok dávky sa pozoroval na percentách vyhýbania sa vyhýbaniu u myší, ktoré dostávali klozapín, čo ukazuje na prerušenie reakcie na vyhýbanie sa vyhýbaniu závislé od dávky (F2 , 23 = 349, 75, P <0, 0001; Obrázok 2c), v neprítomnosti hlavného účinku genotypu. alebo interakcia (všetky P > 0, 05). Post hoc analýzy odhalili, že klozapín potlačil vyhýbanie sa reakcii u myší WT a M2 / M4 - / - v dávkach 3 a 10 mg / kg v porovnaní s ich príslušnými dávkami vehikula. Na rozdiel od haloperidolu klozapín významne nezvýšil zlyhanie úniku (hlavné účinky a interakcie: všetky P > 0, 05).

Reakcia na podmienené vyhýbanie sa u myší M2 - / - a M4 - / - (zmiešané pozadie substrátu CF-1 × 129)

Pripomeňme si, že myši M2 - / - boli chované na zmiešanom 129JAE1 x CF-1 genetickom pozadí, zatiaľ čo myši M4 - / - boli udržiavané na pozadí 129SvEv x CF-1. Z počiatočnej skupiny 14 M2 WT myší 10 nesplnilo kritérium odpovede na vyhýbanie sa, pričom len málo z nich pokračovalo v testovaní liečiv ( N = 4). Štatistické analýzy sa teda uskutočňovali iba na myšiach M4 - / - a WT. Ako je vidieť na obrázku 3, BuTAC významne prerušil vyhýbanie sa reakcii podobne u M4 - / - a WT myší, ako je naznačené hlavným účinkom dávky (F2 , 26 = 99, 45, P <0, 0001) a nedostatkom hlavného účinku interakcie genotyp alebo genotyp × dávka ( Ps <0, 05). Post hoc analýzy odhalili, že BuTAC významne znížil reakciu na vyhýbanie sa reakcii u myší WT a M4 - / - v dávkach 0, 03, 0, 1, 0, 3, 1 a 3 mg / kg v porovnaní s ich príslušnými dávkami vehikula.

Image

Účinky BuTAC na priemerné (± SEM) percento podmienených reakcií na vyhýbanie sa a zlyhania úniku u M4 - / - a divokého typu (WT) myší na zmiešané genetické pozadie. BuTAC vyvolal antipsychotické účinky u všetkých testovaných myší, ako bolo preukázané potlačením odpovede na vyhýbanie sa závislosti od dávky. Žiadne významné rozdiely medzi genotypmi sa nepozorovali v percentách vyhýbavých reakcií ( Ps > 0, 05). BuTAC však významne zvýšil zlyhanie úniku u WT, ale nie M4 - / - myší na zmiešanom genetickom pozadí (* P <0, 05, M2 / M4 - / - oproti kontrolám WT). Podrobné porovnania genotypov a dávok sú uvedené vo výsledkoch.

Obrázok v plnej veľkosti

  • Stiahnite si snímku aplikácie PowerPoint

BuTAC v závislosti od dávky zvýšil zlyhanie úniku, ako naznačuje hlavný účinok dávky (F2 , 19 = 7, 88, P = 0, 005; Obrázok 3). Významný hlavný účinok genotypu sa pozoroval na percentuálny podiel zlyhania úniku (F 1, 12 = 7, 05, P <0, 03), ako aj na interakciu dávka x genotyp (F 2, 19 = 5, 84, P <0, 02). Post hoc analýzy odhalili, že BuTAC významne zvýšil zlyhanie úniku iba u WT myší v dávkach 0, 3, 1 a 3 mg / kg v porovnaní s ich príslušnou dávkou vehikula, a myši WT preukázali významne viac zlyhaní úniku ako myši M4 - / - na 1 a dávky 3 mg / kg.

Aj keď neboli štatisticky analyzované z dôvodu nízkych N , M2 - / - a WT myší, vykazovali porovnateľné účinky BuTAC: napríklad dávky 0, 03 a 0, 1 mg / kg vyvolali 34, 7% oproti 28, 5% a 21, 3% oproti 8, 0% vyhýbania sa M2 - / - a WT myši. Okrem toho dávka 3 mg / kg BuTAC spôsobila 0, 67% zlyhaní úniku u myší M2 - / - a 0, 0% zlyhania úniku u myší WT.

Reakcia na podmienené vyhýbanie sa u myší M2 - / - a M4 - / - (C57BL / 6 Pozadie)

Obrázok 4a zobrazuje účinky BuTAC na priemerné (± SEM) percento podmienených reakcií na vyhýbanie sa a zlyhanie úniku u M2 - / -, M4 - / - a WT myší (C57BL / 6 genetické pozadie). BuTAC v závislosti od dávky prerušil reakciu podmieneného vyhýbania, ktorá bola tiež závislá od genotypu, čo naznačujú významné hlavné účinky dávky (F3 , 96 = 114, 91, P <0, 0001), genotypu (F2 , 35 = 21, 52, P <0, 0001). a interakcia dávka x genotyp (F6 , 96 = 5, 92, P <0, 0001). Post hoc analýzy určili, že myši M4 - / - boli významne menej ovplyvnené každou dávkou BuTAC ako kontroly WT. Naproti tomu sa myši M2 - / - a WT nelíšili v reakcii na každú dávku BuTAC. Myši M2 - / - a WT preukázali zníženú reakciu vyhýbania sa pri všetkých dávkach (0, 01 - 0, 3 mg / kg) v porovnaní s ich príslušnými dávkami vehikula, zatiaľ čo myši M4 - / - vykazovali zníženú vyhýbanie sa reakcii iba pri 0, 03, 0, 1 a 0, 3 mg. / kg v porovnaní s príslušnou dávkou vehikula. Hlavný účinok dávky sa zistil aj na percentuálny podiel zlyhania úniku (F2 , 38 = 4, 13, P <0, 05) v neprítomnosti hlavného účinku alebo interakcie genotypu (všetky P > 0, 05); post hoc analýzy však naznačili, že v jednotlivých porovnaniach neboli žiadne významné rozdiely.

Image

Účinky BuTAC a haloperidolu na priemernú (± SEM) percentuálnu podmienenú reakciu na vyhýbanie sa a zlyhanie úniku u myší M2 - / -, M4 - / - jediného knockoutu a divokého typu (WT) na pozadí B6. (a) BuTAC vyvolal antipsychotické účinky u všetkých testovaných myší, čo dokazuje potlačenie reakcie na vyhýbanie sa závislosti od dávky. Myši M4 - / - vykazovali 30-krát menšiu citlivosť na antipsychotické účinky BuTAC v porovnaní s myšami M2 - / - a WT (* P <0, 05 oproti kontrole WT). Podrobné porovnania dávok a genotypov sú uvedené vo výsledkoch. Dôležité je, že BuTAC významne nezvýšil zlyhanie úniku u žiadnej z myší, čo naznačuje zníženú tendenciu produkovať extrapyramidálne vedľajšie účinky (všetky P > 0, 05). (b) Haloperidol vyvolal antipsychotické účinky u všetkých testovaných myší, čo dokazuje potlačenie reakcie na vyhýbanie sa závislosti od dávky. Aj keď myši M4 - / - vykazovali menšiu senzitivitu na antipsychotické účinky BuTAC ako myši WT alebo M2 - / -, v porovnaní s príslušnými kontrolami s vehikulom, reakcie na vyhýbanie sa reakcii po liečbe haloperidolom sa významne nelíšili ani u M2 - / - alebo M4. - / - myši verzus zvieratá WT pri akejkoľvek testovanej dávke ( # P <0, 05 vs M2 - / - ). Haloperidol v závislosti od dávky zvýšil zlyhanie úniku, čo je v súlade s jeho sklonom vyvolať u ľudí extrapyramidálne vedľajšie účinky. Podrobné porovnania dávok a genotypov sú uvedené vo výsledkoch.

Obrázok v plnej veľkosti

  • Stiahnite si snímku aplikácie PowerPoint

Účinky haloperidolu na priemerné (± SEM) percento podmienených reakcií na vyhýbanie sa a zlyhania úniku u M2 - / -, M4 - / - a WT myší sú znázornené na obrázku 4b. Haloperidol reagoval na prerušenie reakcie závislé od dávky (hlavný účinok dávky: F2 , 80 = 105, 61, P <0, 0001]. Hlavný účinok genotypu bol pozorovaný na percentuálnu reakciu na vyhýbanie sa (F2 , 34 = 4, 07, P <0, 03), ako aj interakcie dávka x genotyp (F 5, 80 = 3, 05, P <0, 02). Post hoc testy ukázali, že myši M2 - / - a WT vykazovali zníženú reakciu na vyhýbanie sa pri koncentrácii 0, 3 - 10 mg / kg v porovnaní s ich príslušné dávky vehikula, zatiaľ čo myši M4 - / - demonštrovali znížené vyhýbanie sa reakcii iba pri 3 a 10 mg / kg v porovnaní s ich príslušnou dávkou vehikula. Pretože myši M4 - / ani M2 - / - sa významne nelíšili od myší WT pri akejkoľvek dávke pri testovaní sa zdá, že interakcia medzi dávkou a genotypom bola do značnej miery riadená významným rozdielom medzi myšami M4 - / - a M2 - / - pri dávkach 1 a 3 mg / kg, kde myši M4 - / - vykazovali významne viac vyhýbacích reakcií ako myši Myši M2 - / - Hlavný účinok dávky sa zistil aj v percentách esc zlyhania opíc (Fl , 40 = 17, 47, P <0, 0001) v neprítomnosti hlavného účinku alebo interakcie genotypu (všetky P > 0, 05); post hoc analýzy však ukázali, že haloperidol významne indukoval zlyhanie úniku iba u WT myší v dávke 10 mg / kg.

Na potvrdenie antipsychotických účinkov a genotypových účinkov BuTAC sa testovala jedna dávka 0, 03 mg / kg v samostatnej skupine myší M4 - / - a WT na pozadí C57BL / 6. Rovnako ako v predchádzajúcich experimentoch BuTAC signifikantne znížil vyhýbacie reakcie, čo naznačuje významný hlavný účinok dávky na percentuálne vyhýbacie reakcie (tabuľka 2; Fl, 27 = 171, 79, P <0, 0001). Pozoroval sa významný hlavný účinok genotypu (Fl , 27 = 11, 94, P <0, 002), rovnako ako signifikantná interakcia dávka x genotyp (Fl , 27 = 16, 03, P <0, 001). Post hoc testy ukázali, že myši M4 - / - dostávajúce 0, 03 mg / kg BuTAC produkovali významne viac vyhýbacích reakcií ako myši WT ( P <0, 05), čo potvrdzuje genotypovo závislé účinky BuTAC. Dávka 0, 3 mg / kg BuTAC významne nezvýšila zlyhanie úniku (hlavné účinky a interakcie: všetky P > 0, 05).

Tabuľka v plnej veľkosti

DISKUSIA

Doteraz bolo navrhnuté, aby BuTAC pôsobil ako agonista preferujúci M2- / M4AChR s antagonistickou aktivitou na M1-, M3- a M5AChR (Shannon a kol., 1999; Rasmussen a kol., 2001). Výsledky funkčných GTP- y- [35S] väzbových štúdií, ktoré sú tu uvedené, však ukazujú, že BuTAC pôsobí ako relatívne ekvipotentný agonista preferujúci M1- / M2- / M4AChR s relatívne plnou účinnosťou na M2AChR a čiastočnou agonistickou aktivitou na oboch M1- a M4AChRs (tabuľka 1 a obrázok la, b, d). Naše výsledky tiež ukazujú, že BuTAC demonštruje úplnú antagonistickú aktivitu na M3- a M5AChR, čo potvrdzuje predchádzajúce zistenia (obrázky 1c a e) (Shannon a kol., 1999; Rasmussen a kol., 2001). Tieto údaje modifikujú predchádzajúce pozorovania Shannona a kol. (1999) týkajúce sa profilu funkčnej aktivity pre BuTAC. Takéto rozdiely medzi výsledkami štúdie in vitro pravdepodobne odrážajú technické pokroky vo vývoji funkčných testov od počiatočnej charakterizácie tejto molekuly. Ako sa tu preukázalo, BuTAC vykazoval silné, ale neselektívne vytesnenie rádioaktívne označeného antagonistu [3H] -NMS (tabuľka 1). Takéto výsledky zdôrazňujú význam in vitro funkčných štúdií, ktoré sa tu vyžadovali v kombinácii s genetickými delečnými modelmi, aby sa odhalil profil selektivity podtypu receptora pre BuTAC a následný fyziologický význam. BuTAC vykazuje antipsychotické účinky na zvieracích modeloch psychózy, vrátane šplhania vyvolaného apomorfínom a prerušenia inhibície prepulzií vyvolaného apomorfínom (Jones a kol., 2005; Rasmussen a kol., 2001). Táto štúdia rozšírila tieto predchádzajúce nálezy tým, že demonštrovala antipsychotickú aktivitu v paradigme myšej podmienenej vyhýbacej sa reakcie (CAR). Okrem toho bol príspevok presynaptickej signalizácie mAChR (prostredníctvom prevažne presynapticky lokalizovaných M2- a M4AChR) hodnotený u zodpovedajúcich génov s deléciou génov. Úloha prevažne postsynapticky lokalizovaného M1AChR pri sprostredkovaní antipsychotických účinkov BuTAC in vivo sa v týchto štúdiách osobitne nehodnotila, čo ponecháva otvorenú možnosť, že aktivita M1AChR prispieva k predklinickej farmakológii BuTAC.

BuTAC vykazoval v teste CAR atypický antipsychotický profil a pri porovnaní s divokým typom a myšami M2 - / - vykazovali myši M4 - / - zníženú citlivosť na účinky BuTAC pri podmienenej reakcii, čo naznačuje, že BuTAC sprostredkuje antipsychotiku aktivita podobná v tomto teste prevažne prostredníctvom podtypu M4AChR. Jeho účinnosť sa úplne stratila u dvojitých knockoutovaných myší M2 / M4AChR, čo naznačuje, že hoci je pravdepodobné prevažne sprostredkované M4AChR, účinnosť BuTAC môže tiež byť do istej miery závislá od integrity M2AChR. Pozoruhodný nedostatok aktivity BuTAC u myší M2 / M4 - / - bol v kontraste s normálnymi (tj porovnateľná aktivita ako u myší WT), aby sa zabránilo účinku odozvy na haloperidol a klozapín.

Vyhodnotenie BuTAC u samostatných myší M2 - / - a M4 - / - proti zmiešanému genetickému pozadiu (CF-1 × 129) ukázalo, že myši M4 - / - boli menej citlivé na BuTAC iba pri vyšších dávkach, ktoré spôsobili zlyhanie úniku v kontrolách WT tohto konkrétneho hybridného myšieho kmeňa. Ako ukázal He a Shippenberg (2000), rôzne kmene myší vykazujú zmenenú dynamiku bazálneho dopamínu a reagujú odlišne na agonisty dopamínu, ako je napríklad kokaín. V našej štúdii môžu mať myši na hybridnom pozadí vyššiu závislosť od M4 v nigrostriatálnej (A9) motorickej dráhe v porovnaní s mezolimbickou (A10) dráhou, a preto ponúkajú možné vysvetlenie, prečo sa genotypové rozdiely BuTAC objavili iba pri vyšších dávkach, ktoré spôsobil zlyhanie úniku u WT myší. V súlade s touto hypotézou je kmeň C57Bl / 6 menej citlivý na únikové zlyhania v teste CAR. Hoci neboli analyzované z dôvodu nízkej energie, myši M2 - / - na hybridnom pozadí boli porovnateľne ovplyvnené BuTAC v porovnaní s WT myšami, čo naznačuje, že cieľový (-é) cieľ (y) ako M2- alebo M4AChRs sprostredkovávajú aktivitu BuTAC pri nižších dávkach, ale že účinky M4AChR sprostredkované vysokými dávkami motorického poškodenia.

Kvôli ťažkostiam pri tréningu myší M2 - / - na pozadí CF-1 x 129 Jae1 na 90% kritérium vyhýbania sa v teste CAR a pri interpretácii relatívnej úlohy M2- oproti M4AChR vo farmakológii BuTAC CAR u myší s odlišným genetickým pozadím. sme tiež testovali BuTAC na myšiach M2 - / - a M4 - / - odvodených z C57Bl / 6. V týchto štúdiách bolo zrejmé, že M2AChR plnil malú úlohu pri účinku BuTAC, zatiaľ čo u myší M4 - / - bola senzitivita na BuTAC približne 30-násobne posunutá doprava. Toto zistenie zníženej účinnosti BuTAC u myší M4 - / - sa replikovalo do samostatnej kohorty. Aj keď to nebolo v tejto štúdii testované, predchádzajúce správy preukázali, že myši bez M4AChR vykazujú zvýšenú citlivosť na dopaminergné agonisty (Gomeza a kol., 1999b), čo naznačuje, že posun doprava v teste CAR demonštrovaný tu môže súvisieť so zmenenou moduláciou dopamínového tonusu M4AChR., Aj keď naše údaje u myší M2 - / - a M4 - / - silne implikujú M2 a M4, treba poznamenať, že ako receptory M1, tak M5 sa tiež predpokladá, že regulujú dopaminergné dráhy. Napríklad myši M1 - / - vykazujú zvýšenú lokomotorickú odpoveď na d-amfetamín (Gerber a kol., 2001) a receptory M5 sú lokalizované na dopamínových bunkových telách vo VTA, čo naznačuje priamu moduláciu (Schmidt a kol., 2010; Steidl a kol. al, 2011). Myši M5 - / - skutočne preukázali behaviorálne, neurochemické a elektrofyziologické reakcie v súlade s moduláciou dopaminergnej neurotransmisie (Forster a kol., 2002; Schmidt a kol., 2010). Napriek tomu tu uvedené údaje silne naznačujú úlohu M4 receptorov pri sprostredkovaní účinnosti BuTAC v teste CAR. Tieto údaje podporujú predchádzajúce zistenia, ktoré naznačujú, že aktivácia M4AChR zlepšuje psychotické aj kognitívne symptómy schizofrénie a môže byť dôležitou súčasťou antipsychotického účinku atypických neuroleptík (Chan a kol., 2008; Perry a kol., 2001; Shekhar a kol., 2008; Zeng a kol., 1997). Zistenie, že v zmiešanom pozadí CF-1 × 120SvEv sa zmeny v citlivosti BuTAC vyskytovali iba pri vysokých dávkach a že v myšiach C57Bl / 6 bol BuTAC posunutý doprava - ale stále bola zachovaná aktivita - naznačuje, že CAR aktivita BuTAC je sprostredkovaná ďalšou farmakológiou. Vzor výsledkov z našich štúdií naznačuje interakciu gén x farmakológia: BuTAC nemal aktivitu u dvojitých myší M2 / M4 - / - a myši M2 - / - nevykazovali zmenenú citlivosť na BuTAC. Citlivosť myší M4 - / - na BuTAC však bola do istej miery ovplyvnená genetickým pozadím. Úloha reagujúca na vyhýbanie sa podmienkam je silne závislá od mezolimbickej dopaminergnej neurotransmisie (Reis et al, 2004); je možné, že medzi C57BL / 6 a CF-1 x 129SvEv myšami existujú rôzne striatálne muskarínové expresné hustoty expresie AChR, ktoré môžu byť ďalej amplifikované konštitutívnymi génovými deléciami M4AChR.

Aj keď je lákavé vyvodiť záver, že haloperidol diferencovane ovplyvňoval vyhýbanie sa odpovedi u myší M4 - / - v porovnaní s myšami M2 / M4 - / -, treba poznamenať, že vyhýbanie sa odpovedá pri M4 - / - na pozadí C57Bl / 6 sa výrazne líšilo od Myši M2 - / - na pozadí C57Bl / 6, ale nie z ich kontrol WT. Podobne sa myši M2 - / - na pozadí C57Bl / 6 nelíšili od kontrol WT. Účinky haloperidolu na reakciu na vyhýbanie sa teda nelíšili medzi myšami M2 / M4 - / - a M4 - / -, čo potvrdzuje, že antipsychotická účinnosť haloperidolu nie je sprostredkovaná M4AChR. To zodpovedá väzbovej a funkčnej aktivite haloperidolu. Rozdiel v účinnosti haloperidolu medzi myšami M4 - / - a M2 / M4 - / - môže skôr súvisieť s rozdielmi v bazálnej dynamike dopamínu sprostredkovanej kmeňom pozadia, ako je uvedené vyššie (He a Shippenberg, 2000).

Uvádza sa, že klozapín vykazuje čiastočnú agonistickú aktivitu na M2- a M4AChR; údaje tu uvedené však naznačujú, že jeho antipsychotická účinnosť nemusí súvisieť s uvádzanými parciálnymi agonistickými vlastnosťami týchto receptorových podtypov (Michal a kol., 1999; Olianas a kol., 1999; Zeng a kol., 1997). Náš profil in vitro funkčnej selektivity pre klozapín v M1 – M5AChR, získaný pomocou testu väzby GTP- y - [ 35 S], vykazoval iba mierny agonizmus M2AChR a nenaznačoval žiadny agonizmus pri M4AChR (tabuľka 1). Metodické rozdiely môžu zodpovedať rozdielom medzilabikami vo farmakológii klozapínu in vitro , ale tu uvedené údaje o podmienenom vyhýbaní naznačujú malý funkčný príspevok klozapínu M2 alebo M4AChR v tomto teste. Naše výsledky potvrdzujú predchádzajúce správy, že klozapín vykazuje vyššiu afinitu k M1AChRs ako M2- alebo M4AChRs a vykazuje čiastočnú antagonistickú aktivitu v podtype M1AChR (Bolden a kol., 1992; tabuľka 1). V poslednej dobe iná skupina hodnotila úlohu M1- a M4AChR s použitím myší M1 - / -, M4 - / - a M1 / ​​M4AChR s dvojitým knockoutom na moduláciu prepulznej inhibície (PPI) klozapínom (Thomsen) a kol., 2010). PPI je mierou senzorimotorických hradlových procesov a je spoľahlivo zistené, že je narušený pri poruchách centrálneho nervového systému, ktoré si vyžadujú pozornosť, ako je schizofrénia (Swerdlow et al, 2008). Naše zistenia v teste reagujúcom na podmienené vyhýbanie sa podporujú zistenia Thomsena a kol. (2010), v ktorých sa zdá, že genetická ablácia M4AChR nespôsobuje sprostredkovanie antipsychotických účinkov klozapínu. Klozapín vykazuje bohatý farmakologický profil, najmä v prípade monoamínových receptorov, a antipsychotické účinky klozapínu v teste podmieneného vyhýbania sa pravdepodobne nesúvisia s jeho aktivitou na M2- alebo M4AChR. Naše údaje tiež naznačujú, že N- desmetylclozapín metabolitu klozapínu nevyvoláva významné účinky prostredníctvom M2 alebo M4AChR; naša štúdia však nedokázala vyhodnotiť predpokladanú agonistickú aktivitu M1AChR (Sur a kol., 2003). Je zaujímavé, že v článku Thomsen a kol. (2010) autori ukázali, že signalizácia M4AChR hrá úlohu pri sprostredkovaní antipsychotických účinkov agonistického xanomelínu preferujúceho M1- / M4AChR, ktorý má podobný farmakologický podpis ako BuTAC.,

V súlade s atypickým antipsychotickým profilom BuTAC preukázal dobrú separáciu dávky na zníženie reakcie na vyhýbanie sa reakcii (tj opatrenie účinnosti) vs. náchylnosti na vznik zlyhania úniku (tj opatrenia vedľajšieho motorického účinku), aj keď zlyhanie úniku sa pozorovalo pri vyšších dávkach v myši na zmiešanom pozadí CF-1 x 129SvEv. Celkovo možno povedať, že terapeutický profil BuTAC v štúdiách naznačuje, že účinnosť pri CAR nebola pravdepodobne obmedzená neselektívnymi motorickými alebo sedatívnymi účinkami pozorovanými u silných blokátorov dopamínu D2, ako je haloperidol. Atypický terapeutický profil BuTAC (a xanomelín zo správ z literatúry) naznačuje, že antipsychotické lieky sprostredkované agonistami mAChR môžu mať menej pravdepodobné nežiaduce motorické vedľajšie účinky ako v súčasnosti dostupné neuroleptiká (Rasmussen a kol., 2001; Shannon a kol., 2000; Stanhope a kol., 2001). Nedávno sa však uvádza, že knockoutované myši M4AChR vykazujú oslabenú kataleptickú odpoveď na antipsychotiká, čo naznačuje, že agonista M4AChR môže vyvolať motorické vedľajšie účinky (Fink-Jensen a kol., 2011). Takéto zistenia zdôrazňujú potrebu podmienených knockoutovaných zvierat, pretože konštitutívne genetické modifikácie môžu spôsobiť určité zmeny neurodevelopmentu, ktoré v súčasnosti nemožno vylúčiť. Nebolo hlásené, že M4AChR-pozitívne alosterické modulátory spôsobujú u hlodavcov katalepsiu, ale definitívne údaje očakávajú klinické štúdie so selektívnymi nástrojmi. Tento vzorec výsledkov naznačuje, že agonizmus mAChR prednostne moduluje dopamínovú signalizáciu v mezolimbických (A10) dráhach, skôr ako nigrostriatálne (A9) dráhy, o ktorých sa predpokladá, že sprostredkujú extrapyramidálne vedľajšie účinky spojené s účinnými blokátormi DA D2.

Neuroanatomický lokus, ktorým mAChRs a najmä M4AChRs ovplyvňujú dopaminergnú aktivitu, nie je úplne objasnený, ale hromadiace sa dôkazy naznačujú silný vzťah s funkciou receptora dopamínu D1 (Ince a kol., 1997; Zhang a kol., 2002). Konkrétne myši s knockoutovanými receptormi M4 vykazujú zvýšenú citlivosť na stimulačné účinky agonizmu Dl (Gomez a kol., 1999b). M4AChR je dominantný podtyp muskarínového receptora exprimovaný v striate a je lokalizovaný na cholinergných interneurónoch a spolu s receptormi D1 na neurónoch GABAergickej projekcie (Bernard a kol., 1992; Weiner a kol., 1990; Yan a kol., 2001). V súlade s týmito neuroanatomickými pozorovaniami vykazujú myši s deficitom M4AChR významne zníženú schopnosť neselektívneho muskarínového agonistu oxotremorínu potenciovať draslíkom stimulované uvoľňovanie striatálneho dopamínu (Zhang et al, 2002). Selektívna a podmienená genetická delécia M4AChR z buniek exprimujúcich D1 v striatu navyše viedla k strate muskarínového agonistom sprostredkovaného zvratu amfetamínom stimulovanej aktivity u myší (Dencker a kol., 2011). Keďže receptory D1 spočívajú na dendritických chrbticiach v kľúčových frontálnych kortikálnych štruktúrach a modulujú integritu kortikálnych sietí (Arnsten, 2011), predpokladá sa, že úzke neuroanatomické a funkčné vzťahy medzi receptormi M4 a D1 ovplyvňujú kortikálnu aj striatálnu funkciu, kľúčové substráty, ktoré sú pri schizofrénii dysregulované. Nedávno sa však ukázalo, že sa zdá, že receptory M4AChR a D1 sa kolokalizujú v kortikálnych oblastiach (Dencker a kol., 2012).

Patofyziológia psychózy a iných psychiatrických porúch sa môže podieľať na nerovnováhe medzi dopaminergnými a cholínergickými neurotransmiterovými systémami v mezolimbických a frontokortikálnych oblastiach. Súhrnné dôkazy naznačujú, že modulácia týchto systémov prostredníctvom mAChR môže byť bezpečnou a účinnou alternatívou k v súčasnosti dostupným liekom (Ma a kol., 2008; Rasmussen a kol., 2001; Shekhar a kol., 2008). Ako je tu demonštrované, BuTAC účinne inhiboval reakciu podmieneného vyhýbania sa myši, zvierací model predpovedajúci klinickú antipsychotickú účinnosť bez toho, aby spôsobil zlyhanie úniku. Súčasné údaje tiež naznačujú, že antipsychotické účinky BuTAC sú sprostredkované prevažne, aj keď nie výlučne, signalizáciou M4AChR. Hustá lokalizácia M4AChR v hipokampu, mozgovej kôre a striatu naznačuje, že tento podtyp mAChR môže byť užitočný ako farmakologický cieľ pri liečbe schizofrénie a iných psychiatrických porúch (Ma a kol., 2008). Posledné postmortálne nálezy naznačujú, že dysregulácia M4AChR sa môže prenášať na kliniku, pretože sa zistilo, že podskupina schizofrenických pacientov má nedostatky v expresii M4AChR (Scarr et al, 2007). Okrem zobrazovania plnej a čiastočnej agonistickej aktivity na M2- a M4AChRs, BuTAC tiež pôsobí ako účinný čiastočný agonista na M1AChR (tabuľka 1 a obrázok la, b, a d). V súlade s týmto profilom aktivity sa BuTAC správa aj ako antagonista v M1-, M3-, M4- a M5AChR (tabuľka 1 a obrázky la a c – e), čo môžu tiež prispieť k jeho behaviorálnemu profilu. V súčasnosti sa skúma hodnotenie týchto ďalších podtypov mAChR pri sprostredkovaní antipsychotických účinkov BuTAC. Farmakologický profil BuTAC podporuje ďalšie hodnotenie M4AChR ako cieľovej látky liečiva pre psychotické poruchy a môže predstavovať inovatívny terapeutický prístup pri liečbe psychózy s malým potenciálom pre kognitívne poškodenie alebo motorické vedľajšie účinky.

FINANCOVANIE A ZVEREJNENIE INFORMÁCIÍ

Všetci autori boli v čase vykonávania experimentov zamestnancami Eli Lilly na plný úväzok a všetky štúdie zahrnuté v tomto rukopise boli finančne podporované Eli Lilly. Autori vyhlasujú, že okrem príjmov získaných od ich zamestnávateľov primárnych farmaceutických spoločností, žiadny autor nezískal za posledné tri roky žiadnu ďalšiu finančnú podporu alebo kompenzáciu od žiadneho jednotlivca alebo inej právnickej osoby za výskum alebo profesionálne služby.