Os mikrorna-34a / egfr hrá kľúčovú úlohu pri tumorigenéze pľúc | onkogenézy

Os mikrorna-34a / egfr hrá kľúčovú úlohu pri tumorigenéze pľúc | onkogenézy

Anonim

predmety

  • rakovina
  • Nemalobunkový karcinóm pľúc

abstraktné

MikroRNA (miRNA) sú životne dôležité pri regulácii progresie a invázie nádoru. Dysregulácia miRNA bola spojená s vývojom rôznych typov ľudských rakovín, vrátane nemalobunkového karcinómu pľúc (NSCLC). Účinok miRNA-34a (miR-34a), kľúčového regulátora supresie nádoru, na tumorigenézu NSCLC však nebol úplne rozpracovaný. Tu uvádzame, že miR-34a je významne znížená v tkanivách a bunkových líniách NSCLC, čo naznačuje, že miR-34a by mohol fungovať ako supresor tumoru pri rakovine pľúc. Tiež sme potvrdili, že receptor epidermálneho rastového faktora (EGFR) je priamym cieľom miR-34a, a naše údaje ukazujú, že siRNA knockdown EGFR môže inhibovať proliferáciu buniek, podporovať apoptózu a zastaviť progresiu bunkového cyklu. Okrem toho môže EGFR zvrátiť supresívnu funkciu nadmernej expresie miR-34a na proliferáciu a bunkovú apoptózu. Ďalej experimenty in vivo demonštrovali, že miR-34a potláča rast nádoru, a to ako v xenoimplantátovom modeli A549, tak aj v metastatických nádoroch holých myší. Celkovo naše zistenia naznačujú, že miR-34a inhibuje rast nádoru a metastázy nádoru NSCLC prostredníctvom zacielenia na EGFR.

úvod

Rakovina pľúc je celosvetovo hlavnou príčinou úmrtí súvisiacich s rakovinou a takmer 80% prípadov rakoviny pľúc je v súčasnosti klasifikovaných ako nemalobunkový karcinóm pľúc (NSCLC). 1, 2 Napriek pokrokom dosiahnutým pri liečbe NSCLC zostáva päťročné prežívanie stále veľmi nízke (pod 15%) v dôsledku recidívy ochorenia alebo metastázy. 3 Prevalencia a letalita tohto ochorenia zdôrazňuje význam skúmania mechanizmov zahrnutých v tumorigenéze NSCLC, ako aj prognózy potenciálnych terapeutických cieľov na jeho liečenie. Receptor epidermálneho rastového faktora (EGFR), považovaný za hnací gén rakoviny, má dôležitú úlohu v progresii NSCLC. 4, 5, 6 EGFR ovplyvňuje početné systémy zapojené do onkogenézy, vrátane syntézy DNA, bunkového cyklu, bunkovej proliferácie, bunkovej invázie a metastázy. 7, 8 Bol navrhnutý ako atraktívny a sľubný cieľ pre protirakovinovú liečbu. Somatické aktivačné mutácie v EGFR boli identifikované u významnej menšiny pacientov s NSCLC 10 a tieto mutácie sú spojené s ~ 70% mierou odpovede na niektoré inhibítory tyrozínkinázy EGFR (gefitinib, erlotinib a afatinib), u pacientov sa zvyčajne vyvíja progresia ochorenia po 9 až 12 mesiacoch.

Niektoré štúdie preukázali, že v terapiách rakoviny môžu byť mutácie EGFR regulované pomocou mikroRNA (miRNA). 11 MiRNA sú malé nekódujúce RNA, ktoré sa skladajú z 20–23 nukleotidov, ktoré regulujú génovú expresiu väzbou na 3'-netranslatovanú oblasť (3'-UTR) svojich cieľových mRNA. Zistilo sa, že 12 miRNA slúži ako supresory nádorov alebo onkogény u rôznych typov rakoviny a klinických prognóz. 13, 14, 15 V NSCLC sa ukázalo, že niekoľko deregulovaných miRNA, ako sú miR-34a, let-7, miR-124 a miR-154, reguluje proliferáciu buniek, apoptózu, migráciu a inváziu. 16, 17, 18, 19 Možno potláčajú nádor alebo podporujú rast nádoru.

MiR-34a, člen rodiny miR-34, sa nachádza v oblasti chromozómu lp36.23. 20 Je to tumor-supresor so stratou alebo zníženou úrovňou expresie. 21 Je dobre známe, že miR-34a môže významne potlačiť progresiu nádoru, ako napríklad pri NSCLC, rakovine prsníka 18, multiforme 22 glioblastómu, skvamocelulárnom karcinóme 24 hlavy a krku a hepatocelulárnom karcinóme. Preto je pre pochopenie molekulárneho mechanizmu tejto miRNA pri tumorigenéze nevyhnutné skúmať funkciu miR-34a a úlohu jej možných cieľových génov v NSCLC. Robíme hypotézu, že miR-34a by mal priamo regulovať EGFR alebo signalizáciu EGFR.

V tejto štúdii sme zistili, že miR-34a bol downregulovaný vo vzorkách pacientov s NSCLC a bunkových líniách NSCLC. Ďalej sme demonštrovali, že EGFR bol priamym cieľom miR-34a. Zistili sme, že miR-34a pôsobil ako dôležitý tumor-supresor v NSCLC s EGFR ako novým cieľom, in vitro aj in vivo . Naše výsledky môžu poskytnúť potenciálny molekulárny terapeutický cieľ pre ľudskú NSCLC.

výsledok

MiR-34a je v NSCLC znížená

Na vyhodnotenie expresie miR-34a v tkanivách NSCLC sme vykonali kvantitatívnu PCR v reálnom čase (qRT – PCR) na 60 vzorkách pacientov s NSCLC a zodpovedajúcich tkanivách z karcinómu. Táto analýza odhalila, že úroveň expresie miR-34a vo vzorkách tkanív NSCLC bola významne nižšia ako hladina v zodpovedajúcich vzorkách tkanív bez nádoru (obrázok la). V týchto vzorkách downregulácia miR-34a úzko súvisí s veľkosťou nádoru (obrázok 1b), ale nesúvisí s pohlavím (obrázok 1c) a patologickým štádiom (obrázok 1d). Hladina expresie miR-34a vo vzorkách tkanív z nádorov s veľkosťou> 3 cm bola významne nižšia ako vo vzorkách tkanív s veľkosťou -3 cm. Analyzovali sme tiež hladinu expresie miR-34a v bunkových líniách NSCLC. Výsledky ukázali, že v porovnaní s normálnymi bunkami bronchiálneho epitelu, BEAS-2B, miR-34a bola signifikantne znížená vo všetkých piatich bunkových líniách NSCLC (obrázok 1e). Tieto výsledky naznačujú, že down-regulácia miR-34a môže pôsobiť ako nádorový supresorový gén v NSCLC.

Image

MiR-34a je downregulovaný v tkanivách NSCLC a ľudských bunkových líniách. a ) MiR-34a je v tkanivách NSCLC znížená. b - d ) Expresia miR-34a vo vzťahu k veľkosti nádoru, pohlaviu a patologickému štádiu. ( e ) Expresia miR-34a v siedmich ľudských bunkových líniách NSCLC. Bunky BEAS-2B sa použili na porovnanie normálnych kontrol. *** P <0, 001.

Obrázok v plnej veľkosti

MiR-34a potláča proliferáciu a migráciu NSCLC

Hladina expresie miR-34a bola významne zvýšená v bunkách A549 a SPC-A1 transfekovaných mimikom miR-34a v porovnaní s normálnou kontrolnou (NC) mimickou skupinou. Bunky sa odobrali 48 hodín po transfekcii a hladiny miR-34a sa detegovali pomocou qRT-PCR analýzy, čo viedlo k ~ 400- a 100-násobnému zvýšeniu buniek A549 a SPC-A1 (obrázok 2a). Medzitým sme transfekovali inhibítorom miR-34a, hladina miR-34a bola znížená v porovnaní s NC mimickou skupinou (obrázok 2d).

Image

MiR-34a by mohol inhibovať proliferáciu buniek v bunkách NSCLC. a ) Upregulácia miR-34a po transfekcii s mimetikom miR-34a 80 nmol v bunkách A549 a SPC-A1. ( b, c ) proliferácia bunkových línií A549 a SPC-A1, meraná testom Cell Counting Kit-8 (CCK-8), po transfekcii napodobením miR-34a. ( d ) Downregulácia miR-34a po transfekcii s 120 nmol inhibítorom miR-34a v bunkách A549 a SPC-A1. ( e, f ) proliferácia bunkových línií A549 a SPC-A1, meraná pomocou testu CCK-8, po transfekcii napodobeninou miR-34a. ( g - i ) Test tvorby kolónií v bunkách A549 a SPC-A1 transfekovaných mimikom miR-34a. Každý test sa uskutočnil trojmo. * P <0, 05, ** P <0, 01 a *** P <0, 001.

Obrázok v plnej veľkosti

Skúmali sme účinok miR-34a na proliferáciu buniek NSCLC in vitro testom Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Tokio, Japonsko). Výsledky ukázali, že transfekcia mimR miR-34a významne inhibovala proliferáciu bunkových línií A549 (divoký typ EGFR), SPC-A1 a HCC827 (mutovaných EGFR) (obrázky 2b a c; doplnkový obrázok S1). Zatiaľ čo transfekcia s inhibítorom miR-34a podporovala proliferáciu bunkových línií A549 a SPC-A1 (obrázky 2e a f). Tento výsledok naznačuje, že miR-34a by mohol inhibovať proliferáciu bunkových línií NSCLC.

Na ďalšie objasnenie funkcie miR-34a sme vykonali test tvorby kolónií. Výsledky ukázali, že miR-34a by mohol významne inhibovať tvorbu kolónií v bunkách A549 alebo SPC-A1 s mimetikom miR-34a v porovnaní so skupinou NC (obrázky 2g – i).

Ďalej v bunkách A549 a SPC-A1 ovplyvnil miR-34a migračnú schopnosť, čo je významný aspekt progresie rakoviny. Uskutočnili sme hojenie rán a podrobili sa testom. V teste hojenia rán migrovali bunky A549 a SPC-A1 transfektované miR-34a mimikom smerom k rane oveľa pomalšie ako bunky NC skupiny (obrázky 3a a c). V teste transwell sa bunky, ktoré migrovali z bezsérového média v hornej komore dvojkomorovej doštičky pre kultiváciu buniek do dolnej komory za 24 hodín, fotografovali a analyzovali. Výsledky ukázali, že miR-34a môže znížiť migráciu buniek A549 a SPC-A1 (obrázky 3b a d). Tieto výsledky spoločne naznačujú, že miR-34a by mohol významne inhibovať migráciu buniek v bunkových líniách A549 a SPC-A1.

Image

MiR-34a by mohol inhibovať migráciu v bunkách NSCLC. ( a, c ) Bunky A549 a SPC-A1 transfekované mimikom miR-34a boli podrobené testu hojenia rán a obrázky boli urobené po 0 a 24 hodinách. ( b, d ) Test migrácie transwell uskutočňovaný po transfekcii buniek A549 a SPC-A1 mimetikom miR-34a. Migrované bunky boli farbené kryštálovou fialovou a fotografované. Migrované bunky sa spočítali a analyzovali. * P <0, 05, ** P <0, 01 a *** P <0, 001.

Obrázok v plnej veľkosti

MiR-34a podporuje bunkovú apoptózu a zastavuje bunkový cyklus

Aby sme preskúmali základný mechanizmus účinku, ktorý miR-34a uplatňuje na inhibíciu proliferácie rakovinových buniek, uskutočnili sme prietokovú cytometriu po transfekcii buniek A549, SPC-A1 a HCC827 s mimetikami miR-34a a mimikami NC. Analyzovali sme účinok miR-34a na bunkovú apoptózu a progresiu bunkového cyklu. Výsledky odhalili, že nadmerná expresia miR-34a významne podporovala apoptózu v bunkách A549, SPC-A1 a HCC827 v porovnaní so skupinou NC (obrázky 4a a c; doplnkové obrázky S2a a b). Pokiaľ ide o bunkový cyklus, transfekcia mimR miR-34a v bunkách A549, SPC-A1 a HCC827 by mohla čiastočne inhibovať progresiu bunkového cyklu (obrázky 4b a d; doplnkové obrázky S2c a d).

Image

MiR-34a môže podporovať bunkovú apoptózu a brániť progresii bunkového cyklu v bunkových líniách NSCLC. ( a, c ) Miera apoptózy sa analyzovala prietokovou cytometriou po transfekcii s mimikom miR-34a v bunkách A549 a SPC-A1. ( b, d ) Distribúcia bunkového cyklu buniek A549 a SPC-A1 transfekovaných mimikom miR-34a sa detegovala prietokovou cytometriou. * P <0, 05, ** P <0, 01 a *** P <0, 001.

Obrázok v plnej veľkosti

EGFR je priamym cieľom miR-34a

Na preskúmanie molekulárneho mechanizmu, ktorým miR-34a prispieva k apoptóze a progresii bunkového cyklu buniek NSCLC, sme použili miRWalk 2.0 (//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/) a miRMap ( //mirmap.ezlab.org/) predpovedať potenciálne ciele a identifikovať EGFR ako potenciálny cieľ pre miR-34a. Aby sa určilo, či je EGFR priamym cieľom miR-34a, k vektoru pGL3 (pGL3-EGFR WT 3'-UTR) sa klonoval EGFR-divoký typ 3'-UTR (EGFR WT 3'-UTR), za otvorený čítací rámec luciferázy. Okrem toho na overenie cieľovej špecifickosti sa konštruktuje rekombinantný vektor pGL3 s mutáciou EGFR-3'-UTR (pGL3-EGFR mut 3'-UTR) pomocou súpravy QuikChange Mutagenesis (Clontech, Shanghai, Čína) (obrázok 5a). V bunkách humánnej embryonálnej obličky 293T (HEK293T) kotransfektovaných s EGFR-3'-UTR (pGL3-EGFR WT 3'-UTR), vektora pRL a 50% došlo k významnému zníženiu relatívnej luciferázovej aktivity reportovaného génu o 50%. napodobenina miR-34a v porovnaní s kontrolou (kotransfektovaná s EGFR-3'-UTR, vektorom pRL a mimikom NC). Naopak, kotransfekcia miR-34a s EGFR-3'-mUTR (pGL3-EGFR mut 3'-UTR) neviedla k žiadnej významnej zmene luciferázovej aktivity, čo podporuje špecifickosť miRNA / cieľ 3'-UTR (obrázok 5b). Tiež sme transfektovali EGFR-3'-UTR, pRL vektor a miR-34a inhibítor, ako aj kontrolu (kotransfekovanú s EGFR-3'-UTR, pRL vektor a NC inhibítor) do A549 bunkovej línie. Výsledky ukázali, že relatívna luciferázová aktivita reportovaného génu v bunke A549 bola zvýšená v porovnaní s kontrolou (obrázok 5b).

Image

EGFR je priamym cieľom miR-34a. ( a ) EGFR WT 3'-UTR obsahuje predpokladané väzobné miesto miR-34a. Dáta ukazujú zarovnanie miR-34a s EGFR WT 3'-UTR a šípky ukazujú mutagenézové nukleotidy. ( b ) Stanovenie duálneho luciferázového reportéra. pGL3-EGFR WT 3'-UTR (EGFR-3'-UTR) a pGL3-EGFR mut 3'-UTR (EGFR-3'-mUTR) sa kotransfekovali s mimetikami miR-34a vľavo (HEK293T). EGFR-3'-UTR boli kotransfekované s inhibítorom miR-34a v bunkách A549 (vpravo). Zobrazené údaje sú relatívna expresia luciferázy svetlušky, normalizovaná na expresiu luciferázy Renilla. ( c, d ) Hladiny mRNA EGFR sa detegovali pomocou qRT-PCR a hladiny proteínov sa detegovali westernovým prenosom v bunkách A549 a SPC-A1 transfekovaných mimikom miR-34a. ( e ) Denzitometria sa použila na kvantifikáciu relatívnej expresie proteínov EGFR v bunkách A549 a SPC-A1 transfekovaných mimikom miR-34a po normalizácii na GAPDH. ( f ) Expresia EGFR v piatich ľudských bunkových líniách NSCLC. Bunky BEAS-2B sa použili ako normálna kontrola na porovnanie. g ) relatívna expresia mRNA EGFR zo zodpovedajúcich nenádorových tkanív a nádorových tkanív meraná pomocou qRT – PCR. 18S sa použil ako vnútorná kontrola. h ) Podľa Pearsonovho korelačného koeficientu bola medzi miR-34a a EGFR negatívna korelácia. i ) Analyzoval sa vplyv hladín expresie EGFR na celkové prežívanie 1926 pacientov s rakovinou pľúc. Kaplan-Meierove grafy boli generované pomocou Kaplan-Meierovho plotru. * P <0, 05, ** P <0, 01 a *** P <0, 001.

Obrázok v plnej veľkosti

Aby sa ďalej skúmalo, či miR-34a znížila expresiu EGFR na transkripčnej aj translačnej úrovni v bunkách NSCLC, vykonali sme qRT-PCR a western blot, aby sme stanovili hladiny mRNA a proteínov EGFR. Výsledky ukázali, že hladiny EGFR mRNA a proteínovej expresie boli signifikantne znížené po transfekcii s miR-34a napodobňovaním v bunkách A549 aj SPC-A1 v porovnaní s NC mimickou skupinou (obrázky 5c – e). Expresia EGFR v A549, SPC-A1, PC-9 a HCC827 bola oveľa vyššia ako expresia kontroly (BEAS-2B; obrázok 5f).

Aby sme zistili, či bola expresia EGFR nepriamo korelovaná s miR-34a v tkanivách NSCLC, hodnotili sme mRNA expresiu EGFR v 60 primárnych nádoroch NSCLC a v nádorových tkanivách pomocou qRT-PCR. Medzi pármi tkanív sme zistili, že hladina expresie EGFR bola v nádorových tkanivách nadregulovaná v porovnaní s ich nenádorovými tkanivami (obrázok 5g). Okrem toho bola negatívna korelácia medzi relatívnou expresiou EGFR a miR-34a vo vzorkách tkanív NSCLC podľa štatistickej analýzy s použitím Pearsonovho korelačného koeficientu (obrázok 5h).

Na analýzu účinku expresie EGFR u pacientov s rakovinou pľúc sme pomocou online databázy Kaplan-Meier Plotter (www.kmplot.com/analysis; Obrázok 5i) vygenerovali krivku prežitia Kaplan-Meier u pacientov s NSCLC s nízkou alebo vysokou expresiou EGFR. V 1926 prípadoch sme zistili, že pacienti s NSCLC s vysokou expresiou EGFR mali nižšie miery prežitia.

Aby sme preskúmali, či boli účinky miR-34a sprostredkované prostredníctvom EGFR, transfekovali sme expresný vektor EGFR (p2k7-EGFR) a negatívnu kontrolu (p2k7) do bunkovej línie A549, ktorá stabilne nadmerne exprimuje miR-34a (pLenti-miR-34a) a negatívne kontrola (pLenti). Aby sa preskúmalo, či boli účinky miR-34a sprostredkované prostredníctvom EGFR, pLenti a pLenti-miR-34a A549, pozitívne bunky pre zelenú fluorescenciu boli takmer 99% (doplnkový obrázok S3a). Hladina expresie miR-34a bola 26-krát vyššia v A549 pLenti-miR-34a v porovnaní so skupinami pLenti (doplnkový obrázok S3b). Expresia EGFR mRNA a proteínov bola tiež zvýšená po transfekcii s pLenti-miR-34a v bunke A549 v porovnaní so skupinou NC (obrázky 6a-c). Analyzovali sme tiež vplyv nadmernej expresie miR-34a na proliferáciu NSCLC a bunkovú apoptózu. Výsledky ukázali, že EGFR zvráti supresívnu funkciu nadmernej expresie miR-34a na proliferáciu a bunkovú apoptózu v bunke A549 v porovnaní so skupinou NC (obrázky 6d af). Záverom tieto dáta naznačujú, že účinky EGFR podporujú NSCLC zvýšením proliferácie buniek a inhibíciou apoptózy.

Image

EGFR môže zachrániť účinky miR-34a na bunkové línie NSCLC. ( a - c ) Hladiny mRNA a proteínu EGFR v miR-34a stabilne nadmerne exprimujúcich (pLenti-miR-34a) a negatívnych kontrolných (pLenti) bunkách A549 po transfekcii expresným vektorom EGFR (p2k7-EGFR) a negatívnych kontrolných (p2k7) ). ( d ) proliferácia buniek A549 (pLenti-miR-34a / pLenti) po transfekcii s p2k7-EGFR a p2k7, ako bolo merané testom Cell Counting Kit-8. ( e, f ) Miera apoptózy buniek A549 (pLenti-miR-34a / pLenti) po transfekcii p2k7-EGFR a p2k7 sa analyzovala prietokovou cytometriou. * P <0, 001.

Obrázok v plnej veľkosti

Downregulácia EGFR inhibuje proliferáciu buniek, podporuje bunkovú apoptózu a indukuje progresiu bunkového cyklu v bunkových líniách NSCLC.

Znížili sme EGFR pomocou siRNA, aby sme znížili expresiu EGFR a skúmali účinky na bunkovú proliferáciu, bunkovú apoptózu a progresiu bunkového cyklu v bunkových líniách NSCLC, A549 a SPC-A1. Naše výsledky odhalili, že úrovne expresie mRNA a proteínu EGFR boli signifikantne znížené o viac ako 50% v bunkách NSCLC transfekovaných siRNA EGFR (siEGFR) v porovnaní s bunkami transfekovanými s NC siRNA (siNC) (obrázky 7a – c). Výsledky ďalej odhalili, že proliferácia buniek transfekovaných siEGFR bola významne potlačená v porovnaní s bunkami transfekovanými siNC (obrázky 7d a e). Ďalej sme analyzovali účinky transfekcie pomocou siEGFR na apoptózu a zistili sme, že poskytla významné zvýšenie rýchlosti apoptózy v bunkách A549 a SPC-A1 v porovnaní s bunkami transfekovanými siNC (obrázky 7f a g). Ďalej, prietoková cytometrická analýza bunkového cyklu ukázala, že podiel buniek vo fáze G0 / G1 sa zvýšil v bunkách transfekovaných siEGFR v porovnaní s bunkami transfekovanými siNC (obrázky 7h a i).

Image

Downregulácia EGFR môže inhibovať proliferáciu buniek, podporovať bunkovú apoptózu a brániť progresii bunkového cyklu v bunkových líniách NSCLC. ( a, b ) Hladiny mRNA EGFR a proteínu v bunkách A549 a SPC-A1 transfekovaných siEGFR sa merali pomocou qRT – PCR a western blot. c ) Denzitometria sa použila na kvantifikáciu relatívnej expresie proteínu EGFR po normalizácii na GAPDH v bunkách A549 a SPC-A1 transfekovaných siEGFR. ( d, e ) Proliferácia buniek A549 a SPC-A1 transfekovaných siEGFR sa stanovila pomocou Cell Counting Kit-8. ( f, g ) Miera apoptózy buniek A549 a SPC-A1 transfekovaných siEGFR sa analyzovala prietokovou cytometriou. ( h, i ) Distribúcia bunkového cyklu buniek A549 a SPC-A1 transfekovaných siEGFR sa detegovala prietokovou cytometriou. * P <0, 05, ** P <0, 01 a *** P <0, 001.

Obrázok v plnej veľkosti

Súhrnne tieto výsledky demonštrovali, že knockdown EGFR vykazoval podobný fenotyp ako upregulácia miR-34a v bunkách NSCLC a že tumor-supresívna funkcia miR-34a je čiastočne sprostredkovaná downreguláciou EGFR.

MiR-34a potláča rast nádoru u xenoimplantátov A549 a metastatických nádorov

Na základe nádorovej supresívnej úlohy miR-34a in vitro sme ďalej skúmali úlohu miR-34a in vivo , aby sme zhodnotili jeho terapeutický potenciál. Nahým myšiam sa subkutánne injikovali bunky A549 stabilne nadmerne exprimujúce miR-34a (pLenti-miR-34a) (5 x 106) alebo kontrola (pLenti) a nasledujúce nádory sa hodnotili po 6 týždňoch. Xenoimplantáty A549 vykazovali významnú inhibíciu rastu nádoru v skupine pLenti-miR-34a v porovnaní s kontrolou (obrázok 8a). Bunky pLenti-miR-34a tiež vykazovali zrejmé zníženie veľkosti a hmotnosti nádoru 6 týždňov po implantácii (obrázky 8b a c). Okrem toho sa v nádorových tkanivách zo skupiny pLenti-miR-34a pozorovala výrazná regulácia expresie miR-34a v porovnaní s kontrolami (obrázok 8d). Pomocou imunohistochémie sme tiež merali expresiu Ki67, EGFR, E-kadherínu a N-kadherínu v nádorových tkanivách xenoštepu. Výsledky ukázali signifikantné zníženie Ki67 a EGFR v nádorových tkanivách stabilne pLenti-miR-34a, sprevádzané indukciou expresie E-kadherínu, ale znížením expresie N-kadherínu (obrázky 8e a f). Tieto údaje naznačujú, že miR-34a môže inhibovať rast nádoru in vivo , čo dopĺňa výsledky našich funkčných štúdií in vitro .

Image

Upregulácia miR-34a-inhibovaného rastu nádoru a metastáz in vivo . ( a ) bunky p5enti-miR-34a A549 a kontrolné bunky (pLenti) sa injikovali nahým myšiam injekciou subkutánnou alebo chvostovou žilou. Objemy nádorov boli merané týždenne a boli generované rastové krivky. ( b ) Hmotnosť nádoru myší 6 týždňov po subkutánnej injekcii. c ) Zobrazia sa nádorové obrázky. ( d ) Expresia miR-34a bola detegovaná pomocou qRT-PCR v myších nádorových tkanivách indukovaných bunkami A549 pLenti-miR-34a a pLenti. ( e, f ) Expresia Ki67, EGFR, E-kadherínu a N-kadherínu v nádorových tkanivách sa merala imunohistochémiou. g ) Zobrazujú sa pľúca myší s metastázovými uzlami. ( h, i ) Je zobrazený počet pľúcnych uzlín a hmotnosť pľúc myší indukovaných bunkami A549 pLenti-miR-34a a pLenti. j ) Histopatológia metastáz s farbením hematoxylínom a eozínom (pôvodné zväčšenie × 100). * P <0, 05, ** P <0, 01 a *** P <0, 001.

Obrázok v plnej veľkosti

Aby sa zistilo, či miR-34a ovplyvnil nádorové metastázy in vivo , do chvostovej žily nahých myší sa injikovali bunky A549 (5 x 106) pLenti-miR-34a alebo pLenti. Šesť týždňov po injekcii chvostovej žily sme pozorovali výrazný účinok na počet vytvorených uzlov, ako aj na hmotnosť pľúc s metastázami. Bunky pLenti generovali jemné a rozptýlené metastatické uzly, zatiaľ čo bunky pLenti-miR-34a viedli k masívnym a konfluentným metastatickým uzlinám (obrázky 8g a h). Štatistická analýza ukázala, že hmotnosť pľúc myší s metastatickými uzlami v bunkovej skupine pLenti-miR-34a sa približne 0, 85-krát zmenšila v porovnaní s hmotnosťou v kontrolnej bunkovej skupine (obrázok 8i). Súčasne sa na pozorovanie patologických zmien v bilaterálnych pľúcach použilo zafarbenie hematoxylínom a eozínom pod svetelnou mikroskopiou. Nádorové hniezda odvodené od kontrolných buniek vykazovali veľkú oblasť deštrukcie pľúcneho tkaniva a / alebo nekrózy, zatiaľ čo bunky pLenti-miR-34a tvorili menej a menšie nádorové hniezda (obrázok 8j).

diskusia

Naše predchádzajúce štúdie potvrdili, že miRNA, miR-181a-5p, miR-146a-5p, miR-32, miR-34a a miR-486-5p, hrajú dôležitú úlohu v progresii NSCLC. 18, 26, 27, 28 Tieto zistenia ukázali, že zmenená expresia miRNA by mohla súvisieť s tumorigenézou rakoviny pľúc.

Bolo navrhnuté, že špecifická miRNA by mohla pôsobiť ako molekulárny diagnostický nástroj pre rakovinu pľúc, 29, 30 a liečba založená na miRNA by mohla byť racionálnym prístupom k terapeutickému zacieleniu EGFR. 31 Nedávno bolo preukázaných niekoľko miRNA, ako miR-200a, 32 miR-27a / 27b, 33, 34 miR-133a, 35 miR-134, 36 miR-143, 37 miR-145 38 a miR-146a 39. priamo zacieliť na EGFR. Tieto štúdie o regulačnej sieti EGFR-miRNA zdôrazňujú možnosť, že okrem inhibítorov tyrozínkinázy a klasických monoklonálnych protilátok pre terapie zamerané na EGFR sa môže na cielenie EGFR použiť terapia založená na miRNA. Štúdia navyše ukázala, že terapeutický potenciál dodania miR-34a v kombinácii s rádioterapiou môže predstavovať novú stratégiu liečby NSCLC. Medzitým existuje veľa overených a predpovedaných cieľov miR-34a (doplnková tabuľka S4). Tu sme identifikovali miR-34a ako miRNA zacielenú na EGFR.

K dnešnému dňu sa miR-34a najlepšie chápe ako stále viac protirakovinová miRNA, ktorá pôsobí predovšetkým na zastavenie bunkového cyklu, diferenciáciu, starnutie a apoptózu, 20, 40 a je potrebné poznamenať, že lipozomálna formulácia miR-34a (MRX34). ) sa stala prvou miRNA, ktorá dosiahla klinické skúšky fázy I. 20, 41, 42 Nedávno štúdie ďalej zistili, že ektopická nadmerná expresia miR-34a vedie k inhibícii niektorých solídnych nádorov, vrátane rakoviny prostaty, 43 rakoviny hrubého čreva, 44, 45 NSCLC, 46 endometriálneho karcinómu, 47 hepatocelulárneho karcinómu 48 a osteokarcinómu., 49 MiR-34a má schopnosť kontrolovať expresiu génovej rodiny kombináciou bioinformatických prístupov s experimentálnou validáciou. Početné patogenézy ľudských chorôb súviseli so zmenenou expresiou miRNA. 51

Naša predchádzajúca štúdia potvrdila, že v NSCLC nadmerná expresia miR-34a inhibuje proliferáciu a podporuje apoptózu in vitro . 18 Tento výsledok môže naznačovať potenciál miR-34a ako tumor supresora v NSCLC. Mechanizmus miR-34a v blokovaní rastu nádoru NSCLC si zaslúži viac prieskumu. Naša súčasná štúdia preukázala, že expresia miR-34a bola znížená v NSCLC v porovnaní s tkanivami bez nádoru. Ďalej sme overili, že miR-34a inhibuje proliferáciu buniek rakoviny pľúc indukciou bunkovej apoptózy a zastavenia bunkového cyklu. Ďalej, pretože miR-34a inhibuje in vitro proliferáciu buniek NSCLC, skúmali sme potenciál miR-34a na potlačenie nádoru in vivo . Ukázali sme, že v bunkových líniách NSCLC, A549, SPC-A1 a HCC827 (mutované EGFR), miR-34a pôsobil ako nádorový supresor priamym zacielením na EGFR.

Progresia a vývoj nádoru je presne regulovaná niekoľkými podskupinami génov, ktoré pôsobia buď aktiváciou onkogénov alebo umlčaním génov potláčajúcich nádor. Gény na potlačenie nádorov môžu negatívne regulovať proliferáciu buniek inhibíciou rastu a indukciou bunkovej apoptózy. Naše údaje o xenoštepoch naznačujú, že k potlačeniu rastu nádorov a metastáz dochádza prostredníctvom inhibície proliferácie a indukcie apoptózy nádorových buniek, čo naznačuje potenciál miR-34a ako stratégie pre terapiu zameranú na EGFR. Navyše, na základe predchádzajúcich štúdií v našom laboratóriu, 18, 26, 27, 28 sme dospeli k záveru, že miR-34a by sa mohol podieľať na regulácii niekoľkých cieľových mRNA a tiež by mal úzko súvisieť so signalizačnými cestami pre Kras a jadrový faktor-kB., Ako supresor tumoru v tejto regulačnej sieti môže miR-34a ovplyvňovať proliferáciu, migráciu, apoptózu a bunkový cyklus buniek NSCLC (obrázok 9). Naše zistenia poskytli príležitosť pochopiť mechanizmus onkogenézy miRNAs v regulácii rakoviny pľúc.

Image

Regulačná sieť miR-34a v NSCLC. Uvádzame, že miR-34a má úlohu supresora nádoru v NSCLC prostredníctvom downregulácie EGFR.

Obrázok v plnej veľkosti

Záverom je, že naša štúdia ukazuje, že miR-34a inhibuje rast NSCLC zacielením na EGFR. Preto miR-34a a EGFR môžu byť sľubnými molekulárnymi cieľmi nielen pre liečbu NSCLC, ale tiež ako užitočný a nový prognostický alebo progresívny marker pre NSCLC.

Materiály a metódy

Klinické vzorky tkaniva

Vzorky tkanív sa získali z etickej komisie Šanghajskej nemocnice na hrudníku, ktorá bola pridružená k Šanghajskej univerzite Jiao Tong, a so súhlasom etickej komisie. Podrobnosti o všetkých vzorkách použitých v tomto dokumente sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1.

Bunková kultúra

Bunky SPC-A1, HCC827, BEAS-2B a HEK293T boli získané od Cell Bank, Čínskej akadémie vied (Šanghaj, Čína). Bunky A549, H1299 a PC-9 boli zakúpené od American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Bunková línia BEAS-2B bola izolovaná z normálneho ľudského bronchiálneho epitelu.

Bunkové línie NSCLC, H1299 a HCC827 sa kultivovali buď v médiu RPMI-1640 alebo v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM, Gibco, Gaithersburg, MD, USA). Bunky BEAS-2B sa kultivovali v médiu LHC-9 a bunky A549, SPC-A1, PC-9 a HEK293T sa kultivovali v DMEM. Všetky médiá boli doplnené 10% fetálnym hovädzím sérom (HyClone Laboratories, Logan, UT, USA) a antibiotickým kokteilom 100 U / ml penicilínu a 100 μg / ml streptomycínu (Gibco). Bunková kultúra sa uskutočňovala pri 37 ° C v prostredí zvlhčenom 5% C02.

Extrakcia RNA a qRT – PCR

Celková RNA sa extrahovala s TRIzolovým činidlom (Bio Basic Inc., Toronto, ON, Kanada), reverzná transkripcia sa uskutočňovala pomocou súpravy QuantiMir cDNA Kit (Takara, Dalian, Čína) a reagenčnej súpravy PrimeScript ™ RT (Takara); kvantitatívna PCR sa uskutočňovala s SYBR Premix Ex Taq (Takara) podľa protokolov výrobcu. Ako endogénna kontrola miRNA a mRNA sa použili U6 snRNA a 18S rRNA. Výsledky boli vyjadrené pomocou metódy relatívnej kvantifikácie (2- ACt ). Sekvencie primérov sú uvedené v doplnkovej tabuľke S3.

Transfekcia buniek

Napodobňovače MiR-34a, mimetiká NC, inhibítory miR-34a, inhibítory NC a siRNA boli zakúpené od spoločnosti Ruibo Company (Guangzhou, Čína).

Bunky boli transfekované s 80 nm chemicky syntetizovaného mimetika miR-34a, 120 nm miR-34a inhibítora alebo 100 nm siEGFR-1 (doplnková tabuľka S2) pomocou Lipofectamine 2000 (Thermo, Life Technologies, New York, NY, USA), podľa pokyny výrobcu. Po 24 hodinách po transfekcii sa bunky použili na následné experimenty vrátane testov na bunkovú proliferáciu, migráciu, apoptózu a analýzu bunkového cyklu, qRT-PCR a westernový prenos.

Test bunkovej proliferácie

Proliferácia buniek bola stanovená pomocou testu Cell Counting Kit-8. Stručne, bunky sa umiestnili na 96-jamkovú doštičku pri hustote 2 x 103 buniek na jamku a inkubovali sa pri 37 ° C v prostredí zvlhčenom 5% C02. Bola pridaná súprava na počítanie buniek -8 a bunky boli vrátené k inkubácii počas 1-4 hodín. Absorbancia svetla pri 450 nm sa merala denne pomocou čítačky mikrodoštičiek. Pokusy s trojnásobnými pokusmi sa uskutočňovali nezávisle najmenej trikrát.

Test tvorby kolónií

Bunky sa umiestnili na platne pri 300 bunkách na 35 mm misku pre tkanivové kultúry a inkubovali sa 2 týždne pri 37 ° C v prostredí zvlhčenom 5% C02. Kolónie boli potom fixované metanolom, zafarbené kryštálovou violeťou (0, 5% hm./obj.) A počítané. Pokusy s duplikátmi sa uskutočňovali nezávisle najmenej trikrát.

Test bunkovej migrácie

A549 a SPC-A1 sa naočkovali v množstve 2 x 105 buniek na jamku na 24-jamkovú doštičku a nechali sa dosiahnuť sútok. Prostredníctvom každej jamky sa sterilnou špičkou pipety zaviedla rana s jednoduchým poškriabaním. Bola vyhodnotená migrácia buniek cez okraje a fotografovaná po 24 hodinách.

Skúška bunkovým transwell sa uskutočňovala s použitím 24 jamkových transwells (veľkosť pórov 6, 5 mm, Corning Life Sciences, Manassas, VA, USA). Bunky A549 a SPC-A1 sa transfekovali s mimetickou miRNA 80 nm. Po 24 hodinách sa pridali do hornej komory každej migračnej jamky v 100 μl média bez hovädzieho séra plodu a do spodnej časti komory sa pridalo 500 μl DMEM s 10% fetálneho hovädzieho séra a migrácia sa nechala prebiehať 24 hodín. Bunky na povrchu filtra boli fixované metanolom, zafarbené kryštálovou violeťou a fotografované mikroskopom s inverzným fázovým kontrastom. Pokusy s trojnásobnými pokusmi sa uskutočňovali nezávisle najmenej trikrát.

Analýza bunkovej apoptózy

Analýza bunkovej apoptózy sa uskutočnila, ako už bolo opísané. 18 Na stanovenie úrovne bunkovej apoptózy sa podľa pokynov výrobcu použila súprava na detekciu apoptózy izotiokyanatanu izotiokyanátového annexinu V (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA). Bunky A549 a SPC-A1 sa resuspendovali v 1 x väzbovom tlmivom roztoku s anexín-izotiokyanátom a id uididom annexin V V a potom sa inkubovali pri teplote miestnosti počas 15 minút v tme. Apoptotické bunky sa analyzovali pomocou prietokového cytometra MoFlo XDP (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA). Pokusy s trojnásobnými pokusmi sa uskutočňovali nezávisle najmenej trikrát.

Analýza bunkového cyklu

Analýza bunkového cyklu sa uskutočnila, ako už bolo opísané. 27 Stručne, 1 x 105 buniek sa odobralo a fixovalo v 75% etanole cez noc pri -20 ° C. Bunky sa potom odobrali, ošetrili sa RNázou A (100 ng / ml) počas 30 minút a farbili sa propídiumjodidom (50 ng / ml) počas 15 minút. After staining, samples were analyzed for cell-cycle distribution with a MoFlo XDP flow cytometer (Beckman Coulter). Data were analyzed using Flow Jo software (Treestar Inc., Brea, CA, USA). Experiments with duplicates were performed independently at least thrice.

Luciferázový reportérový test

3′-UTR luciferase plasmids were constructed as follows: the 3′-UTR of EGFR containing the predicted binding site of miR-34a was cloned into the pGL3 vector (Promega, Madison, WI, USA) and designated as EGFR-3′-UTR. EGFR-3′-mUTR plasmid containing the mutated binding site was also constructed. Site-directed mutagenesis was performed by quick-change PCR with mutated primer pairs and Pfu polymerase (Takara). Recombinant expression vectors were confirmed by sequencing (Sangon Biotech, Shanghai, China). Sekvencie primérov sú uvedené v doplnkovej tabuľke S3.

miRWalk 2.0 (//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/) and miRMap (//mirmap.ezlab.org/) were used to predict the target genes of miR-34a. According to miRWalk 2.0, highly conserved predictions were included as the potential targets.

Luciferase reporter assay was performed as previously described. 18, 27 In brief, HEK293T cells were cultured in 24-well plate and transiently co-transfected with 200 ng of luciferase vector EGFR-3′-UTR or EGFR-3′-mUTR, and a final concentration of 100 nm of miR-34a mimic or NC mimic, with 20 ng of plasmid expressing the renilla luciferase gene (pRL, Promega) as a control for transfection efficiency. After 48 h post transfection, cells were lysed and luciferase activity was assayed with an Orion II Microplate Illuminometer (Titertek-Berthold, South San Francisco, CA, USA). Relative activities were expressed as the fold-change in luciferase activity following normalization to renilla luciferase activity.

A549 cells were cultured in 24-well plate and transiently co-transfected with 200 ng of luciferase vector EGFR-3′-UTR and a final concentration of 100 nm of miR-34a inhibitor or NC inhibitor, with 20 ng of plasmid expressing the renilla luciferase gene (pRL, Promega) as a control for transfection efficiency. Relative activities were expressed as the fold-change in luciferase activity following normalization to renilla luciferase activity.

Extrakcia proteínov a analýza westernovým prenosom

Western blot analysis was performed as previously described. 18, 27 In brief, total protein was extracted from the cells using RIPA lysis buffer (CWBIO, Beijing, China) and quantified with a Protein BCA Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). The protein was then separated by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA). The membrane was then blocked with 5% powdered milk at room temperature for 1 h, followed by incubation with rabbit anti-EGFR (4267 S) and anti-GAPDH (14C10) antibodies (1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) overnight at 4 °C. After washing and incubation with a goat-anti-rabbit secondary antibody conjugated to horseradish peroxidase (1:1000, Cell Signaling Technology), protein bands were detected with a chemiluminescent horseradish peroxidase substrate (Millipore) and imaged with an E-Gel Imager (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Konštrukcia a infekcia lentivírusom

Lentivirus construction and infection performed as previously described. 53 In brief, pri-miR-34a sequence was digested with Bam HI and Xho lI, then cloned into the pLenti vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), formed pLenti-miR-34a. pLenti-miR-34a or pLenti vector was co-transfected into HEK293T with psPAX2 and pMD2G. Viral particles were collected 48 and 72 h later, centrifuged them together at 4000 rpm for 5 min at 4 °C, then filtered with 0.45 μm filter. A549 cells were then infected with the viral particles, transfected with pLenti-miR-34a or pLenti and were sorted for green fluorescence via flow cytometry. The cells were transfected with pLenti-miR-34a or pLenti and sorted for green fluorescence via flow cytometry.

EGFR rescue assay

pLenti A549 and pLenti-miR-34a A549 were transfected with 1000 ng/ml EGFR expression vector p2k7 or p2k7-EGFR using Lipofectamine 2000. After 24 h post transfection, cells were used for qRT–PCR, western blotting, then for cell proliferation and apoptosis analysis. Experiments with triplicates were performed independently at least thrice.

Tumor xenograft assay and metastatic assay

Female nude mice were purchased from the SLRC Laboratory Animal Center (Shanghai, China) and maintained under specific-pathogen-free conditions. To establish the subcutaneous tumor xenograft model, 6–8 weeks' mice were randomly assigned into two groups (five mice per group), and each nude mice was injected subcutaneously in the right flank with 5 × 10 6 A549 cells (resuspended in 100 μl DMEM medium) pLenti-miR-34a or pLenti. Tumor diameters were measured weekly with calipers, and tumor volumes were calculated using the following formula: volume=length × width 2 /2. Upon conclusion of the experiment, the mice were killed and primary tumors were excised and weighed. To investigate the metastatic ability, mice were injected with 5 × 10 6 cells (resuspended in 200 μl DMEM medium) via the tail vein, and 6 weeks following the injection, the mice were killed and lung tissues were isolated. Na kvantifikáciu metastáz bolo použité vyhodnotenie hmotnosti pľúcnych tkanív. Six tumor tissues were subjected to serial sectioning and immunohistochemistry. Six lung tissues were subjected to serial sectioning and then hematoxylin and eosin staining. Pathological changes were observed under a light microscope. Všetky experimentálne protokoly boli schválené Výborom pre ústavnú starostlivosť o zvieratá a ich používanie na Šanghajskej univerzite (Šanghaj, Čína). Vynaložilo sa všetko úsilie na minimalizáciu utrpenia.

imunohistochémia

Tumor growth was assessed by immunohistochemical staining of Ki67 to quantitate the growth index, N-cadherin and E-cadherin to quantitate the migration index. Target gene for miR-34a, EGFR , was also measured by immunohistochemistry. Tumor biopsies were fixed with formalin, embedded in paraffin and cut into sections of about 4 μm. Vzorky sa potom zbavili parafínu a dehydratovali sa xylénom a odstupňovanými alkoholmi a následne sa rehydratovali demineralizovanou vodou. Imunohistochémia sa uskutočňovala s použitím mikroskopickej predbežnej úpravy podložných sklíčok na získanie antigénu. Primary antibodies against Ki67, EGFR, N-cadherin and E-cadherin (1:500, Cell Signaling Technology) were applied, together with goat-anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated antibodies, and proteins were visualized in situ with a 3, 3′-diaminobenzidine reaction solution.

Štatistická analýza

Results are expressed as the group means±sem and analyzed using (GraphPad Prism 5 software, La Jolla, USA), using t -tests for two-group comparisons. Rozdiely sa považovali za štatisticky významné, keď P <0, 05.

PUBLISHER'S NOTE

Springer Nature zostáva neutrálny, pokiaľ ide o nároky na právomoc vo zverejnených mapách a inštitucionálne pridruženie.

Doplnková informácia

Obrázkové súbory

  1. 1.

    Doplnkový obrázok 1

  2. 2.

    Doplnkový obrázok 2

  3. 3.

    Doplnkový obrázok 3

Word dokumenty

  1. 1.

    Doplnkový obrázok S1

  2. 2.

    Supplementary Figure s2

  3. 3.

    Doplnkový obrázok 3

  4. 4.

    Doplnková tabuľka S1

  5. 5.

    Doplnková tabuľka S2

  6. 6.

    Doplnková tabuľka S3

  7. 7.

    Doplnková tabuľka S4

    Doplňujúce informácie sú priložené k tomuto dokumentu na webovej stránke Oncogenesis (//www.nature.com/oncsis).