Molekulárna analýza génov spôsobujúcich recesívne demyelinizačné ochorenie uhlík-marie-zub v Japonsku | časopis ľudskej genetiky

Molekulárna analýza génov spôsobujúcich recesívne demyelinizačné ochorenie uhlík-marie-zub v Japonsku | časopis ľudskej genetiky

Anonim

predmety

  • Demyelinizačné choroby
  • Genetika chorôb

abstraktné

Choroba Charcot – Marie – Tooth (CMT), najbežnejšia dedičná neuropatia, bola rozdelená na dva typy, demyelinizačný a axonálny. Predtým sme analyzovali gény spôsobujúce dominantné demyelinizačné CMT u 227 japonských pacientov na identifikáciu genetického pozadia, ale nenašli sme žiadne mutácie u 110 pacientov. Na vyšetrenie frekvencie pacientov s autozomálne recesívnymi demyelinizačnými mutáciami CMT (CMT4) sme analyzovali kódujúcu sekvenciu známych kauzatívnych génov CMT4 u 103 demyelinizujúcich pacientov s CMT, okrem siedmich pacientov z dôvodu nedostatku vzoriek. Našli sme jedného pacienta s mutáciou GDAP1 , jedného pacienta s mutáciou MTMR2 , dvoch pacientov s mutáciami SH3TC2 / KIAA1985 a troch pacientov s mutáciami FGD4 . Dvanásť pacientov vrátane piatich predtým detegovaných pacientov s mutáciami PRX bolo diagnostikovaných ako CMT4, čo predstavuje 5, 5% demyelinizujúcej CMT. U pacienta s mutáciou GDAP1 bola genomickým sekvencovaním detegovaná iba jedna mutácia zdedená po jeho matke. Analýza pomocou polymerázovej reťazovej reakcie s reverznou transkripciou s použitím messengerovej RNA (mRNA) z leukocytov pacienta odhalila neprítomnosť transkripcie z alely zdedenej od jeho otca, čo naznačuje existenciu jednej ďalšej mutácie vedúcej k nedostatku alebo destabilizácii mRNA. Väčšina pacientov nesúcich mutácie génu CMT4 sa vyznačuje skorým nástupom a pomaly progresívnymi symptómami, ktoré môžu súvisieť s funkciou mutantov. Nemôžeme identifikovať gén spôsobujúci ochorenie u 96 pacientov (približne 45%). Na identifikáciu príčinného génu v japonskej CMT sa budú vyžadovať ďalšie štúdie vrátane štúdií so sekvenátormi budúcej generácie.

úvod

Choroba Charcot – Marie – Tooth (CMT) je najbežnejšou dedičnou neuromuskulárnou poruchou s prevalenciou odhadovanou na 5–40 jedincov na každých 100 000. Postihuje sa motorické a senzorické periférne nervy a klinické znaky zahŕňajú pomaly progresívnu slabú svalovú slabosť. a zmyslové narušenie typu atrofia a rukavice. 1, 2 CMT bola tradične elektrofyziologickými štúdiami rozdelená na dva typy: demyelinizačné a axonálne typy. V poslednej dobe sa skupina, ktorá vykazuje stredné stredné rýchlosti vodivosti motorických nervov (MCV) a prekrývajúce sa demyelinizačné a axonálne CMT, označuje ako stredná CMT. 2 Viac ako 30 génov bolo identifikovaných ako gény spôsobujúce ochorenie CMT. 1, 2, 3

Na identifikáciu genetického pozadia japonskej CMT sme analyzovali gény spôsobujúce ochorenie u približne 350 pacientov; v asi 50% demyelinizujúcej CMT a 80% axonálnej CMT sme však nemohli identifikovať príčinné gény. U demyelinizačného typu je nízka prevalencia duplikácie PMP22 znakom japonských pacientov, čo pravdepodobne vedie k vysokej frekvencii pacientov s neznámou príčinou. Zdá sa, že japonskí pacienti, ktorí majú duplikáciu PMP22, majú mierne príznaky v dôsledku genetických alebo epigeneticky modifikujúcich faktorov a nevyužívajú lekárske služby, čo odráža nízku prevalenciu. 4

V tejto štúdii sme analyzovali gény, ktoré spôsobujú autozomálne recesívne demyelinizačné CMT (CMT4), aby sa ďalej objasnilo genetické pozadie japonských pacientov.

výsledok

Analyzovali sme gény spôsobujúce CMT4 u 103 pacientov od 220 pacientov s demyelinizáciou CMT, ktorí nemali mutácie v génoch spôsobujúcich CMT1 alebo CMTX1 (obrázok 1). Zistilo sa, že sedem prípadov nesie génové mutácie spôsobujúce CMT4: jeden prípad s mutáciou GDAP1 , jeden prípad s mutáciou MTMR2 , dva prípady s mutáciami SH3TC2 / KIAA1985 a tri prípady s mutáciami FGD4 . Tabuľka 1 ukazuje typ mutácie a klinické informácie o každom pacientovi. Zistili sme 12 prípadov mutácie v CMT4 génoch vo všetkých, vrátane piatich prípadov, ktoré nesú mutácie PRX, ktoré boli predtým hlásené, 4, 15, 16, čo predstavuje 5, 5% všetkých pacientov s demyelinizáciou CMT (tabuľka 2).

Tabuľka v plnej veľkosti

Tabuľka v plnej veľkosti

Pacient 1 nesie heterozygotnú GDAP1 c.571C> T (p.R191 *) mutáciu v exóne 4. Jeho matka bola tiež heterozygotnou mutáciou, ale nebola ovplyvnená. Aby sa našla ďalšia mutácia na alele zdedenej od jeho otca, uskutočnila sa analýza RT-PCR. Extrahovali sme mRNA z leukocytov pacienta 1, jeho matky a zdravej kontroly. Amplifikovali sme fragment 1178-bp z c.-63 na c. * 38 GDAP1 a našli sme dva hlavné pásy na elektroforéze na agarózovom géli vo vzorkách z kontrolnej skupiny, matky a pacienta 1 (obrázok 2). Sekvencia každého pásu bola stanovená po subklonovaní a všetky transkripty boli klasifikované do troch veľkostí: - 1200, 1050 a 950 bp (obrázok 3). Divoká alela produkuje tri typy transkriptov, 1, 2 a 3, alternatívnym zostrihom, ako je ukázané v kontrolných vzorkách. Jeho matka mala tri typy transkriptov z divokých a mutantných alel a dva ďalšie alternatívne zostrihané transkripty (4 a 5), ​​pravdepodobne pochádzajúce z mutantnej alely, ktorej chýba exón 4 kvôli c.571C> T v exóne 4. Pacient 1 mal štyri prepisy identické s prepismi z mutantnej alely jeho matky; pacientovi 1 však chýbala transkript 3 z mutantnej alely a transkript 6 bol prepísaný z mutantnej alely. Všetky transkripty okrem transkriptu 1 z divokej alely sú predpovedané tak, že vytvoria predčasné terminálne kodóny 5 'na posledných 50 nukleotidov predposledného exónu a budú degradované nezmyslom sprostredkovaným rozkladom. 31 Zistilo sa však určité množstvo transkriptu 2 z alely c.571C> T, čo naznačuje, že v leukocytoch pacienta 1 a jeho matky bolo produkovaných malé množstvo skráteného peptidu. RT-PCR analýzou sme nemohli nájsť žiadnu mRNA z alely zdedenej od jeho otca u pacienta, čo naznačuje, že pacient 1 pravdepodobne mal inú mutantnú alelu zdedenú od svojho otca, čo vedie k nedostatku alebo destabilizácii mRNA.

Image

Agarózová elektroforéza produktov RT-PCR s použitím mRNA z leukocytov. Cont, zdravá kontrola; M, matka pacienta 1; Pt 1, pacient 1.

Obrázok v plnej veľkosti

Image

Spájané variácie GDAP1 u pacienta 1. Prepis 1 (1178 bp) je messengerová RNA (mRNA) v plnej dĺžke. Transkript 2 (mRNA nemá 145 bp z 3 'časti exónu 2), transkript 3 (mRNA nemá celý exón 2) a transkript 6 (mRNA nemá celý exón 3) sú registrované ako variácie divokého typu. Čierne skrinky predstavujú exón 4 nesúci mutáciu c.571C> T zdedenú po jeho matke. Produkty RT-PCR GDAP1 boli subklonované do TA vektora a tieto sekvencie boli stanovené. Relatívne množstvá každého transkriptu GDAP1 boli odhadnuté počtom kolónií a sú opísané v zátvorkách.

Obrázok v plnej veľkosti

Pacientom 2 bola homozygotná mutácia MTMR2 c.1882_1885delAGAG. Táto mutácia spôsobuje posun rámca a predpovedalo sa, že bude produkovať predĺžený proteín (p.R628Pfs * 18). Jej matka bola pre mutáciu heterozygotom a od jej otca nebola k dispozícii žiadna vzorka. Nervová biopsia odhalila výskyt myelínu.

Našli sme mutácie SH3TC2 / KIAA1985 u dvoch pacientov; pacient 3 bol homozygotom mutácie c.3379C> T (p.R1127W) a pacient 4 bol homozygotom mutácie c.3511C> T (p.R1171C).

Mutácie FGD4 boli zistené u troch pacientov: pacient 5 bol homozygotom mutácie c.1888_1892delAAAGG (p.K630Nfs * 4), pacient 6 bol zložený heterozygot s c.837-2A> G a c.1132 + 1G> A mutácie a pacient 7 bol homozygot nesúci mutáciu c.837-1G> A. Predpokladá sa, že mutácie c.837-2A> G, c.1132 + 1G> A a c.837-1G> A spôsobujú abnormality zostrihu. RT-PCR analýza potvrdila, že tieto mutácie vedú k posunu rámca a predpovedalo sa, že produkujú skrátené proteíny, p.W279 * fs, p.Y355Ifs * 2 a p.E280Kfs * 23 (obrázky 4 a 5). Pacienti 5 a 6 mali podobný vplyv na súrodencov nesúcich rovnaké mutácie. Pacient 7 ukázal vzorky myelínu vo vzorkách nervovej biopsie.

Image

( a ) FGD4 c.837-2A> G mutácia u pacienta 6. ( b ) FGD4 c.1132 + 1G> A mutácia u pacienta 6.

Obrázok v plnej veľkosti

Image

FGD4 c.837-1G> Mutácia u pacienta 7.

Obrázok v plnej veľkosti

Všetky mutácie okrem gDAP1 c.571C> T (p.R191 *) mutácie 32 boli nové a neboli detekované v 100 zdravých kontrolách.

diskusia

Vykonali sme rozsiahly genetický skríning u 220 pacientov s demyelinizáciou CMT a zistili sme 93 pacientov s CMT1 (42, 3%), vrátane 53 pacientov s duplikáciou PMP22 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 19 pacientov s CMTX 8, 13, 14 (8, 6%) a 12 pacientov s CMT4 4, 15, 16 (5, 5%) (tabuľka 2). Pokiaľ ide o frekvenciu autozomálne recesívnej CMT, v literatúre je málo štúdií. 3 Sapora a kol. 3 analyzovali 381 pacientov s demyelinizujúcou CMT a našli 7 pacientov s CMT4 (1, 8%). V oblasti Stredozemného mora a na Strednom východe sa uvádza, že autozomálne recesívna CMT je častejšia ako v Severnej Amerike a Európe kvôli vysokému percentu sobášov. 33, 34 Zistili sme 12 pacientov s mutáciami v génoch CMT4 a deväť z nich boli homozygotmi pre mutáciu. Percentuálny podiel CMT4 môže odzrkadľovať percento sobášnych manželstiev (3, 88%) v Japonsku: nižšie ako percento (20% až viac ako 50%) v oblasti Stredozemného mora a na Blízkom východe a vyššie ako toto percento (<1, 0%) v USA., 35, 36, 37 Stále existuje 96 pacientov (43, 6%) s neznámymi príčinami.

GDAP1 je chvostom ukotvený proteín vonkajšej mitochondriálnej membrány a reguluje dynamiku mitochondriálnej siete indukciou mitochondriálnej fragmentácie. 17, 38 Mutácií v GDAP1 sú zodpovedné za najčastejšiu recesívnu formu demyelinizačnej a axonálnej CMT. U pacienta 1 sme našli heterozygotnú mutáciu p.R191 *, ale nenašli sme žiadnu inú mutáciu. Mutácia p.R191 * bola hlásená ako jedna z mutácií detegovaných v heterozygote zlúčeniny 32, čo naznačuje, že pacient 1 mal mať jednu alšiu mutáciu na alele zdedenej od svojho otca. RT-PCR analýza neodhalila žiadny transkript z alely od jeho otca. Určili sme sekvenciu promótorovej oblasti a poly-A ďalšie signály (údaje nie sú uvedené), ale nenašli sme žiadne mutácie. Pacient má pravdepodobne neznámu mutáciu v alele zdedenej od svojho otca, čo vedie k nedostatku alebo destabilizácii mRNA. U pacienta sa v prvom roku života vyvinula hypotónia a deformita chodidla.

MTMR2 kóduje proteín, ktorý patrí do rodiny myotubularínov, ktorý je charakterizovaný prítomnosťou fosfatázovej domény, a môže hrať významnú úlohu pri recyklácii nervovej membrány, pri prenose membrán a endo- a exocytických procesoch. 18, 19 Zistili sme homozygotnú mutáciu c.1882_1885delAGAG u pacienta 2. Mutácia c.1882_1885delAGAG sa nachádza v poslednom exóne a predpokladá sa, že unikne nezmyslom sprostredkovanému rozkladu a vytvorí predĺžený peptid, p.R628Pfs * 18. Väčšina pacientov s mutáciami MTMR2 má príznaky v skorom detstve a má následný ťažký priebeh; 18, 39 však pacient 2 mal vo veku 13 rokov mierne klinické príznaky. Mutantný proteín p.R628Pfs * 18 môže byť čiastočne funkčný, a preto môže spôsobovať iba mierne príznaky. Výskyty myelínu a redundantné slučky myelínu sú charakteristické nálezy pri mutácii MTMR2, MTMR13 a FGD4 . 2, 18, 23 Pacient 2 odhalil tieto charakteristické obrázky nervovej biopsie (údaje nie sú uvedené).

SH3TC2 / KIAA1985 hrá významnú úlohu v membránovom obchodovaní a je potrebný pre správnu myelinizáciu a integritu Ranvierovho uzla. 21 Zistili sme homozygotné missense SH3TC2 / KIAA1985 mutácie u dvoch pacientov: mutácia c.3379C> T (p.R1127W) u pacienta 3 a mutácia c.3511C> T (p.R1171C) u pacienta 4. Vzorky z oboch rodín neboli k dispozícii a nemohla sa vykonať segregačná analýza. Avšak mutácie c.3379C> T a c.3511C> T neboli detekované u 100 zdravých kontrol. R1127 a R1171 sú konzervatívne zvyšky aminokyselín a skóre zo softvérovej analýzy PolyPhen-2 (//genetics.bwh.harvard.edu/pph2) na predpovedanie funkčného účinku p.R1127W a p.R1171C bolo 1, čo naznačuje, že SH3TC2 Varianty KIAA1985 pravdepodobne poškodzovali mutácie spôsobujúce ochorenie. Klinický fenotyp spojený s mutáciami SH3TC2 / KIAA1985 je variabilný a väčšinou sa vyznačuje skorým nástupom a častou komplikáciou skoliózy. 40, 41, 42 Baets a kol. 40 uvádza, že SH3TC2 / KIAA1985 bol najčastejšie mutovaným recesívnym génom v CMT, ktorý sa prejavil symptómami v prvom roku života v západných krajinách a na Blízkom východe. Nástupný vek našich prípadov bol detský, ale nemal skoliózu. Pacient 3 vykazoval progresívne poruchy chôdze od 4 rokov veku. Pacient 4 mal v detstve poruchu chôdze a vykazoval pomaly progresívne príznaky a v sedemdesiatych rokoch sa mu vyvinula strata sluchu a dýchacie ťažkosti.

Frabin kódovaný FGD4 má pravdepodobne kľúčovú úlohu v proliferácii, polarizácii, prežívaní Schwannových buniek a myelinačných procesoch. 23, 24, 29 Zistili sme mutácie FGD4 v troch prípadoch: homozygotná mutácia c.1888_1892delAAAGG (p.K630Nfs * 4) u pacienta 5, zlúčenina heterozygotná c.837-22> G (p.W279 * fs) a c.1132. + 1G> A (p.Y355Ifs * 2) mutácie u pacienta 6 a homozygotná c.837-1G> A (p.E280Kfs * 23) mutácie u pacienta 7. Predpokladá sa, že všetky štyri mutácie vytvoria predčasné terminálne kodóny 5 ' na posledných 50 nukleotidov predposledného exónu a mal by byť degradovaný nezmyslom sprostredkovaným rozkladom. 31 V experimente s analýzou RT-PCR boli detegované transkripty z c.837-2A> G a c.1132 + 1G> A mutantných alel v leukocytoch od pacienta 6 v jednej tretine transkriptov z divokej alely v kontrolných leukocytoch. Prepisy z mutantnej alely c.837-1G> A v leukocytoch od pacienta 7 boli tiež znížené na dve tretiny oproti divým alelám v kontrolných leukocytoch. Preto sa predpokladá, že tieto mutácie budú produkovať určité množstvo skrátených peptidov (obrázky 4 a 5). Kvantitatívne a kvalitatívne abnormality pri FGD4 môžu byť spojené s patogenézou u pacientov. Pacient 7 ukázal, že myelín vykazuje na nervovej biopsii. Traja pacienti vykazovali nástup do detstva a stredne ťažké a pomaly progresívne príznaky ako v iných hlásených prípadoch. 43

Systematicky sme analyzovali 220 japonských pacientov s demyelinizujúcou CMT (7 prípadov bolo vylúčených z dôvodu nedostatku vzoriek) a našli sme iba 12 pacientov, ktorí nesú autozomálne recesívne demyelinizujúce mutácie génu CMT. Autozomálne recesívne demyelinizujúce CMT mutácie sa pravdepodobne správajú stratou funkcie. Preto nemôžeme vylúčiť možnosť, že pacienti môžu mať mikrodeleciu kauzatívnych génov, ktorá by sa nezistila z ordinálnej analýzy pomocou PCR. Naša štúdia naznačila, že analýza RT-PCR je užitočná na potvrdenie abnormalít zostrihu mutantnými alelami a na skríningové génové mutácie, ako je ukázané u pacienta 1. Na identifikáciu príčinného génu, analýzu pomocou sekvencerov 44 budúcej generácie a analýzy tkanív exprimujúcich gény odvodené z indukovaných pluripotentných kmeňových buniek by boli účinnými nástrojmi.

Väčšina pacientov s mutáciami génu CMT4 má na začiatku a pomaly progresívne symptómy, na rozdiel od skorých nástupov a rýchlo progresívnych symptómov u pacientov s dominantnou génovou mutáciou. 15, 45 Tieto rozdiely môžu súvisieť s typom mutanta, ktorý pôsobí stratou alebo ziskom funkcie.