Microrna-375 sa zameriava na aeg-1 pri hepatocelulárnom karcinóme a potláča rast buniek rakoviny pečene in vitro a in vivo | onkogén

Microrna-375 sa zameriava na aeg-1 pri hepatocelulárnom karcinóme a potláča rast buniek rakoviny pečene in vitro a in vivo | onkogén

Anonim

abstraktné

Predpokladá sa, že mikroRNA (miRNA) majú základné úlohy pri tumorigenéze a majú veľký potenciál na diagnostiku a liečbu rakoviny. Úloha miRNA v hepatocelulárnej karcinogenéze však stále nie je úplne objasnená. Skúmali sme aberantne exprimované miRNA zapojené do hepatómu porovnaním expresných profilov miRNA v rakovinových hepatocytoch s normálnymi primárnymi ľudskými hepatocytmi a 37 dysregulovaných miRNA sa skrínovalo dvojnásobnou zmenou s významným rozdielom ( P <0, 05). Zhluková analýza založená na 13 miRNA so zmenami viac ako 15-krát ukázala, že vzorce expresie miRNA medzi rakovinovými a normálnymi hepatocytmi boli zreteľne odlišné. Medzi 13 miRNA sme zistili, že miR-375 bol významne znížený v tkanivách a bunkových líniách hepatocelulárneho karcinómu (HCC). Nadmerná expresia miR-375 v bunkách rakoviny pečene znížila proliferáciu buniek, klonogenitu, migráciu / inváziu a tiež indukovala zastavenie G1 a apoptózu. Aby sme odhalili molekulárny mechanizmus fenotypu sprostredkovaného miR-375 v hepatómových bunkách opísaných vyššie, skúmali sme predpokladané ciele pomocou nástrojov bioinformatiky a zistili sme, že gén-1 so zvýšenou hladinou astrocytov (AEG-1) je potenciálnym cieľom miR-375. Potom sme demonštrovali, že miR-375 sa viazal priamo na 3'-neprekladanú oblasť AEG-1 a inhiboval expresiu AEG-1. Kvantitatívna reverzná transkriptáza-PCR TaqMan a analýza westernovým prenosom ukázali, že expresia miR-375 nepriamo korelovala s expresiou AEG-1 v tkanivách HCC. Knockdown AEG-1 pomocou RNAi v HCC bunkách, podobne ako nadexpresia miR-375, potlačil vlastnosti nádoru. Ektopická expresia AEG-1 by naopak mohla čiastočne zvrátiť protinádorové účinky miR-375. V myšacom modeli by terapeutické podávanie 2'- O -metyl-modifikovaných miR-375 mimetov konjugovaných s cholesterolom (Chol-miR-375) mohlo významne potlačiť rast xenoimplantátov hepatómu u nahých myší. Na záver naše zistenia naznačujú, že miR-375 sa zameriava na AEG-1 v HCC a potláča rast buniek rakoviny pečene in vitro a in vivo a zdôrazňujú terapeutický potenciál miR-375 pri liečbe HCC.

úvod

Hepatocelulárny karcinóm (HCC) je celosvetová malignita bez ideálne cielených terapií. Naliehavo potrebné sú štúdie zamerané na definovanie mechanizmov spojených s heparokarcinogenézou, identifikáciu nových diagnostických biomarkerov a vývoj účinných terapeutických zásahov pri HCC (Santamaria et al., 2007).

MikroRNA (miRNA) sú malé nekódujúce RNA, o ktorých sa predpokladá, že majú základné úlohy v karcinogenéze. Vďaka nedokonalému doplnku na zacielenie transkriptov mRNA môže miRNA posttransskripčne regulovať viac cieľových génov, a tak funguje ako molekulárny „reostat“ (Baek et al., 2008). Zmeny expresie miRNA môžu modulovať kľúčové bunkové procesy zapojené do tumorigenézy a vyhodnotenie zmien expresie miRNA by mohlo poskytnúť pohľad na základné mechanizmy tvorby a progresie nádoru (Braconi a Patel, 2008). Expresné vzorce miRNA sa zdajú byť tkanivovo špecifické a sú v diagnostike rakoviny presnejšie ako profilovanie založené na mRNA (Lu et al., 2005). Terapeutická modulácia miRNA môže navyše ovplyvniť viacero cieľových génov súčasne, aby sa dosiahli vynikajúce klinické prínosy (Kota a kol., 2009). Preto miRNA môžu mať veľký potenciál v diagnostike a liečbe rakoviny. Počas niekoľkých posledných rokov niekoľko štúdií uviedlo niektoré dôležité aberantné profily expresie miRNA v tkanivách HCC v porovnaní so zodpovedajúcimi nezhubnými tkanivami a zistilo sa viac špecifických dysregulovaných miRNA asociovaných s vývojom HCC (Murakami et al., 2006; Gramantieri et al., 2007; Meng a kol., 2007; Budhu a kol., 2008; Huang a kol., 2008; Jiang a kol., 2008; Ladeiro a kol., 2008; Varnholt a kol., 2008). Úlohy dysregulovaných miRNA v HCC však stále nie sú úplne objasnené.

Ako relatívne nový gén sa gén-1 so zvýšenou hladinou astrocytov (AEG-1) ukázal ako dôležitý onkogén vo viacerých aspektoch vývoja a progresie rakoviny (Hu et al., 2009). Nadmerná expresia AEG-1 sa pozorovala v melanóme (Kang a kol., 2005), glióme (Kang a kol., 2005), neuroblastóme (Lee a kol., 2009) a karcinómoch prsníka (Li a kol., 2008)., prostaty (Kikuno a kol., 2007), pažeráka (Yu a kol., 2009), žalúdka (Jian-bo a kol., 2011) a pečene (Yoo a kol., 2009), čo korelovalo so zlými klinickými výsledkami., Uvádza sa, že AEG-1 bol nadmerne exprimovaný v> 90% ľudského HCC v porovnaní s normálnymi pečeňami a mal ústrednú úlohu pri regulácii rôznych aspektov patogenézy HCC (Yoo a kol., 2009). Mechanizmus upregulácie AEG-1 však ešte nebol úplne objasnený.

Je zaujímavé, že AEG-1 je predpokladaný cieľ miR-375, ako to predpovedá TargetScan (online softvér poskytovaný MIT na predpovedanie cieľov miRNA, //www.targetscan.org/). MiR-375 bola pôvodne hlásená ako ostrovčeková špecifická miRNA a reguluje vylučovanie inzulínu (Poy et al., 2004). Znížená expresia miR-375 sa však zistila pri rakovine pankreasu (Lee a kol., 2007) a karcinómoch hlavy a krku (Avissar a kol., 2009), žalúdka (Tsukamoto a kol., 2010) a pečene (Ladeiro). a kol., 2008; Liu a kol., 2010). MiR-375 by mohol negatívne regulovať PDK1 a 14-3-3ζ v žalúdočných karcinómoch, znižovať životaschopnosť a indukovať apoptózu buniek karcinómu žalúdka (Tsukamoto et al., 2010). Pokiaľ ide o rakovinu pečene, bolo hlásené, že miR-375 je downregulovaný v tkanivách HCC a cieľový proteín asociovaný s ano (YAP) (Liu et al., 2010). Liu a kol. (2010) zistili, že miR-375 by mohol inhibovať proliferáciu a inváziu HCC buniek in vitro pomocou MTT a testu hojenia rán. Funkcie a mechanizmy miR-375 zahrnuté v HCC však nie sú úplne objasnené a terapeutická aplikácia miR-375 nebola uvedená.

V tejto správe sme identifikovali špecifické aberantné profilovanie expresie miRNA v HCC porovnaním profilov expresie miRNA v rakovinových hepatocytoch s normálnymi primárnymi ľudskými hepatocytmi. Ďalej sme skúmali miR-375, jednu z najviac regulovaných miRNA, aby sme preskúmali jej funkcie a mechanizmy pri hepatogenéze. Ukázali sme, že miR-375 cielil onkogén AEG-1 v HCC a reexpresia miR-375 potláčala rast buniek rakoviny pečene in vitro a in vivo .

výsledok

MiRNA sa exprimovali rozdielne medzi rakovinovými a normálnymi hepatocytmi

Profily expresie obsahujúce 723 ľudských miRNA sa stanovili v siedmich hepatómových bunkových líniách a troch prípadoch normálnych primárnych ľudských hepatocytov (PHHC) s použitím súboru ľudských miRNA (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Údaje z mikročipov boli uložené vo verejnej databáze NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, prístupové číslo Gene Expression Omnibus, GSE20077). Expresie miRNA rakovinových hepatocytov sa porovnávali s expresiami normálnych hepatocytov a 37 dysregulovaných miRNA sa skrínovalo dvojnásobnou zmenou s významným rozdielom ( P <0, 05). Ako je uvedené v tabuľke 1, v HCC bolo deväť upregulovaných miRNA a 28 downregulovaných miRNA, z ktorých miR-221 a miR-99b boli najexprimovanejšie miRNA, zatiaľ čo miR-375, miR-192, miR-146b-5p, miR -885-5p, miR-122 * a miR-122 boli zaznamenané pre svoje najväčšie zmeny zníženej expresie. Celkom 13 miRNA so zmenami v priebehu 15-násobku sa analyzovalo zhlukovaním, ktoré vykazovalo významne odlišný profil expresie medzi rakovinovými a normálnymi hepatocytmi (obrázok 1A). Na overenie údajov z mikročipu sa použila kvantitatívna reverzná transkriptáza-PCR TaqMan (qRT-PCR) na kvantifikáciu expresie miR-221 a miR-375 v hepatómových bunkových líniách a PHHC (obrázok 1B). Výsledok mikročipu vykazoval dobrú konzistenciu s TaqMan qRT-PCR (obrázok 1C). Tieto aberantne exprimované miRNA môžu poskytnúť informácie o patogenéze HCC, a preto sa môžu použiť na diagnostiku.

Tabuľka v plnej veľkosti

Image

Dysregulované miRNA v hepatokarcinóme. ( A ) Výsledok zhlukovania siedmich hepatómových bunkových línií a troch prípadov normálneho PHHC na základe 13 miRNA s viac ako 15-násobnými zmenami expresie medzi týmito dvoma bunkovými skupinami. Červená označuje vysoké úrovne expresie, zatiaľ čo čierna a zelená znamenajú nižšiu a takmer neprítomnú expresiu. Dendrogramy ukazujú koreláciu medzi skupinami buniek. V dolnom stĺpci označujú červené a modré obdĺžniky bunkové línie rakoviny pečene a PHHC. Hodnoty expresie boli v rozsahu od -5 do 5, ako je znázornené na paneli farebných rozsahov. ( B ) relatívna expresia miRNA meraná pomocou TaqMan qRT – PCR. Jasne červený pruh označuje bunkové línie hepatómu; tmavozelená do PHHC. Ba predstavuje miR-221, zatiaľ čo Bb predstavuje miR-375. Expresia miR-221 z PHHC-3 alebo miR-375 z SMMC-7721 bola označená ako 1. ( C ) Analýza konzistencie medzi údajmi z mikročipu a výsledkami TaqMan qRT – PCR.

Obrázok v plnej veľkosti

MiR-375 je v HCC regulovaný

Medzi downregulovanými miRNA miR-375 vzbudil náš záujem, pretože sa predpokladalo, že sa zameriavajú na AEG-1, ktorý má dôležité úlohy v hepatokarcinogenéze (Yoo et al., 2009). Zistili sme, že miR-375 bol významne znížený v siedmich hepatómových bunkových líniách v porovnaní s normálnymi hepatocytmi (obrázok 1). Ďalej sme detegovali expresiu miR-375 v ďalších 60 pároch HCC a zhodovali sa so susednými tkanivami bez nádoru a zistili sme, že miR-375 bol tiež významne potlačený v tkanivách HCC (obrázok 2a). Je zaujímavé, že hojnosť miR-375 nepriamo korelovala s početnosťou AEG-1 (obrázky 2b a c), čo je potenciálny cieľ miR-375. Medzi miR-375 a inými klinicko-patologickými znakmi však nebola významná korelácia.

Image

Inverzný vzťah hladín expresie medzi miR-375 a AEG-1 v HCC. a ) Downregulácia miR-375 (meraná pomocou TaqMan qRT – PCR) v tkanivách HCC. ( b ) Upregulácia AEG-1 (analyzovaná westernovým prenosom a normalizovaná na základe expresie p-aktínu) v HCC. ( c ) MiR-375 nepriamo koreluje s expresiou AEG-1 ( P = 0, 004, Pearsonova korelácia).

Obrázok v plnej veľkosti

MiR-375 znižuje rast, inváziu buniek rakoviny pečene a indukuje zastavenie G1 a apoptózu

Aby sa preskúmala úloha miR-375 v HCC, boli hepatómové bunkové línie transfekované prekurzorom miR-375 (pre-miR-375) a ďalej sa použili na funkčnú analýzu. Pre optimalizáciu podmienok transfekcie potvrdila Cy3 značená pre-miR-NC (negatívna kontrola) transfekcia, že vysokú účinnosť transfekcie (asi 90%) bolo možné dosiahnuť pri koncentrácii 100 nM bez zjavnej toxicity (doplnkový obrázok S2). Pokiaľ nie je uvedené inak, všetky miRNA sa transfekovali pri koncentrácii 100 nM. Ako je znázornené na obrázku 3A, významné zvýšenie expresie miR-375 sa mohlo overiť pomocou TaqMan qRT-PCR v hepatómových bunkových líniách transfekovaných s pre-miR-375.

Image

Nádorové supresívne účinky miR-375 v hepatokarcinóme. ( A ) Relatívna expresia miR-375 detegovaná pomocou TaqMan qRT-PCR v troch bunkových líniách hepatómu transfekovaných s pre-miR-375 alebo pre-miR-NC. Priemerná expresia miRNA z NC skupiny bola označená ako 1. ( B ) nadmerná expresia miR-375 potláčala proliferáciu buniek HepG2, SK-HEP-1 a SMMC-7721. ( C ) miR-375 indukoval zastavenie G1 v bunkách HepG2. Analýza bunkového cyklu bola stanovená 72 hodín po transfekcii prietokovou cytometriou zafarbenou propidiumjodidom. Čísla nad každým histogramom označujú percento buniek vo fázach cyklu G0 – G1, S a G2 – M. ( D ) miR-375 indukovaná bunková apoptóza. Bunková apoptóza sa detegovala kombinovaným značením prietokovej cytometrie Annexin-V / propidiumjodidom v bunkách HepG2 72 hodín po transfekcii. Apoptotické hodnotenie bolo stanovené percentom počtu apoptotických buniek z celkového počtu buniek. ( E ) Nadmerná expresia miR-375 znížila klonogenitu buniek. E (a, c) ukazujú reprezentatívne výsledky tvorby kolónií a rastu nezávislého od ukotvenia na mäkkom agare s použitím uvedených klonov. Histogramy E (b, d) naznačujú, že miR-375 môže výrazne inhibovať tvorbu kolónií a bunkový rast nezávislý od ukotvenia. Relatívne percento počtu kolónií zo skupiny NC sa označuje ako 100%. ( F ) miR-375 znížil migráciu a inváziu buniek HepG2. F (a, c) predstavujú výsledky bunkovej invázie a migrácie cez membránu s veľkosťou pórov 8 μm s alebo bez Matrigelu. Histogramy F (b, d) označujú relatívne percento buniek na membráne s 8 μm pórmi s Matrigelom alebo bez neho. Relatívne percento migrujúcich alebo invazívnych buniek zo skupiny NC je označené ako 100%. * P <0, 05 a # P <0, 01.

Obrázok v plnej veľkosti

Trvalý rast buniek je charakteristickým znakom rakoviny. Nadmerná expresia miR-375 by mohla výrazne potlačiť proliferáciu hepatómových bunkových línií (obrázok 3B), zvýšiť percentuálny podiel buniek vo fáze G1 a percentuálny podiel buniek vo fáze S takmer o 10% (obrázok 3C). Obchádzanie apoptózy je ďalšou nadradenosťou nádorových buniek pre neobmedzený rast. Analýza apoptózy ukázala, že počet apoptotických buniek bol zreteľne zvýšený v bunkách HepG2 transfekovaných miR-375 (obrázok 3D). Morfologické zmeny apoptózy farbením DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) potvrdili tento výsledok (doplnkový obrázok S3). Na vyhodnotenie funkčnej úlohy miR-375 pri tvorbe nádoru sa v bunkách HepG2 merala tvorba kolónií a rast nezávislý od ukotvenia. Analýza klonogenicity ukázala, že bunky transfekované miR-375 vykazovali oveľa menej a menšie kolónie ako kontrolné transfektanty (obrázok 3E). Boli zavedené komory s priehlbinami, aby sa preskúmal vplyv miR-375 na pohyblivosť buniek. Ako je znázornené na obrázku 3F, zvýšenie expresie miR-375 by mohlo účinne potlačiť migráciu a inváziu buniek HepG2. Tieto údaje naznačujú, že miR-375 fungoval ako tumor-supresor v HCC.

MiR-375 sa zameriava na AEG-1 a AEG-1 sa podieľa na protinádorových účinkoch miR-375

Na objasnenie protinádorových účinkov miR-375 v HCC sme ďalej využili ciele miR-375. Je zaujímavé, že AEG-1 je predpokladaný cieľ miR-375 (obrázok 4a). Luciferázový test ukázal, že miR-375 by sa mohol priamo zamerať na svoje predpokladané väzobné miesto AEG-1 a viesť k potlačeniu luciferázovej expresie pLUC-AEG-1, zatiaľ čo miR-375 nemal zjavné účinky na jeho kontrolný pLUC-mutAEG-1. (Obrázok 4b). Nadmerná expresia miR-375 v bunkách HepG2 výrazne znížila hladinu mRNA a proteínov AEG-1 (obrázky 4c a e), zatiaľ čo inhibícia miR-375 v normálnych bunkách PHHC zvýšila expresiu mRNA a proteínov AEG-1 (obrázky 4d a f), Navyše miR-375 bol významne downregulovaný, zatiaľ čo AEG-1 bol upregulovaný v HCC tkanivách a medzi expresiou miR-375 a AEG-1 bola zistená významná inverzná korelácia (obrázok 2).

Image

MiR-375 sa zameriava na AEG-1 v hepatokarcinóme. a ) Predpokladané následné párovanie regiónov AEG-1 a miR-375 spoločnosťou Targetscan. ( b ) Luciferázová skúška v bunkách HepG2. Vektor pLUC-AEG-1 bol kotransfektovaný s pre-miR-375 alebo pre-miR-NC. Relatívna represia expresie luciferázy bola štandardizovaná na signál p-gal. Luciferázová aktivita v skupine pLUC-AEG-1 vykázala významné zníženie po ektopickej expresii miR-375. ( c, d ) mRNA relatívna expresia meraná pomocou SYBR Green qRT-PCR 48 hodín po transfekcii. ( c ): AEG-1 mRNA bola downregulovaná v bunkách HepG2 transfekovaných pre-miR-375. ( d ): AEG-1 mRNA bola upregulovaná v normálnych PHHC bunkách transfekovaných anti-miR-375. Priemerná expresia mRNA zo skupiny NC je označená ako 1. ( e, f ) proteín AEG-1 bol meraný analýzou westernovým prenosom 48 hodín po transfekcii. ( e ): Proteín AEG-1 bol downregulovaný v bunkách HepG2 transfekovaných pre-miR-375. ( f ): Proteín AEG-1 bol upregulovaný v normálnych bunkách PHHC transfekovaných anti-miR-375. Priemerná expresia proteínu zo skupiny NC bola označená ako 1. * P <0, 05.

Obrázok v plnej veľkosti

Aby sa potvrdilo, že AEG-1 je zapojený do protinádorových účinkov miR-375, najskôr sme umlčali expresiu AEG-1 RNAi v bunkách HepG2 (doplnkový obrázok S4). Ako je uvedené na doplnkovom obrázku S5, špecifické knockdown AEG-1 pomocou RNAi inhiboval proliferáciu buniek HepG2, klonogenicitu, migráciu / inváziu a tiež indukoval zastavenie G1 a apoptózu, čo fenoskopovalo účinky miR-375 v bunkách HepG2. Ďalej sme skúmali, či by obnova AEG-1 mohla zachrániť protinádorové účinky miR-375. Kotransfekcia pcDNA3.1-AEG-1 a pre-miR-375 v bunkách HepG2 účinne obnovila expresiu AEG-1 so zvýšenou expresiou miR-375 a čiastočne zvrátila protinádorové účinky indukované miR-375 (obrázok 5).

Image

Záchrana ektopických expresných účinkov miR-375 súčasnou nadmernou expresiou AEG-1. ( A ) Expresia proteínu AEG-1 v bunkách HepG2 kotransfektovaných s pre-miR-375 alebo pre-miR-NC a pcDNA3.1-AEG-1 alebo pcDNA3.1 s použitím Lipofectamine 2000 (Invitrogen) podľa pokynov výrobcu, ( B ) Proliferácia buniek detegovaná v bunkách HepG2 24, 48 a 72 hodín po transfekcii. ( C ) Bunkový cyklus stanovený v bunkách HepG2 72 hodín po transfekcii prietokovou cytometriou zafarbenou propidiumjodidom. Histogram udával percentuálny podiel buniek vo fázach bunkového cyklu G0 – G1, S a G2 – M. ( D ) Apoptóza buniek detegovaná Annexin-V / propidiumjodidom kombinovaná značiaca prietoková cytometria v bunkách HepG2 72 hodín po transfekcii. Apoptotické hodnotenie bolo stanovené percentom počtu apoptotických buniek z celkového počtu buniek. E (a, c) ukazujú reprezentatívne výsledky tvorby kolónií a rastu nezávislého od ukotvenia na mäkkom agare. Histogramy E (b, d) označujú relatívne percento počtu kolónií uvedených klonov. Percento kolónií z ko-transfekovanej skupiny pred-miR-NC a pcDNA3.1 sa označuje ako 100%. F (a, c) predstavujú výsledky bunkovej invázie a migrácie cez membránu s veľkosťou pórov 8 μm s alebo bez Matrigelu. Histogramy F (b, d) označujú relatívne percento buniek na membráne s 8 μm pórmi s Matrigelom alebo bez neho. Relatívne percento migrujúcich alebo invazívnych buniek z ko-transfekovanej skupiny pre-miR-NC a pcDNA3.1 sa označuje ako 100%. * P <0, 05 a # P <0, 01.

Obrázok v plnej veľkosti

Tieto výsledky naznačujú, že miR-375 potláčal expresiu AEG-1 väzbou priamo na 3'-UTR AEG-1 a negatívna regulácia AEG-1 pomocou miR-375 by mohla čiastočne prispieť k protinádorovým účinkom miR-375 zahrnutým v HCC.

MiR-375 inhibuje rast nádoru xenoimplantátov hepatómu u nahých myší

Vzhľadom na dôležité úlohy miR-375 v HCC nás upútalo potenciálne terapeutické použitie miR-375. Pretože miR-375 je významne znížená v HCC, boli na substitučnú terapiu pripravené mi'- O -metyl-modifikované miR-375 mimetiká konjugované s cholesterolom (Chol-miR-375). Tieto chemicky stabilizované miRNA mohli mať značne zlepšené farmakologické vlastnosti, ako už bolo opísané (Soutschek a kol., 2004; Petri a kol., 2009). Ukázali sme, že napodobeniny miRNA konjugované s Cy3 značené cholesterolom by mohli účinne vstúpiť do buniek SK-HEP-1 a HepG2 bez transfekčných reagencií alebo elektroporácie (obrázok 6A) a Chol-miR-375 by mohol významne zvýšiť expresiu miR-375 (doplnkový obrázok) S6a). Xenoimplantáty subkutánneho hepatómu boli stanovené v bokoch atymických holých myší pomocou buniek HepG2. Intratumorová injekcia s Chol-miR-375 by mohla významne inhibovať rast nádoru (obrázok 6B): rastové krivky nádorov ošetrených Chol-miR-375 a Chol-miR-NC sa 16. deň divergovali a priemerné násobné zvýšenie nádoru Objemy pri usmrtení vzhľadom na prvé merania v nádoroch ošetrených Chol-mir-375 boli oveľa menšie ako objemy v kontrolných nádoroch (6, 81 ± 1, 44 vs 11, 89 ± 2, 62, P = 0, 039).

Image

Podávanie Chol-miR-375 zhoršuje rast xenoimplantátov hepatómu in vivo . ( A ) Fluorescenčná mikroskopia ukázala účinnú transdukciu hepatocytov, ako je naznačené expresiou Cy3, 24 hodín po podaní miRNA napodobňovanej Cy3 značeným cholesterolom bez podania transfekčných činidiel alebo elektroporácie. Čiernobiele obrázky zobrazovali bunky v rovnakom poli za normálneho bieleho svetla. ( B ) Nádorový rast Chol-miR-375 alebo kontrolne ošetrených xenoimplantátov HepG2 u nahých myší (každý n = 8). B (a, b) ukazujú krivky rastu nádoru a priemerné násobné zvýšenie objemu nádoru pri usmrtení vzhľadom na prvé merania. Šípky označujú podávanie 1 nmol Chol-miR-375 alebo Chol-miR-NC na myš každé 4 dni sedemkrát. C (a): rez zafarbený HE (zväčšenie 400 ×). HepG2 xenoimplantáty ošetrené Chol-miR-375 mali nízky mitotický index v porovnaní s NC skupinou; šípky označujú mitotické obrázky. C (b): Graf mitotického indexu ako percento pozitívnych buniek (osem polí, tri rezy pre každý nádor). D (a): Imunohistochémia proliferačného markera Ki-67 v nádorovom tkanive naznačila, že xenoimplantáty HepG2 ošetrené Chol-miR-375 značne znížili Ki-67 pozitívne bunky; bunky s hnedým jadrovým farbením sa považujú za pozitívne na Ki-67 (zväčšenie 200 ×). D (b): Graf expresie Ki-67 ako percento pozitívnych buniek (osem polí, tri rezy pre každý nádor). ( E ) Proteín AEG-1 sa meral westernovým prenosom v resekovaných tkanivách z ošetrených nádorov. V porovnaní so skupinou ošetrenou Chol-miR-NC mali xenoimplantáty HepG2 ošetrené Chol-miR-375 významne nižšiu expresiu AEG-1. * P <0, 05.

Obrázok v plnej veľkosti

Na objasnenie bunkových mechanizmov, ktoré sú základom supresie nádoru sprostredkovaného miR-375, sa analyzovali resekované tkanivá z tých, ktoré boli ošetrené xenoštepovými nádormi, aby sa overila expresia miR-375 a AEG-1, a zmerali sa mitotický index a expresia Ki67 ako markerov proliferácie. Na konci experimentu by Chol-miR-375 mohol významne zvýšiť expresiu miR-375 (doplnkový obrázok S6B) a znížiť expresiu AEG-1 (obrázok 6E) in vivo . V súlade s vyššie uvedenými výsledkami, farbenie hematoxylínom a eozínom a Ki67 odhalilo výrazne znížený index proliferácie v nádoroch ošetrených Chol-miR-375 (obrázok 6C a D). Všetky tieto údaje naznačujú, že reexpresia miR-375 by mohla inhibovať rast buniek rakoviny pečene in vivo .

diskusia

V tejto štúdii sme identifikovali aberantne exprimované miRNA zapojené do HCC porovnaním profilov expresie miRNA v rakovinových hepatocytoch s profilmi v normálnych primárnych ľudských hepatocytoch a našli sme 37 dysregulovaných miRNA (tabuľka 1). Aj keď niekoľko výskumov uviedlo viac aberantných profilov expresie miRNA v tkanivách HCC, výsledky rôznych výskumných tímov nie sú dostatočne konzistentné (Gramantieri et al., 2008). Jedným z hlavných dôvodov tejto nekonzistentnosti je okrem variácií technologických metodík a pôvodu vzorky aj to, že pečeň je štruktúrne a funkčne heterogénny orgán pozostávajúci z rôznych typov buniek vrátane hepatocytov (parenchymálne bunky), Kupfferových buniek, Stelátových buniek, žlčových ciest. bunky, fibroblasty a zápalové bunky (Malarkey et al., 2005). Vzorky HCC od pacientov s rôznymi etiológiami majú obvykle rôzne bunkové aktivity a bunkové proporcie, čo môže viesť k artefaktu profilov miRNA. V našej štúdii sme však objavili veľa dysregulovaných miRNA v HCC, ktoré boli konzistentne hlásené predtým (ako miR-221, miR-122, miR-101, miR-194, miR-195 a miR-375 atď.). Preto použitie rakovinových a normálnych hepatocytov namiesto celých pečeňových tkanív na skríning deregulovaných miRNA nám môže pomôcť nájsť profily expresie miRNA špecifické pre rakovinové bunky.

Zistili sme, že miR-375 bol významne znížený v bunkových líniách rakoviny pečene a tkanivách HCC (obrázky 1 a 2a). Tieto výsledky sú v súlade s výsledkami, ktoré boli nedávno oznámené (Liu a kol., 2010). Tiež sme demonštrovali, že nadmerná expresia miR-375 v bunkách rakoviny pečene znížila proliferáciu buniek, klonogenicitu, migráciu / inváziu a tiež indukovala zastavenie G1 a apoptózu (obrázok 3). Pozorovania, že ektopická expresia miR-375 inhibovala proliferáciu a inváziu buniek rakoviny pečene, sú tiež identické s výsledkami publikovanými Liu et al. prostredníctvom MTT a testu hojenia rán (Liu et al., 2010). Ektopická expresia miR-375 indukovanej apoptózy v bunkách rakoviny pečene je podobná fenoménu pozorovanému v bunkách karcinómu žalúdka (Tsukamoto et al., 2010). Podľa našich najlepších vedomostí však naše pozorovania, že miR-375 môžu znižovať klonogénnu schopnosť a vyvolať zastavenie G1 buniek rakoviny pečene, neboli doteraz publikované. Preto naše údaje poskytli komplexnejšie pochopenie úlohy miR-375 pri potlačovaní nádoru počas vývoja HCC.

Predchádzajúce štúdie preukázali, že AEG-1 je nadmerne exprimovaný vo viacerých typoch rakoviny a zvyšuje proliferáciu buniek, tvorbu kolónií, inváziu, metastázy a chemorezistenciu (Emdad a kol., 2007; Hu a kol., 2009). AEG-1 funguje ako downstream mediátor transformačnej aktivity onkogénnych Ha-Ras a c-Myc a nadmerná expresia AEG-1 aktivuje signálne dráhy PI3K / Akt, NFKB a Wnt / β-katenínu (Lee et al., 2006, 2009; Yoo a kol. , 2008, 2009). Tu sme demonštrovali, že miR-375 potlačil expresiu AEG-1 väzbou priamo na 3'-UTR AEG-1 (obrázok 4) a pozorovala sa inverzná korelácia medzi expresiou miR-375 a AEG-1 v tkanivách HCC (obrázok). 2). Ukázali sme, že AEG-1 bol upregulovaný v HCC tkanivách a umlčanie AEG-1 pomocou RNAi inhibovalo nádorové vlastnosti rakovinových buniek pečene, ktoré sa podobajú nadexpresii miR-375 (obrázok 2b a doplnkový obrázok S5). Okrem toho by obnova AEG-1 mohla čiastočne zvrátiť protinádorové účinky vyvolané miR-375 (obrázok 5). Preto zvýšená regulácia AEG-1 v HCC v dôsledku deprivácie miR-375 môže aspoň čiastočne vysvetliť protinádorové účinky miR-375 zapojené do HCC. Uvádza sa tiež, že MiR-375 je zameraný na YAP v HCC (Liu a kol., 2010), PDK1 a 14-3-3ζ v karcinómoch žalúdka (Tsukamoto a kol., 2010). Jedným slovom, uvádzané ciele miR-375 a naše pozorovania naznačujú, že miR-375 by mohol regulovať viac signálnych dráh, a strata miR-375 by viedla k progresii nádoru v HCC.

Protirakovinová terapia HCC zostáva hlavnou klinickou výzvou a HCC sa často diagnostikuje v pokročilom štádiu, keď už nie je vhodná na chirurgickú resekciu alebo transplantáciu pečene. Vyššie uvedené dôkazy podčiarkujú možnosť miR-375 ako nového cieľa terapeutickej intervencie. Naše štúdie na zvieratách naznačili, že liečba pomocou Chol-miR-375 by mohla potláčať rast xenoimplantátov hepatómu u nahých myší a znižovať expresiu AEG-1 v liečených nádoroch (obrázok 6). Štúdie in vivo podporujú naše pozorovania, že miR-375 sa zameriava na AEG-1 a potláča rast buniek rakoviny pečene in vitro . Podobne Kota a kol. (2009) preukázali, že substitučná terapia miR-26a sprostredkovaná vírusom adenovírusom (AAV) miR-26a viedla k inhibícii proliferácie rakovinových buniek a poskytovala dramatickú ochranu pred progresiou choroby bez zjavnej toxicity na myšacom modeli rakoviny pečene (Kota a kol., 2009). Okrem toho sú miRNA prírodnými antisense interaktormi a ich malá veľkosť (dĺžka 23 až 24 nukleotidov) ich robí veľmi atraktívnymi pre vývoj liekov (Tili et al., 2007). Preto je systémové podávanie miR-375 dodávané 2'- O -metyl-modifikovanými oligonukleotidmi konjugovanými s cholesterolom, lentivírusovým vektorom (Scherr a kol., 2007), AAV vektormi (Kota a kol., 2009) alebo uzamknutými nukleovými kyselinami- modifikované oligonukleotidy (Vester a Wengel, 2004) sú hodné ďalšieho stanovenia protirakovinovej liečby HCC.

Na záver táto štúdia naznačuje, že miR-375 negatívne reguluje onkogén AEG-1 a inhibuje rast buniek rakoviny pečene in vitro a in vivo . Naše zistenia tiež zdôrazňujú terapeutický potenciál miR-375 pri liečbe HCC a podporujú vývoj účinných terapeutických stratégií zameraných na miR-375 (alebo jeho ciele, ako sú AEG-1 a YAP) genetickým alebo farmakologickým prístupom.

Materiály a metódy

Bunkové línie a vzorky pacientov

Bunkové línie hepatómu SK-HEP-1, HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC97-H a MHCC97-L (Li a kol., 2004) a SMMC-7721 sa kultivovali a udržiavali v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu doplnenom 100 ml / 1 fetálne hovädzie sérum, 100 IU / ml penicilínu a 100 μg / ml streptomycínu pri 37 ° C s 5% CO2. Podľa etických a inštitucionálnych usmernení a po informovanom súhlase s darcami tkanív sa odobrali vzorky (vrátane 60 párov HCC a priľahlých nádorových tkanív) od 60 pacientov s HCC, ktorí podstúpili čiastočnú hepatektómiu, a okamžite sa uložili do RNAlater (Ambion, Austin, TX, USA). Charakteristiky týchto pacientov sú opísané v doplnkovej tabuľke S1. Normálne PHHC sa izolovali použitím modifikovanej štvorstupňovej retrográdnej perfúznej techniky, ako sa uvádza skôr (Maruyama a kol., 2003; Meng a kol., 2010). Morfológie buniek bunkových línií PHHC a hepatómu použité v tejto štúdii sú uvedené na doplnkovom obrázku S1. Štúdia bola schválená miestnym výskumným etickým výborom v nemocnici Tongji na Univerzite vedy a technológie Huazhong.

Extrakcia RNA a proteínov

Súprava mirVana PARIS (Ambion) sa použila na izoláciu celkovej RNA a proteínu z rovnakých experimentálnych vzoriek.

Analýza mikročipov MiRNA

Celková RNA (100 ng) bola značená pomocou Agilent miRNA značkovacieho činidla a hybridizovaná s Agilent ľudskou miRNA maticou (V2). Obrázky sa skenovali pomocou mikročipového skenera Agilent a výsledky sa získali pomocou softvéru na extrakciu znakov Agilent. Nakoniec sa hrubé údaje o intenzite ďalej analyzovali pomocou softvéru GeneSpring10.0 (Agilent).

TaqMan qRT – PCR

Expresia zrelých miRNA bola testovaná pomocou testov TaqMan MicroRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) špecifických pre hsa-miR-221 a hsa-miR-375. Reverzná transkripčná reakcia sa uskutočňovala s použitím súpravy na reverznú transkripciu TaqMan MicroRNA (Applied Biosystems) a potom nasledovala PCR v reálnom čase s použitím TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) na Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System podľa pokynov výrobcu. RNA RUN6B sa použila ako kontrola.

Prekurzor / inhibítor MiR-375, plazmid, siRNA a transfekcia buniek

Prekurzor miR-375 so zvýšenou stabilitou (pre-miR-375), inhibítor miR-375 (anti-miR-375) a ich zodpovedajúce NC (pre-miR-NC a anti-miR-NC) boli od spoločnosti Ambion. AEG-1 (tiež známy ako MTDH) exprimujúci vektor pcDNA3.1-AEG-1 (postrádajúci 3'-UTR AEG-1), kontrolné a siRNAs AEG-1 boli pripravené tak, ako už bolo opísané (Lee et al., 2006; Zhang a kol., 2011). Bunkové transfekcie sa uskutočňovali s použitím Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podľa pokynov výrobcu.

Test bunkovej proliferácie

Bunky (5 000 na jamku) sa umiestnili na 96-jamkové doštičky a inkubovali sa pri 37 ° C. Bunková proliferácia sa hodnotila 24 hodín, 48 hodín a 72 hodín po transfekcii s použitím súpravy na bunkovú proliferáciu CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega, Madison, WI, USA).

Analýza bunkového cyklu a apoptózy pomocou prietokovej cytometrie

Na analýzu bunkového cyklu sa bunky naočkovali na 6-jamkové platne. 72 hodín po transfekcii sa bunky odobrali a fixovali v 70% etanole pri 4 ° C cez noc. Po premytí a resuspendovaní v 100 μl fosfátom pufrovaného soľného roztoku boli fixované bunky ošetrené s 50 μl RNázy (50 mg / ml) v 37 ° C počas 30 minút a zafarbené 200 μl propídiumjodidu (KeyGen Biotech. Co. Ltd., Nanjing, Čína) pri 4 ° C počas 30 minút. Cell-cycle analysis was performed using a FACSAria cell sorting system (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). For apoptosis analysis, cells seeded in 24-well plates were harvested 72 h after transfection and processed with Annexin V-fluorescein isothiocyanate/Propidium Iodide kit (KeyGen Biotech) according to the manufacturer's instructions.

Cell migration and invasion assay

The migration and invasion assay was performed by using Transwell insert chambers (6.5 mm. in diameter, 8 μm pore size, Corning, USA). For migration assay, 2 × 10 5 HepG2 transfected cells were placed into the upper chamber in serum-free medium in triplicate 12 h after transfection. The lower chamber was filled with 600 μl Dulbecco's modified Eagle medium with 10% fetal bovine serum as chemoattractant. After incubation for 24 h at 37 °C in a 5% CO 2 humidified incubator, nonmigrating cells in the upper chambers were removed by using a cotton swab, and cells migrated to the lower surface of membrane were fixed with methanol and stained with 0.1% crystal violet. Migrating cells were scored by counting at least six fields per membrane under a light microscope. The invasion activity was assayed by seeding 2 × 10 5 transfectants in serum-free medium in triplicate on transwell polycarbonate membrane inserts precoated with a layer of diluted basement membrane Matrigel (ECM gel, Sigma, St Louis, MO, USA). 600 μl Dulbecco's modified Eagle medium with 10% fetal bovine serum as chemoattractant were added to the lower chamber. After 24 h incubation, noninvading cells were removed with cotton swabs and invasive cells were fixed, stained and counted as described above.

Analysis of clonogenicity in vitro

For colony formation analysis, 24 h after transfection, 100 viable HepG2 transfectants were placed in 24-well plates and maintained in complete medium for 2 weeks. Colonies were fixed with methanol and stained with 0.1% crystal violet in 20% methanol. Anchorage-independent growth assay were performed in 24-well plates by suspending 1 × 10 3 transfected cells per well in 0.3% low melting temperature agarose (Sigma) on a 0.5% agarose base layer, both of which contained growth medium. Two weeks later, colonies were visualized by staining with 0.005% crystal violet. Triplicate wells were prepared for each transfectant and the experiment was repeated twice.

Luciferázová skúška

To verify the precise target of miRNAs, the pMIR-REPORT system (Applied Biosystems) was applied. Briefly, 55-mer double-stranded oligonucleotides containing the predicted miRNA binding sites in AEG-1 were synthesized and ligated between the SpeI and HindIII restriction sites of the pMIR-REPORT Luciferase vector to establish the pLUC-AEG-1 vector. As a control, the pLUC-mutAEG-1 plasmid was also prepared by the same method, except for the synthesized oligonucleotides containing corresponding mutated nucleotides in the seed-match sequence for miR-375. The mutated scrambling sequences were prepared by the online tool in the website //www.genscript.com/ssl-bin/app/scramble. Synthesized sequences are listed in the Supplementary Table S2. In 96-well plates, HepG2 cells were cotransfected with 0.1 μg of pLUC-AEG-1 or pLUC-mutAEG-1, 0.01 μg of pMIR-REPORT β-gal plasmid served as an internal transfection efficiency control, and pre-miR-375 or pre-miR-NC with a 50 n M final concentration. At 24 h after transfection, luciferase and β-galactosidase activities were measured using the Dual-Light System (Applied Biosystems).

SYBR Green qRT–PCR

HepG2 cells were harvested for RNA extraction 48 h after transfection. The First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Burlington, VT, USA) was applied to synthesize the first strand cDNA followed by real-time PCR using the Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG reagent (Invitrogen) according to the manufacturer's instruction. GAPDH RNA was used as a control. The primer sequences are listed in Supplementary Table S3.

Analýza Western blot

HepG2 cells were harvested for protein extraction 48 h after transfection. Protein lysates were separated by 10% SDS–polyacrylamide gel electrophoresis and then electrophoretically transferred to polyvinylidene fluoride membranes. After blocking, membranes were incubated with primary antibodies overnight at 4 °C and then with secondary antibodies for 1 h in room temperature. Band signals were visualized using an enhanced chemiluminescence kit (Pierce, Minneapolis, MN, USA) and analyzed by Quantity-One software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). The following antibodies were used: anti-AEG-1 (13860-1-AP, Protein Tech, Chicago, IL, USA), anti-β-actin (sc-47778, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA), goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase (sc-2005, Santa Cruz) and goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (sc-2004, Santa Cruz).

Pokusy na zvieratách

BALB/c athymic nude mice (male, 4–6-weeks old and 16–20 g) were purchased from Hubei Research Center of Laboratory Animal (Wuhan, China) and bred at pathogen-free conditions in Animal Center of Tongji Hospital. All animal experiments were carried out in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of Tongji Hospital. To establish hepatoma xenograft model, 4 × 10 6 HepG2 cells were suspended in 100 μl phosphate-buffered saline and inoculated subcutaneously into the flanks of nude mice. After 8 days, the transplanted nude mice were randomly divided into two groups ( n =8 each). Chol-miR-375 or NC (Chol-miR-NC) (RiboBio Co., Ltd, Guangzhou, China) was directly injected into the implanted tumor at the dose of 1 nmol (in 20 μl phosphate-buffered saline) per mouse every 4 days for seven times. Tumor volume ( V ) was monitored by measuring the length ( L ) and width ( W ) with vernier caliper and calculated with the formula V =( L × W 2 ) × 0.5.

imunohistochémia

Resected tumor tissues were fixed in 4% paraformaldehyde, embedded in paraffin, cut into 4 μm and mounted on polylysine-coated slides. Some of the sections were stained with haematoxylin and eosin following standard procedures. For Ki67 detection, the sections were deparaffinized in xylene, rehydrated in gradient alcohol and treated with 0.3% H 2 O 2 for 15 min to quenched endogenous peroxidase activity. Antigen retrieval was performed by permeation in 10 m M citric acid buffer (pH6.0) in a microwave oven for 15 min. After blocking with 2.5% normal horse serum (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) for 20 min at room temperature, the sections were incubated at 4 °C overnight in a humidity chamber with Ki67 antibody (ab15580, Abcam, Cambridge, MA, USA). The biotinylated universal secondary antibody and VECTASTAIN elite ABC reagent (Vector Laboratories) was used according to the protocols provided by the manufacturer. Subsequently, the sections were incubated with diaminobenzidine as the final chromogen and counterstained with hematoxylin. A no primary antibody control was used to rule out non-specific binding.

Štatistická analýza

All data are expressed as mean±se from three separate experiments performed in triplicate except otherwise noted. The differences between groups were analyzed by Student's t test and P <0.05 was considered to be statistically significant.

prírastky

GenBank / EMBL / DDBJ

  • GSE20077

Doplnková informácia

Word dokumenty

  1. 1.

    Doplnková informácia

    Doplňujúce informácie sprevádzajú dokument na webovej stránke Oncogene (//www.nature.com/onc)