Metastázy pečene nezávislé od lymfatických uzlín v modeli metastatického kolorektálneho karcinómu | prírodná komunikácia

Metastázy pečene nezávislé od lymfatických uzlín v modeli metastatického kolorektálneho karcinómu | prírodná komunikácia

Anonim

predmety

  • Rakovina hrubého čreva a konečníka
  • pečeň
  • metastáza

abstraktné

Rozvinutie metastatických ciest je kriticky dôležité, pretože metastáza je primárnou príčinou úmrtnosti na rakovinu. Pri rakovine hrubého čreva a konečníka (CRC) nie je známe, či metastázy pečene pochádzajú z rakovinových buniek, ktoré najprv kolonizujú črevné lymfatické uzliny, alebo či sa tieto metastázy môžu tvoriť bez predchádzajúceho zapojenia lymfatických uzlín. Absencia relevantných metastatických modelov CRC vylúčila skúmanie metastatických trás. Tu popisujeme metastatický model CRC myši a ukazujeme, že metastázy v pečeni sa môžu prejavovať bez metastatického sprostredkovateľa lymfatických uzlín. Nádory hrubého čreva a konečníka transplantované na sliznicu hrubého čreva invázujú a metastázujú do špecifických cieľových orgánov vrátane črevných lymfatických uzlín, pečene a pľúc. Dôležité je, že tento metastatický obrazec sa líši od toho, ktorý sa pozoroval po implantácii slepého čreva, ktorá vždy zahŕňa peritoneálnu karcinomatózu. Antiangiogenéza inhibuje metastázy pečene, avšak antimangangiogenéza neovplyvňuje metastázy pečene napriek zrušeniu metastázy lymfatických uzlín. Naše údaje ukazujú priame hematogénne šírenie ako cestu šírenia, ktorá prispieva k malignite pečene CRC.

úvod

Rakovina hrubého čreva a konečníka (CRC) sa na začiatku prejavuje ako benígne adenomatózne polypy na sliznicovom povrchu hrubého čreva. Pokiaľ sa tieto polypy nechajú nezmenené, môžu sa vyvinúť na invazívne adenokarcinómy, ktoré prenikajú cez vrstvy submukóznej a muscularis vonkajšej časti steny hrubého čreva a dostávajú sa na seróznu stranu. Prípadné regionálne rozšírenie do črevných lymfatických uzlín a vzdialené rozšírenie do pečene vedie k rastu hrubých metastáz, ktoré sú hlavnou príčinou úmrtnosti na CRC. V súčasnosti nie je známe, či vzdialené metastázy CRC v pečeni pochádzajú z rakovinových buniek, ktoré najskôr kolonizovali regionálne lymfatické uzliny čreva po prístupe k lymfatickej vaskulatúre, alebo či sa tieto metastázy v pečeni môžu vytvárať bez predchádzajúceho rastu v regionálnych lymfatických uzlinách 1 . Rozvrhnutie ciest metastáz CRC do týchto miest má potenciál odhaliť terapeutické príležitosti, ktoré môžu mať vplyv na úmrtnosť na CRC. Vyšetrovania metastatických trás CRC však boli vylúčené z dôvodu nedostatočnej dostupnosti príslušných metastatických modelov CRC in vivo . Napriek širokej dostupnosti xenotransplantátov, chemicky indukovaných a geneticky modifikovaných myších modelov CRC 2, 3, 4, 5, nádory v týchto modeloch skutočne nedokážu reprodukovateľne metastázovať do regionálnych črevných lymfatických uzlín a pečene - cieľové orgány relevantné pre ľudský CRC.

Najpoužívanejším geneticky modifikovaným myším modelom rakoviny čreva je Apc Min / + myš, ktorá nesie dominantnú nezmyselnú mutáciu v jednej Apc alele 6 . U myší Apc Min / + sa v črevnom trakte vyvinie množstvo adenómov; tieto adenómy však zriedkavo, ak vôbec, postupujú k invazívnym alebo metastatickým adenokarcinómom 7 . Okrem toho sa tieto adenómy primárne lokalizujú v tenkom čreve, s relatívne malým počtom adenómov, ktoré sa prejavujú v hrubom čreve 7 . Zavedenie onkogénneho Kras do mutantného pozadia Apc podporuje multiplicitu črevného adenómu 8, 9 a urýchľuje progresiu do invazívnosti 8, 10, 11, so zreteľným zlepšením vývoja nádoru v príslušnom anatomickom mieste hrubého čreva 9 . Vývoj metastáz intestinálnych lymfatických uzlín však nebol pozorovaný u myší mutovaných v Apc / Kras 8, 12, zatiaľ čo vzdialené metastázy v pečeni sa detegovali iba u 20–27% myší s mutáciou Apc / Kras pomocou transgénu RT – PCR 8 alebo brutto pozorovanie 12 . Je potrebné poznamenať, že myši s mutantnou zlúčeninou Apc / Kras vykazujú dramaticky zníženú životnosť, ktorú možno pripísať nadmernému zaťaženiu črevného nádoru 9, 10 .

Vzhľadom na to, že tumory mutantnej zlúčeniny Apc / Kras vykazujú znaky malígnej progresie v ranom štádiu 8, 10, 11, predpokladali sme, že udržiavanie zlúčeniny mutantného nádoru in vivo po skrátenej dobe života mutantnej myši Apc / Kras by mohlo umožniť realizáciu metastatického potenciálu., Preto sme sa snažili transplantovať jeden intaktný donor mutantného Apc / Kras zlúčeniny vo vnútri slizničnej vrstvy hostiteľského divého typu C57BL / 6J myšieho hrubého čreva, pretože by to verne predstavovalo ortotopický primárny kolorektálny nádor v klinickom štádiu 0 (in situ karcinóm). s potenciálom postúpiť do štádia IV choroby. Doteraz bolo opísaných niekoľko techník ortotopickej transplantácie hrubého čreva, vrátane injekcie suspenzií rakovinových buniek priamo do rektálnej sliznice 13 alebo serózovej steny slepého čreva 14, instilácie suspenzií nádorových buniek do lúmenu hrubého čreva po elektrokoagulácii sliznice na podporu nádoru. absorpcia buniek 15 a chirurgická implantácia intaktných fragmentov nádoru na seróznu stranu stien slepého čreva 16, 17 . Jednou nevýhodou implantácie slepého čreva je skutočnosť, že nádory sú implantované na seróznu stranu stien slepého čreva, čím sa obchádza požiadavka primárnej invázie nádoru cez sliznicu do serózy, aby došlo k metastázovaniu. Dôležité je, že hlavnou výhradou všetkých týchto zavedených techník je potenciál neúmyselného naočkovania nádorových buniek do peritoneálneho priestoru, či už z porušenia steny hrubého čreva počas injekcie nádorových buniek do sliznice, alebo z uvoľnenia nádorových buniek z slepého čreva po návrate do peritoneálnej dutiny. Aj keď sa tieto techniky použili na vytvorenie myších modelov CRC, ktoré údajne vyvíjajú metastázy v intestinálnych lymfatických uzlinách, pečeni a pľúcach, tieto techniky tiež vedú k rozšírenej peritoneálnej karcinomatóze 14, 15, 16, 17 . Je preto vysoko pravdepodobné, že tvorba nádoru v týchto sekundárnych miestach nemusí byť pravými metastázami, ale skôr výsledkom peritoneálneho očkovania. Skutočnosť, že peritoneálna karcinomatóza nie je významnou črtou ľudského metastatického CRC 18, ďalej naznačuje obmedzenú použiteľnosť týchto modelov na skúmanie spôsobov metastatického šírenia.

Tu opisujeme myší model metastatického CRC, ktorý vykazuje disemináciu nádorových buniek do špecifických cieľových orgánov, vrátane intestinálnych lymfatických uzlín, pečene a pľúc. Pomocou tohto modelu na priame vyšetrovanie ciest metastatického šírenia demonštrujeme, že metastázy pečene CRC sa môžu prejaviť v neprítomnosti metastatického sprostredkovateľa črevnej lymfatickej uzliny.

výsledok

Benígne nádory hrubého čreva z myší s mutáciou Apc / Kras

Vzhľadom na to, že kolorektálne nádory z myší s mutantnou zlúčeninou Apc / Kras sa vyvíjajú znaky malígnej progresie v ranom štádiu 8, 10, 11, pokúsili sme sa tieto nádory využiť pri pokuse vyvinúť reprodukovateľný model metastatického CRC na skúmanie ciest metastatického šírenia. Vytvorili sme Apc Min / + ; Kras LSLG12D / + ; mutantné myši zlúčeniny Villin-Cre (myši nesúce aktivovanú alelu Kras ( Kras LSLG12D ) závislú od Cre na pozadí Apc Min / + , krížené s myšami nesúcimi transgén Villin-Cre ktorý riadi expresiu Cre rekombinázy v čreve) a potvrdil zvýšenie vývoja nádoru v hrubom čreve v porovnaní s Apc Min / + ; kontrolné myši Villin-Cre (doplnkový obrázok la-c). V dôsledku zrýchlenej črevnej tumorigenézy však myši Apc Min / + ; Kras LSLG12D / + ; myši Villin-Cre vykazovali dramaticky zníženú životnosť (doplnkový obrázok 1d), čo je v súlade s predchádzajúcimi správami 9, 10 . Ako sa očakávalo, stav ochorenia na začiatku morbidity vo veku ~ 9 týždňov zostal nezhubný, o čom svedčia primárne nádory hrubého čreva, ktoré nedokázali preniknúť na seróznu stranu steny hrubého čreva a nedostatok metastáz v pečeni (doplnkový obr. 1b).

Ďalej sme sa snažili vyvinúť techniku, ktorá by nám umožnila udržiavať zmiešaný mutantný nádor in vivo po skrátenej dobe života mutantnej myši Apc / Kras , pretože by to mohlo umožniť realizáciu metastatického potenciálu. Za týmto účelom sme vyvinuli techniku ​​indukcie rektálneho prolapsu, ktorá externalizuje lúmen hostiteľského hrubého čreva, čím sa povrch sliznice hrubého čreva stáva prístupným chirurgickej manipulácii (obr. La). Použitie darcovských nádorov od 6 do 9 týždňov starých Apc Min / + ; Kras LSLG12D / + ; myši Villin-Cre alebo myši divého typu C57BL / 6J nesúce subkutánne Apc Min / + ; Kras LSLG12D / + ; aloimplantátové tumory Villin-Cre sme chirurgicky implantovali jednotlivé intaktné nádory hrubého čreva darcu do hostiteľských hrubých čriev divého typu C57BL / 6J. Je potrebné poznamenať, že donorové nádory sa pred implantáciou disociovali na jednotlivé bunky, ale skôr sa udržiavali ako neporušené nádorové tkanivá, pretože by sa tým zachovali interakcie nádorových buniek so stromálnymi bunkami aj so zložkami extracelulárnej matrice. Tieto intaktné donorové nádory sa usadili vo slizničnej vrstve a vykazovali dlhodobú perzistenciu in vivo, čo dokazuje sériová endoskopia (doplnkový obrázok 1e) alebo hrubé zobrazenie (doplnkový obrázok 1f). Po smrti hostiteľskej myši v dôsledku morbidity súvisiacej s vekom zostala drvivá väčšina implantovaných darcovských nádorov benígna (obr. Lb a doplnkový obr. Le, f), zatiaľ čo iba 3 zo 17 (17, 6%) myší vykazovali malígnu progresiu s inváziou donorového nádoru. stenou hrubého čreva a sprievodnou tvorbou črevných lymfatických uzlín a pečeňových metastáz 51 až 92 týždňov po implantácii (wpi; obr. 1c a doplnkový obr. 1g). Tieto zistenia poukazujú na nepraktické použitie benígnych adenómov na štúdium ciest metastatického šírenia, čím sa podporuje požiadavka na ďalšie genetické, epigenetické a / alebo mikroenvironmentálne zmeny počas predĺženého obdobia, aby došlo k progresii nádoru a metastázovaniu.

Image

a ) Technika implantácie lúmenu. Podrobnosti o technike sú uvedené v časti Metódy. ( b, c ) Hrubé obrázky hrubého čreva a pečene od dvoch hostiteľských myší divého typu C57BL / 6J, ktoré dostali lumenové implantáty jediného intaktného Apc Min / + ; Kras LSLG12D / + ; nádor Villin-Cre , odobratý pri 63 wpi ( b ; hostiteľská myš č. 359; benígna) alebo pri 79 wpi ( c ; hostiteľská myš č. 590; malígna). Zobrazili sa sliznice hrubého čreva a / alebo sérologické zobrazenie s análnym otvorom vľavo. Šípky označujú implantované nádory darcov. Pečeňové oblasti pečene boli zväčšené. Rámcová oblasť hrubého čreva vc bola zväčšená, aby sa zvýraznila metastáza do lymfatických uzlín. Stĺpce stupnice predstavujú 5 mm (hrubé črevo), 4 mm (pečeň) a 1 mm (pečeňová oblasť a lymfatická uzlina).

Obrázok v plnej veľkosti

Invázia a metastáza do kolorektálnych nádorov implantovaných lúmenom

V snahe skrátiť časový rámec malígnej progresie v našom modeli, aby sa dali skúmať cesty metastáz, sme použili našu techniku ​​implantácie lúmenu na zle diferencovanú bunkovú líniu získanú z ľudského CRC odvodeného z HCT116. Bunky HCT116 boli transdukované génom kódujúcim červený fluorescenčný proteín DsRed a implantované subkutánne do myši, aby sa vytvorili donorové xenoimplantátové nádory. Po chirurgickej implantácii darcovských nádorových fragmentov s veľkosťou ~ 10 mm3 na sliznicový povrch hostiteľských NOD / SCID myších hrubých čriev, boli použité hrubé zobrazovania ex vivo (obr. 2a) a endoskopia in vivo (obr. 2b) na sledovanie rýchlosti nádoru a rast v priebehu času (obr. 2c). Implantované nádory sa pôvodne vytvorili a rástli v luminálnom priestore hrubého čreva (obr. 2a, b), pričom jednotlivé ložiskové ložiská boli detegovateľné ako intramukózne karcinómy 1 wpi (obr. 2d, e). Histologické hodnotenie ihneď po implantácii potvrdilo, že implantačný postup neporušil hrúbku steny hrubého čreva, pretože primárne nádory boli lokalizované výlučne na sliznicovom povrchu hrubého čreva (doplnkový obrázok 2a, b, d, e) s integritou udržiavajú sa hlbšie vrstvy steny (doplnkový obrázok 2c, f). Prietoková cytometrická analýza krvi, pečene, pľúc a črevného marginálneho vaskulárneho traktu (zahŕňajúcich paracolické, stredné a hlavné črevné lymfatické uzliny) jeden deň po implantácii potvrdila neprítomnosť diseminovaných buniek HCT116-DsRed pozitívnych v tomto skorom časovom bode (doplnková obr. 2g). Polypy 0 štádia vždy progredovali do tumorov štádia I, ktoré porušili vonkajšie vrstvy submukózovej / muscularis, takže 2 až 3 wpi invazívne adenokarcinómy II. Fázy, ktoré prenikli cez bazénovú membránu muscularis externa bohatú na kolagén, dosiahli sérologickú stranu stena hrubého čreva bola zrejmá (obr. 2a a doplnkový obr. 3). Za povšimnutie stojí, že pri 3 wpi boli jednotlivé zhluky invazívnych nádorových buniek detegovateľné v stene hrubého čreva, ktoré susedia s (obr. 2f – h) a sú vzdialené (obr. 2f, i) od primárneho adenokarcinómu. K pokračujúcej expanzii primárneho adenokarcinómu došlo prevažne na sérologickej strane steny hrubého čreva (obrázok 2a a doplnkový obrázok 3a), a to do tej miery, že luminálna obštrukcia nebola zrejmá ani v koncovom bode úrody 7 wpi, morbidita zvierat pri 7 wpi bolo možné pripísať predovšetkým strate hmotnosti v dôsledku primárneho nádorového zaťaženia, čo je častý príznak pozorovaný aj u pacientov s CRC s neskorším štádiom ochorenia 19 .

Image

a ) Časový priebeh vývoja hrubého kolorektálneho nádoru po implantácii lúmenu. Stlpce od myší NOD / SCID nesúcich nádory lúmenov HCT116-DsRed boli odoberané v týždenných intervaloch od 0 do 7 týždňov po implantácii (wpi), pozdĺžne otvorené a zobrazené. Horný a spodný panel ukazujú slizničné a sérologické pohľady na hrubé črevo, s análnym otvorom umiestneným naľavo od každého panela. Mierka stupnice predstavuje 5 mm. b ) Endoskopické snímky po implantácii lúmenu HCT116-DsRed. Sériové obrazy boli zachytené od toho istého hostiteľa od 0 do 4 wpi Bodkovaná čiara pri 2 wpi označuje obvod implantovaného nádoru. c ) Objem primárneho nádoru po implantácii lúmenu. Počet myší za časový bod: 0 wpi ( n = 3), 1 wpi ( n = 3), 2 wpi ( n = 6), 3 wpi ( n = 6), 4 wpi ( n = 11), 5 wpi ( n = 15), 6 wpi ( n = 11), 7 wpi ( n = 18). Dáta sú vyjadrené ako priemer a sem ( d, e ) Histologické analýzy hostiteľského hrubého čreva implantovaného darcovským nádorom HCT116-DsRed pri 1 wpi, ktoré ukazujú ( d ) hematoxylín a eozín (H&E) a ( e ) kolagén IV (Col) IV; zelená), farbenie DsRed (červená) a 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; modrá). Mierka stupnice predstavuje 200 um. ( f - i ) Histologické analýzy hostiteľského hrubého čreva implantovaného s darcovským nádorom HCT116-DsRed pri 3 wpi, ukazujúce ( f ) farbenie H&E a ( g - i ) Col IV (zelená), DsRed (červená) a DAPI (modrá) farbenie. Červené, žlté a modré políčka v f sú zobrazené zväčšene vg - i . Stĺpce stupnice predstavujú 500 μm ( f ) a 100 μm ( g - i ).

Obrázok v plnej veľkosti

Keďže sa vyvinula implantácia lúmenu ako životaschopná technika na generovanie kolorektálnych nádorov v štádiu 0, ktoré progredovali do adenokarcinómov štádia II, potom sme myši s nádorom hodnotili na dôkaz regionálnej a / alebo vzdialenej metastatickej progresie zodpovedajúcej štádiu III / IV. Pri 6 - 7 wpi bolo výrazné lokoregionálne šírenie nádorových buniek v stene hrubého čreva, proximálne (obr. 3a, f) a distálne (obr. 3a-c) k primárnemu miestu nádoru (obr. 3a, d, e)., Myši tiež vykazovali inváziu hematogénnych (obr. 3g), lymfatických (obr. 3j) a perineurálnych (obr. 3h) nádorových buniek. Metastázy regionálnych črevných lymfatických uzlín boli detegovateľné ako makroskopické nádorové uzliny pozitívne na DsRed umiestnené v susedstve serózy a v drenážnej lymfatickej sieti, ktorá prebiehala paralelne so stenou hrubého čreva (obrázky 3a, i a 4a). Dôležité je, že myši tiež vykazovali makroskopické DsRed-pozitívne metastázy v pečeni (Obr. 4b) a pľúcach (Obr. 4c). Aby sme lepšie charakterizovali načasovanie manifestácie makroskopických metastáz, vykonali sme dočasné vyhodnotenie metastatického zaťaženia pomocou hrubého vyšetrenia a zistili sme, že makrometastázy primárne predstavovali ~ 4 wpi (obr. 4d). Prezentácia makrometastázy však neprináša informácie týkajúce sa presného načasovania šírenia mikroskopických chorôb. Preto sme disociovali celé pečene, pľúca a intestinálne okrajové vaskulárne trakty na jednotlivé bunky a pomocou prietokovej cytometrie sme monitorovali nádorové bunky pozitívne na DsRed. Diseminované nádorové bunky boli detegovateľné primárne pri ~ 3 wpi, týždeň pred prejavom hrubých makrometastáz (obrázok 4e). Potvrdili sme prítomnosť diseminovaných nádorových buniek v pečeni a pľúcach pri 3 wpi imunofluorescenciou DsRed, a to aj napriek neprítomnosti detekovateľného ochorenia na hrubej alebo histopatologickej úrovni (doplnkový obrázok 3b, c). Tieto nálezy demonštrujú implantáciu lúmenu kolorektálnych nádorov HCT116 do životaschopného modelu in vivo, ktorý dočasne metastázuje do regionálnych a vzdialených miest relevantných pre ľudské ochorenie.

Image

( a - j ) Farbenie hrubého čreva hematoxylínom a eozínom (H&E) z myši NOD / SCID nesúce nádor HCT116-DsRed s implantovaným lúmenom na 6 wpi. Boxové oblasti v a sú znázornené zväčšene v b - j, čo demonštruje ( b ) lokoregionálne šíri sa distálne od primárneho nádoru označeného šípkami, ( c ) lokoregionálne šírenie frontálneho migračného nádoru do normálnej sliznice vyznačenej bodkovanou čiarou, ( d ) penetrácia muscularis externa, ( e ) životaschopnosť primárneho tumoru, ( f ) lokoregionálna šírka proximálne k primárnemu nádoru označenému šípkami, ( g ) hematogénna invázia označená šípkou, ( h ) perineurálna invázia označená šípkami, ( i ) kolonizácia regionálnych lymfatických uzlín a ( j ) lymfatická invázia označená šípkou. Mierka stupnice predstavuje 1 mm ( a ), 200 μm ( b - f, i ) a 100 μm ( g, h, j ).

Obrázok v plnej veľkosti

Image

( a - c ) Metastázy u myší NOD / SCID nesúcich lúmenový nádor HCT116-DsRed pri 7 wpi. Sú znázornené hrubé hrubé črevo so šípkami označujúcimi metastázy lymfatických uzlín, dolný ľavý panel ukazujúci histologické farbenie hematoxylínom a eozínom ( H&E) a modré a červené rámčeky znázornené zväčšené v dolných, stredných a pravých paneloch a zafarbené na Col IV (zelená), DsRed (červená) a 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (modrá), ( b ) pečeň so šípkami označujúcimi metastázy, stredný panel ukazujúci histologické vyfarbenie pomocou H&E, bodkovaná čiara označujúca obvod metastatického uzla a rámček zobrazený v zväčšení na pravom paneli a zafarbený na stĺpec IV (zelený) ), DsRed (červená) a DAPI (modrá), ( c ) pľúca so šípkami označujúcimi metastázy, stredný panel zobrazujúci histologické zafarbenie pomocou H&E, šípky označujúce metastatické uzly a rámček zobrazený v zväčšenom zobrazení v pravom paneli a zafarbený na stĺpec IV. (zelená), DsRed (červená) a DAPI (modrá). Stĺpce stupnice predstavujú 4 mm (hrubé hrubé črevo, pečeň, pľúca a H&E hrubého čreva), 1 mm (H&E pečene a pľúc), 400 μm (imunofarbenie hrubého čreva a pľúc) a 200 μm (imunofarbenie pečene a lymfatických uzlín). d ) Počet makroskopických metastáz v intestinálnych lymfatických uzlinách, pečeni a pľúcach po implantácii lúmenu. Počet myší: 0 wpi ( n = 14), 1 wpi ( n = 3), 2 wpi ( n = 6), 3 wpi ( n = 6), 4 wpi ( n = 11), 5 wpi ( n = 15) ), 6 wpi ( n = 20), 7 wpi ( n = 18). e ) DsRed-pozitívne nádorové bunkové zaťaženie v črevných lymfatických uzlinách, pečeni a pľúcach po implantácii lúmenu. Dáta sú vyjadrené ako počet DsRed-pozitívnych nádorových buniek na 1 x 106 životaschopných udalostí. Počet myší: 0 wpi ( n = 14), 1 wpi ( n = 3), 2 wpi ( n = 3), 3 wpi ( n = 3), 4 wpi ( n = 8), 5 wpi ( n = 8) ), 6 wpi ( n = 13), 7 wpi ( n = 14). Každý bod v d a e predstavuje dáta z individuálnej myši. Sú tiež uvedené priemery ± sem.

Obrázok v plnej veľkosti

Ďalej sme určili, či by postup implantácie lúmenu priniesol podobné progresie a profily metastáz, ak by sa ako darcovia použili kolorektálne nádory rôzneho pôvodu. Na tento účel sme použili dobre diferencovanú primárnu ľudskú CRC-odvodenú LS174T bunkovú líniu. Transdukovali sme bunky LS174T lentivírusom kódujúcim DsRed, vygenerovali sme subkutánne nádory LS174T-DsRed u darcovskej myši a transplantovali sme fragmenty darcovského nádoru na sliznicový povrch hrubých čriev hostiteľských myší. Podobne ako v prípade nádorov HCT116 s implantovaným lúmenom, nádory LS174T s implantovaným lúmenom pôvodne rástli vo slizničnej vrstve a nakoniec vnikli cez stenu hrubého čreva tak, že väčšina primárnej nádorovej záťaže bola umiestnená na sérologickej strane steny pri zbere 8 wpi. koncový bod (doplnkový obrázok 4a, b). V tomto modeli boli zjavné najmä metastatické výrastky v pečeni, pľúcach a regionálnych lymfatických uzlinách, aj keď s dlhšou latenciou ako u myší s nádorom HCT116 (doplnkový obrázok 4a, c – e). Ďalej sme validovali užitočnosť tohto modelu s použitím nádorov CRC primárnych ľudských pacientov ako darcov, čo dokazuje, že nádory s implantovaným lúmenom od pacienta v štádiu II zostali nemetastatické, zatiaľ čo nádory s implantovaným lúmenom od pacienta v štádiu III viedli k metastázam do lymfatických uzlín čreva ( Doplnkový obrázok 4f – h). Tieto nálezy zdôrazňujú klinický význam progresie ochorenia v modeli lumen implantátu a ďalej zvyšujú možnosť, že implantácia lumenu CRC nádorov pochádzajúcich od pacienta môže mať predikčnú hodnotu vzhľadom na prípadnú metastázovanú prezentáciu.

Selektívne metastázy kolorektálnych nádorov implantovaných lúmenom

Na klinike určité typy nádorov špecificky metastázujú do určitých orgánov 20 . Vskutku, CRC prevažne metastázuje do regionálnych črevných lymfatických uzlín, pečene a pľúc, zatiaľ čo iné orgány sú značne ušetrené 21 . Aby sme určili, či model implantácie lúmenu bude presne rekapitulovať preferenčnú špecifickosť cieľového orgánu pozorovanú u ľudí, hodnotili sme metastatickú nádorovú záťaž pri 6–7 wpi v rôznych vnútorných orgánoch makroskopickým vyšetrením a DsRed-pozitívnou prietokovou cytometriou nádorových buniek. U myší NOD / SCID nesúcich nádory HCT116-DsRed s implantovaným lúmenom sa prednostne vyvinuli metastázy do pečene, pľúc a črevných lymfatických uzlín, s minimálnou metastatickou záťažou zistiteľnou v nadobličkách, obličkách, slezine, mozgu a kostnej dreni (obr. 5a, ba Doplnkový obrázok 5a). Toto preferenčné navádzanie cieľových orgánov sa udržiavalo, keď sa nádory HCT116 implantovali do hrubého čreva myšieho reťazca gama reťazca s nulovým interferenčným reťazcom gama (NSG) receptora NOD / SCID s nulovou imunitou (NSG) (obr. 5c – g), a to napriek významnému zvýšeniu metastatického nádoru. záťaž v pečeni, pľúcach a črevných lymfatických uzlinách v NSG (obr. 5a, b) v porovnaní s myšami NOD / SCID (obr. 4b, ca 5a, b)). Toto zvýšenie metastatického potenciálu primárneho nádoru sa dá čiastočne pripísať nedostatku prirodzenej zabíjacej bunky u NSG myší, čo je v súlade s predchádzajúcimi správami 22, 23 . Dôležité je, že sme nikdy nepozorovali peritoneálnu karcinomatózu u žiadnej z našich transplantovaných hostiteľských myší NOD / SCID alebo NSG - rys, ktorý je doteraz rozšírený v predtým publikovaných modeloch CRC k dnešnému dňu 14, 15, 16, 17 . Vzhľadom na to, že peritoneálna karcinomatóza nie je bežným prejavom v ľudskom CRC 18, naše zistenia ďalej zdôrazňujú relevantnosť a výhodu nášho metastatického modelu CRC v porovnaní s tými, ktoré boli uvedené v literatúre.

Image

( a, b ) Počet ( a ) makroskopických metastáz alebo ( b ) DsRed-pozitívnych nádorových buniek po lúmenovej alebo subkutánnej (sc) implantácii nádorov HCT116-DsRed do NOD / SCID alebo NSG myší. Každý bod predstavuje údaje z jednotlivej myši. Sú tiež uvedené priemery ± sem. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001; **** P <0, 0001; t -test. NS, nevýznamné. ND, neurčené. ( c - g ) Vyhodnotenie metastáz u NSG myši nesúcej lúmenový nádor HCT116-DsRed pri 7 wpi je znázornené ( c ) hrubé hrubé črevo so šípkami označujúcimi metastázy primárneho nádoru a regionálnych lymfatických uzlín, ( d ) histológiu hrubého čreva s ľavým panelom zafarbené hematoxylínom a eozínom (H&E), vyznačená oblasť v rámčeku bola zväčšená na pravom paneli a zafarbená na Col IV (zelená), DsRed (červená) a 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (modrá) a šípky označujú metastázy regionálnych lymfatických uzlín, e ) rôzne orgány toho istého hostiteľa s jasne viditeľnými metastázami pečene a pľúcne metastázy označené šípkami, f ) histológia pečene s ľavým panelom zafarbeným H&E, pravým panelom zafarbené na Col IV (zelená) ), DsRed (červená) a DAPI (modrá) a bodkované čiary označujúce obvod metastatických uzlín v pečeni a ( g ) histológiu pľúc s ľavým panelom zafarbeným H&E a pravým panelom zafarbeným na Col IV (zelený), DsRed ( červená) a DAPI (modrá). ( h, i ) Hodnotenie metastázy myši NSG nesúce nádor HCT116-DsRed sc pri 7 wpi, ukazujúce ( h ) pečeň a pľúca a ( i ) pridružený primárny sc nádor. j ) Počet cirkulujúcich nádorových buniek pri 6–7 wpi po implantácii nádorov HCT116-DsRed do lúmenu alebo sc do NOD / SCID alebo NSG myší. Údaje sú vyjadrené ako priemer a sem a sú vyjadrené ako počet nádorových buniek pozitívnych na DsRed v krvi na 1 x 106 životaschopných udalostí. Počet myší: lúmen NOD / SCID ( n = 12); NOD / SCID sc ( n = 9); Lúmen NSG ( n = 9); NSG sc ( n = 10). ** P <0, 01; *** P <0, 001; t -test. Mierka stupnice predstavuje 5 mm ( c ), 4 mm ( d, e, h, i ), 2 mm ( f, g ) a 1 mm ( d - rámcová oblasť).

Obrázok v plnej veľkosti

Aby sa určilo, či sú bunky HCT116 schopné metastázy bez ohľadu na miesto implantácie, implantovali sme bunky HCT116-DsRed subkutánne do myší NOD / SCID a NSG a hodnotili sme metastatické zaťaženie. Nádory subkutánne implantované v porovnaní s ich náprotivkami s implantovaným lúmenom sa v kmeňoch myší NOD / SCID (obr. 5a, b) a doplnkových obr. 5b, c) a NSG (obr. 5a, b, h, i) ľahko metastázovali., Histologické hodnotenie veľkosti a časovo zhodných 6-Wpi nádorov HCT116 u myší NOD / SCID odhalilo, že hoci subkutánne implantované nádory boli vysoko nekrotické, nádory implantované lúmenom takmer úplne neobsahovali nekrózu (doplnkový obrázok 5d, e). Túto absenciu nekrózy možno pripísať zvýšenej vaskularizácii v nádoroch s implantovaným lúmenom, čo dokazuje imunofarbenie MECA-32 pre endoteliálne bunky (doplnkový obrázok 5f – h), čo sa zase dá pripísať zvýšenej vaskulárnej denzite na sliznici verzus subkutánne. miesta implantácie. Vzhľadom na to, že tumory s implantovaným lúmenom vykazovali zvýšenú vaskulárnu hustotu súbežne so zvýšenými metastázami v porovnaní so subkutánne implantovanými nádormi, snažili sme sa zistiť, či počet cirkulujúcich nádorových buniek môže odrážať metastatický potenciál, ako sa uvádza v klinike 24 . Z toho vyplýva, že tumory s implantovaným lúmenom spôsobili ~ 100-krát viac cirkulujúcich nádorových buniek ako tumory s implantovaným subkutánnym podaním u myší NOD / SCID a NSG, pričom myši NSG, ktoré boli implantované do lúmenu, vykazujú ~ 2, 5-krát väčšie množstvo cirkulujúcich nádorových buniek ako lúmen. - implantované myši NOD / SCID (Obr. 5j). Preto robustná tvorba metastáz po implantácii lúmenov korelovala so zvýšenou primárnou vaskularizáciou nádorov, čo zase korelovalo so zvýšeným vstupom nádorových buniek do obehu. Celkovo tieto nálezy nepodporujú inherentný metastatický fenotyp v nádoroch HCT116, ale skôr zdôrazňujú skutočnosť, že rovnaké nádorové bunky môžu vykazovať drasticky odlišnú metastatickú kapacitu v závislosti od ich primárneho mikroprostredia nádoru.

Metastázy pečene nezávislé od sprostredkovateľa lymfatických uzlín

Doposiaľ žiadny in vivo model CRC nepreukázal predvídateľný a reprodukovateľný vzdialený metastatický rast v relevantných cieľových orgánoch od ortotopicky zisteného primárneho kolorektálneho nádoru 2, 3, 4, 5 . Nedostatok dostupných modelov znemožnil výskum cesty metastatického šírenia do vzdialených orgánov. Na klinike nie je známe, či kolorektálne metastázy v pečeni vznikajú sekundárne po počiatočnej kolonizácii regionálnych črevných lymfatických uzlín, alebo či tieto pečeňové metastázy vznikajú priamym hematogénnym šírením z primárneho nádoru, nezávisle od metastatického rastu lymfatických uzlín 1 . Prvá hypotéza je podporená zisteniami, že (i) štádiá stanovenia štádia sú založené na miere, do akej sa rakovina rozšírila; klinická prezentácia metastáz do lymfatických uzlín v samotnom štádiu svedčí o ochorení v štádiu III, zatiaľ čo prítomnosť metastáz v pečeni je príčinou pokročilejšej diagnostiky v štádiu IV 25, ii) bola hlásená vysoká súbežná incidencia v prípade vzdialených pečeňových metastáz a metastáz v lymfatických uzlinách v čreve 26, (iii) hustota primárnych nádorových lymfatických ciev koreluje s metastázami tak do lymfatických uzlín, ako aj do pečene 27, a (iv) vstup nádorových buniek do lymfatických buniek je pravdepodobne ľahší ako vstup do hematogénnej vaskulatúry kvôli diskontinuálnej bazálnej membráne a nedostatku pokrytia pericyte 28 . Niekoľko pozorovaní podporuje druhú hypotézu vrátane (i) toho, že niektorí pacienti s CRC sú prítomní s metastázami pečene v neprítomnosti postihnutia lymfatických uzlín 26, (ii) že chirurgické odstránenie zvýšeného počtu drenážových črevných lymfatických uzlín v štádiu III CRC pacientov nemusí zlepšujú celkové prežitie 29, 30, 31 a (iii) že žilová invázia do primárneho nádoru je nezávislým prognostickým ukazovateľom vzdialeného rozvoja metastáz v pečeni v CRC 32 . Po vyvinutí implantácie lúmenu ako metastatického modelu CRC sme mali jedinečnú pozíciu na vypočúvanie diseminačných ciest. U pacientov existuje korelácia medzi prítomnosťou / neprítomnosťou metastáz do lymfatických uzlín a prítomnosťou / neprítomnosťou metastáz v pečeni 26 ; zostáva však neznáme, či počet postihnutých lymfatických uzlín koreluje s počtom metastatických uzlín v pečeni. V našich modeloch implantácie lúmenu NOD / SCID a NSG nemala metastatická záťaž lymfatických uzlín (celkový počet zúčastnených lymfatických uzlín aj celková záťaž nádorových buniek pozitívnych na DsRed v lymfatických uzlinách) koreláciu s metastatickou záťažou pečene (obr. 6a, b). ), čo naznačuje, že k šíreniu do lymfatických uzlín a pečene by mohlo dôjsť rôznymi spôsobmi.

Image

( a, b ) Korelácie medzi metastatickým zaťažením lymfatických uzlín a metastatickým zaťažením pečene u myší s nádormi HCT116-DsRed s implantovaným lúmenom. Údaje sú celkový počet makroskopických pečeňových metastáz verzus buď celkový počet makroskopických metastáz do lymfatických uzlín alebo celkový počet nádorových buniek pozitívnych na DsRed v lymfatických uzlinách, v ( a ) myšiach NOD / SCID od 1–7 wpi alebo ( b) ) NSG myši od 5–7 wpi ( c - i ) Vplyv zamerania angiogenézy a / alebo lymfangiogenézy na tvorbu metastáz regionálnych lymfatických uzlín a vzdialených pečeňových metastáz u myší NOD / SCID nesúcich tumory HCT116-DsRed s implantovaným lúmenom pri 6–7 wpi Zobrazené sú ( c ) hrubé sérové ​​obrázky hrubého čreva so šípkami označujúcimi metastázy črevnej lymfatickej uzliny, ( d ) objemy primárneho nádoru, ( e ) počet makroskopických metastáz lymfatických uzlín, ( f ) počet makroskopických metastáz pečene, ( g ) hrubé zobrazenie pečene so šípkami označujúcimi metastázy, ( h ) DsRed-pozitívne nádorové bunkové zaťaženie v pečeni spolu s kontrolnými analýzami od myší bez nádoru ( n = 8), s údajmi vyjadrenými ako počet DsRed-pozitívnych nádorových buniek na 1 × 106 cez krvácanie a ( i ) pohotovostné analýzy porovnávajúce počet myší s pečeňovými makrometastázami alebo bez nich pri 6–7 wpi, s údajmi vyjadrenými ako percento myší v každej kategórii. Počet myší na liečený stav: neošetrené ( n = 22 pre d - f a n = 13 pre h a i ), anti-VEGF-A ( n = 9), anti-VEGF-C ( n = 8), anti-VEGF -VEGF-A / C ( n = 10 pre d - f a n = 9 pre h a i ). j ) Analýza pre prípad nepredvídaných udalostí porovnávajúca počet myší s pečeňovými mikrometastatickými DsRed-pozitívnymi bunkami alebo bez nich pri 3 wpi, pred prejavom makroskopickej metastázy, s údajmi vyjadrenými ako percento myší v každej kategórii. Každý bod v a, b, d - f a h predstavuje údaje z individuálnej myši. Sú tiež uvedené priemery ± sem. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001; **** P <0, 0001; skupinové rozdiely - t- test; pohotovostné analýzy - Fisherov exaktný test. NS, nevýznamné. Mierka stupnice predstavuje 5 mm ( c ) a 2 mm ( g ).

Obrázok v plnej veľkosti

Vzhľadom na to, že vaskulárne endoteliálne rastové faktory (VEGF) majú kritickú úlohu v primárnej vaskularizácii nádorov 33, pričom VEGF-A a VEGF-C primárne fungujú na podporu hematogénnej a lymfatickej vaskularizácie, respektíve 34, 35, hodnotili sme účinky protilátok blokujúcich funkciu proti tieto faktory metastatického šírenia v našom modeli. Za týmto účelom boli hostiteľské myši liečené anti-VEGF-A protilátkou 36 alebo novo charakterizovanou anti-VEGF-C protilátkou 37 jedenkrát týždenne, začínajúc jeden deň pred implantáciou lumenov nádoru HCT116-DsRed a tvorba metastáz bola hodnotená v 6– Obrázok 7 wpi Anti-VEGF-A inhiboval tvorbu makroskopických metastáz v pečeni (obr. 6f, g), čo sa potvrdilo znížením záťaže nádorových buniek pozitívnych na DsRed (obr. 6h) a percentuálneho podielu myší, ktoré sa prejavili postihnutím pečene. (Obr. 6i). Anti-VEGF-A tiež zoslabil (obr. 6e), ale nevylúčil (obr. 6c) rast metastáz hrubých lymfatických uzlín, čo je v súlade s jeho úlohou pri podpore rastu metastatických nádorov lymfatických uzlín podporovaním angiogenézy 38 . Na rozdiel od toho, napriek takmer úplnému zrušeniu metastáz do lymfatických uzlín (Obr. 6e), anti-VEGF-C významne neinhiboval tvorbu metastáz v pečeni (Obr. 6f, g), a teda neznížil záťaž nádorových buniek pozitívnych na DsRed. pečeň (obr. 6h). Anti-VEGF-C tiež nemal žiadny vplyv na percento myší, ktoré vykazovali pečeňové makrometastázy (Obr. 6i). Kombinovaná liečba s anti-VEGF-A a anti-VEGF-C protilátkami inhibovala tvorbu metastáz do lymfatických uzlín a pečene (obr. 6e – g). Podobné výsledky sme získali pomocou alternatívneho modelu implantátu lúmenu LS174T-DsRed (doplnkový obrázok 6a, b). Aby sa zohľadnili rozdiely v objeme primárneho nádoru po liečbe protilátkami (obr. 6c, d), normalizovali sme metastatickú záťaž pečene na objem primárneho nádoru vo všetkých liečebných ramenách a potvrdili sme, že blokáda metastázy lymfatických uzlín sprostredkovaná anti-VEGF-C o tvorbe metastáz v pečeni (doplnkový obrázok 6c, d). Aj keď naše údaje podporujú úlohu VEGF-A, ale nie VEGF-C pri tvorbe metastáz v pečeni CRC, či už anti-VEGF-A inhiboval rast nádorových buniek, ktoré už naočkovali pečeň, alebo či anti-VEGF-A priamo inhiboval primárny nádor. diseminácia buniek do pečene zostala neistá. Skutočne bolo zacielenie VEGF-A dobre zdokumentované na inhibíciu rastu buniek CRC, ktoré kolonizovali pečeň po priamej intrasplenickej injekcii 39 . Na zodpovedanie tejto otázky sme ošetrili nádorové myši s HCT116-DsRed anti-VEGF-A a hodnotili sme pečeň pri 3 wpi - pred prejavom makroskopických pečeňových metastáz (obr. 4d, e)) - pre mikrometastatické nádorové bunky pozitívne na DsRed prietoková cytometria. Anti-VEGF-A významne znížil počet myší s detegovateľnými diseminovanými nádorovými bunkami v pečeni (Obr. 6j). Celkovo tieto zistenia ukazujú, že metastázy buniek CRC z primárneho nádoru do pečene môžu nastať priamym hematogénnym šírením, nezávisle od metastatického sprostredkovateľa lymfatických uzlín.

diskusia

Napriek dostupnosti mnohých myších CRC modelov, ktoré rekapitulujú vývoj primárnych chorôb, žiadny taký model nebol vhodný na skúmanie metastatických diseminačných ciest, pretože tvorba metastatických lézií v týchto modeloch je zriedkavá alebo neexistuje. Vyvinuli sme myšací model metastatického CRC, ktorý vedie k selektívnemu a spoľahlivému rastu metastáz v príslušných cieľových orgánoch. Vývoj tohto modelu nám umožnil priamo vyšetrovať cesty metastatického šírenia a preukázať, že k šíreniu CRC do pečene môže dôjsť nezávisle od predchádzajúcej kolonizácie lymfatických uzlín - problém, ktorý bol kontroverzný a doteraz neprekonateľný. Tieto výsledky môžu mať dôležité dôsledky pre štádium ochorenia CRC, pretože ochorenie štádia III pozitívne na lymfatické uzliny a ochorenie štádia IV pozitívne na vzdialené metastázy možno vnímať ako paralelné (skôr ako postupné) progresie z lokalizovaného ochorenia stupňa II.

Náš model má okrem odhalenia ciest šírenia buniek CRC z primárneho nádoru do vzdialených miest potenciál experimentovať aj so zameraním na zavedené metastatické lézie. Skutočne, nedostatok dostupných myších metastatických modelov CRC sa ukázal byť prekážkou pri skúmaní príčin metastatického ochorenia a terapeutickej odpovede lézií, ktoré spontánne metastázovali z primárneho nádoru. Je čoraz jasnejšie, že primárne CRC a ich následné párované metastázy v pečeni sú geneticky aj biologicky odlišné 40, 41, 42, 43 . Pretože úmrtnosť pacientov na CRC je primárne výsledkom vzdialeného metastatického rastu, existuje mandát na vyšetrovanie terapeutických cieľov prítomných v zavedených metastázach - nielen primárneho nádoru. Vývoj myších modelov, ktoré presne odrážajú nastavenie metastatických chorôb, je nevyhnutný na splnenie tohto mandátu. Naše zistenia predstavujú významný biologický pokrok v porozumení mechanizmov chorôb CRC s potenciálom podporovať objav nových terapeutických stratégií a zásahov.

metódy

myši

Samice myší divého typu C57BL / 6J a NOD / SCID (vo veku 8 až 12 týždňov) boli zakúpené od Charles River Laboratories. Samice myší NSG divokého typu (vo veku 8 až 12 týždňov; skladové číslo 005557), myši Apc Min / + (skladové číslo 002020) a myši 12, 4 KbVilCre (skladové číslo 004586; označované ako Villin-Cre ) sa kúpili od Jacksona. Laboratory. Myši Kras LSLG12D / + boli licencované od Tyler Jacks z Massachusetts Institute of Technology. Myši s mutáciou Apc / Kras z kolónie číslo 4028 boli chované s myšami CAG-mRFP1 (zásobné číslo 005884) zakúpenými v Jackson Laboratory. Myši mutantnej zlúčeniny Apc / Kras z kolónie číslo 4700 boli chované myšami Rosa26-CAG-LSL-tdTomato (zásobné číslo 007909) zakúpenými od Jackson Laboratory. Všetky experimenty boli schválené Výborom pre etický výskum a kontrolu protokolov v Genentechu.

Bunková kultúra a prenos génov

Bunkové línie odvodené z ľudských CRC HCT116 a LS174T boli zakúpené od ATCC a udržiavané v kompletnom médiu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (RPMI 1640 doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom, 2 mM glutamínom, 100 U ml -1 penicilínu a 100 mg ml). -1 streptomycín) pri 37 ° C a 5% CO2. Bunky boli transdukované lentivírusovým vektorom červeného fluorescenčného proteínu TZV-CMV-Discosoma (DsRed) (Open Biosystems) pri multiplicite infekcie 10 v kompletnom RPMI médiu doplnenom 8 mg ml- 1 polybrénu počas 6 hodín pri 37 ° C. a 5% C02. Po štyroch pasážach v kultúre boli DsRed-pozitívne bunky izolované fluorescenčne aktivovaným triedením buniek na FACSAria (BD Biosciences). Roztriedené DsRed-pozitívne bunky boli expandované na 2 až 3 pasáže a potom uložené v tekutom dusíku. Bunky včasného prechodu boli použité pre všetky experimenty in vivo .

Tvorba subkutánneho nádoru

Bunkové línie sa zozbierali trypsinizáciou, spočítali sa s trypánovou modrou, aby sa vyhodnotila životaschopnosť, a resuspendovali sa v studenom kompletnom RPMI médiu v koncentrácii 100 x 106 buniek ml- 1 . Do bunkovej suspenzie sa pridal studený matrigel (BD Biosciences) v pomere 1: 1, aby sa dosiahla konečná koncentrácia buniek 50 x 106 buniek ml- 1 . Myšiam NOD / SCID bolo injekčne podaných 5 x 106 buniek v objeme 100 ul subkutánne do ľavého boku. Rozmery nádoru boli merané pomocou posuvných meradiel a objem nádoru bol vypočítaný ako 0, 523 x dĺžka x šírka x šírka. Pre subkutánne nádory používané ako darcovia pre techniku ​​implantácie lúmenu sa nádory odobrali medzi 1 000 - 2 000 mm 3, nekrotické tkanivo sa hlboko oddelilo pod mikroskopom a zostávajúce životaschopné tkanivo sa rozdelilo na fragmenty 10 mm 3 a umiestnilo sa na ľad v kompletnom médiu RPMI.,

Technika implantácie lúmenu

Myši sa anestetizovali pomocou inhalácie izofluranu, umiestnili sa do polohy na chrbte a končatiny sa pripevnili páskou na plošinu pokrytú gázou. Hemostat s tupými koncami (Micro-Mosquito, č. 13010-12, Fine Science Tools) sa vložil ~ 1 cm do konečníka a hemostat sa naklonil smerom k sliznici a mierne sa otvoril tak, že jediný záhyb sliznice sa mohol uzavrieť zatváraním hemostat do prvého zárezu. Hemostat bol stiahnutý z konečníka a zovretá vonkajšia sliznica bola očistená povidónom / jódom, opláchnutá roztokom laktátových krúžkov a vysušená. Fragment nádoru darcu alebo intaktný polyp s veľkosťou asi 10 mm3 bol zošitý na sliznicu pomocou absorbovateľných 4-0 Vicrylových stehov (Ethicon), čím sa zaistilo, že stehy prenikli iba do povrchovej slizničnej vrstvy. Po rehydratácii sliznice fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátmi (PBS) sa hemostat uvoľnil a ihla s tupou žalúdočnou sondou sa použila na opätovné vloženie vonkajšieho hrubého čreva spolu so zošitým nádorom, čím sa zvrátil rektálny prolaps. Priemerná vzdialenosť implantácie nádoru bola 11, 8 ± 0, 5 mm od konečníka ( n = 18). Úmrtnosť po operácii bola menšia ako 1%, s morbiditou pri 2–4 wpi pripísateľnou reverzibilnému rektálnemu prolasu u menej ako 5% myší a morbiditou pri 7 wpi pripísateľnou úbytku hmotnosti v dôsledku zvýšeného nádorového zaťaženia. Miery odobratia nádoru pre rôzne typy darcovských nádorov a kmene hostiteľských myší sú zhrnuté v doplnkovej tabuľke 1. Aby sa minimalizovala dislokácia nádoru počas defekácie, myši sa umiestnili na vložky do klietky a kŕmili sa 100% tekutou stravou pre hlodavce (AIN-76A, hydrolyzát kazeínu bez vláknina; BioServe) od 3 dní pred operáciou do 7 dní po operácii.

endoskopia

Pred endoskopickým zobrazením sa myši anestetizovali inhaláciou izofluranu, umiestnili sa do polohy na chrbte a ich hrubé črevo sa vyprázdnilo stolicou pomocou sondy na sondu. Endoskopické zobrazovacie zariadenie sa skladalo z ďalekohľadu Hopkins II s uhlom 0 ° priamočiara, priamy priemer 1, 9 mm, ktorý je súčasťou vyšetrovacieho a ochranného puzdra, trojčipovej digitálnej kamery s vysokým rozlíšením Image-1 pripojenej k pridržiavaciemu systému ďalekohľadu Mikata Point Setter, optického svetla vodiaci kábel pripojený k xenónovému svetelnému zdroju D Light System, elektronickému insuflátoru CO 2 na udržanie insuflácie hrubého čreva počas zobrazovania, a dokumentačný systém s vysokým rozlíšením AIDA Connect pripojený k farebnému monitoru s vysokým rozlíšením (Karl Storz). Endoskopické videá boli skontrolované pomocou VLC Media Player (VideoLAN Team) a statické obrázky boli zachytené z týchto videí.

Zobrazovanie celého orgánu a hodnotenie makrometastáz

Stlpce sa odobrali neporušené, prepláchli sa PBS, otvorili sa pozdĺžne, pritlačili sa na tenké kartónové kúsky a zobrazili sa sliznicovo a sérologicky. Pečene a pľúca sa odobrali, premyli sa v PBS a zobrazili sa. Všetky orgány sa zobrazili pomocou farebného digitálneho fotoaparátu DFC295 (Leica) pripojeného k stereomikroskopu M80 (Leica). Tvorba makroskopických metastáz bola hodnotená vizuálne pomocou stereomikroskopu S4 (Leica). V prípade intestinálnych lymfatických uzlín bol vyšetrený celý intestinálny trakt od konečníka do žalúdka na dôkaz postihnutia lymfatických uzlín a kvantifikovaný bol počet makrometastáz. Pokiaľ ide o pečeň a pľúca, skúmal sa celý vonkajší povrch celých orgánov a kvantifikoval sa počet makrometastáz. Po kvantifikácii makrometastázy boli orgány fixované v 4% paraformaldehyde v PBS cez noc. Pred fixáciou cez noc v 4% paraformaldehyde sa pľúca premývali 4% paraformaldehydom v PBS. Primárne rozmery hrubého čreva a konečníka sa určili pomocou referenčnej meracej škály a objem nádoru sa vypočítal ako 0, 523 x dĺžka x šírka x šírka.

Trávenie tkanív a prietoková cytometria

Celé tkanivá sa spracovali na disociátore GentleMACS (Miltenyi Biotec), digerovali sa v kompletnom RPMI médiu doplnenom 1 mg ml- 1 kolagenázy / disperzie počas 30 minút pri 37 ° C za trepania pri 210 ot./min. A filtrovali sa cez 70 um filter. Po lýze červených krviniek a centrifugácii boli bunky resuspendované v PBS doplnenom 2% fetálnym hovädzím sérom, 20 mM HEPES a 5 μg ml -1 propidiumjodidu, prefiltrované do skúmaviek s triedením buniek aktivovaných fluorescenciou (FACS) a analyzované prietokom FACSAria cytometer (BD Biosystems). Pre FACS kontroly sa použili normálne tkanivá od myší, ktoré nesú nádor, a DsRed-pozitívne analytické brány sa stanovili tak, že v kontrolných vzorkách tkanív sa detegovali nulové DsRed-pozitívne udalosti. Na vzorku sa analyzovalo v priemere 5 x 106 životaschopných udalostí. Dáta boli analyzované pomocou softvéru FlowJo a vyjadrené ako počet DsRed-pozitívnych buniek na 1 x 106 životaschopných udalostí.

Cirkulujúce nádorové bunky

Myši boli usmrtené inhaláciou C02. Ihneď po útlme dýchania bola klietka rebra otvorená, aby sa odhalilo srdce. Injekčná striekačka vybavená ihlou s kalibrom 27 bola vložená do pravej srdcovej komory a bolo odobraných ~ 500 ul krvi. Krv sa okamžite preniesla do mikrotainerových skúmaviek potiahnutých EDTA (BD Biosciences). Po lýze červených krviniek boli vzorky krvi resuspendované v PBS doplnenom 2% fetálnym hovädzím sérom, 20 mM HEPES a 5 μg ml -1 propidiumjodidu a analyzované prietokovou cytometriou. Na kontroly FACS sa použila krv z myší bez nádoru a stanovili sa DsRed-pozitívne analytické brány, takže v kontrolných vzorkách krvi sa detegovali nulové DsRed-pozitívne udalosti. Na vzorku sa analyzovalo v priemere 5 x 106 životaschopných udalostí. Dáta boli analyzované pomocou softvéru FlowJo a vyjadrené ako počet DsRed-pozitívnych buniek na 1 x 106 životaschopných udalostí.

Ľudské klinické vzorky CRC

Vzorky čerstvej ľudskej rakoviny hrubého čreva a konečníka boli získané od Bio-options Inc., od súhlasu pacientov v súlade s federálnymi a štátnymi pokynmi. Vzorky boli dodávané cez noc pri 4 ° C v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu obsahujúcom vysokú glukózu doplnenú 10% fetálnym hovädzím sérom, glutamínom, vankomycínom, metronidazolom, cefotaxímom, amfotericínom B, penicilínom, streptomycínom a inhibítorom proteázového inhibítora. Vzorky boli narezané na fragmenty nádoru s veľkosťou ~ 10 mm3 a jednotlivé fragmenty boli implantované do obličkových kapsúl athymických samcov myší nu / nu (vo veku 6 až 8 týždňov) zakúpených od spoločnosti Harlan Sprague Dawley. Šesť mesiacov po implantácii boli nádory, ktoré rástli pod obličkovou kapsulou, implantované subkutánne, aby sa vytvoril zdroj podkožného darcu. Fragmenty donorového nádoru s veľkosťou približne 10 mm3 sa implantovali do lúmenov hrubého čreva myší NOD / SCID alebo NSG.

Anti-VEGF-A a anti-VEGF-C protilátky

Myšiam sa podávala in vivo anti-VEGF-A klon G631 monoklonálna protilátka 36 a / alebo anti-VEGF-C klon VC4.5 monoklonálna protilátka 37 . VC4.5 bol izolovaný z knižníc syntetických fágových protilátok vybudovaných na jedinej kostre 44 selekciou proti maturovanej forme ľudského VEGF-C (R&D Systems). Jeden pozitívny klon VC4 ako IgG s úplnou dĺžkou sa overil na blokovanie interakcie medzi ľudským VEGF-C a ľudským VEGFR3, inhibíciu VEGF-C-indukovanej bunkovej aktivity a krížového viazania myšieho VEGF-C. VC4 bol ďalej vylepšený afinitou na VC4.5 pri výbere 45 fágového displeja a ukázalo sa, že zlepšuje účinnosť blokovania VEGF-C z väzby na receptor a bunkovej signalizácie. VC4.5 vykazuje podobnú afinitu k ľudskému a myšaciemu VEGF-C (Kd = 0, 3 - 1 nM), ako bolo stanovené meraním rezonancie povrchovej plazmonovej rezonancie s použitím prístrojov BIAcore imobilizáciou buď VC4.5 IgG alebo VEGF-C na čipe.

Cievne zacielenie

Jeden deň pred implantáciou lúmenu boli myši NOD / SCID ošetrené funkčnými blokujúcimi monoklonálnymi protilátkami anti-VEGF-A (G6-31; 5 mg kg- 1 v PBS) a / alebo anti-VEGF-C (VC4, 5; 40 mg kg -1 v PBS) intraperitoneálnou injekciou. V deň 0 boli implantované fragmenty nádoru HCT116-DsRed alebo LS174T-DsRed na sliznicu hrubého čreva. Protilátky sa podávali raz týždenne.

Histopatológia a imunofarbenie

Tkanivá boli fixované v 4% paraformaldehyde v PBS cez noc, premyté v PBS, kryoprotektované v 30% sacharóze v PBS cez noc pri 4 ° C, vložené do zlúčeniny s optimálnou teplotou rezania a zmrazené pri -80 ° C a narezané na 8 um. Na histopatologické analýzy boli tkanivové rezy zafarbené hematoxylínom a eozínom s použitím Jung Autostainer XL (Leica) a skenovanie celej tkanivovej sekcie bolo získané použitím nanozooméru (Hamamatsu). Na imunohistochemické analýzy boli tkanivové rezy inkubované s primárnou protilátkou cez noc pri 4 ° C a sekundárnou protilátkou počas 30 minút pri teplote miestnosti. Ako primárne protilátky sa použili králičie anti-kolagén IV (polyklonálne ab6586; Abcam; riedenie 1: 100), kozie anti-DsRed (polyklonálne sc-33354; Santa Cruz Biotechnology; riedenie 1: 100) a potkanie anti-pan endotelové bunkové markery (klon). MECA-32; Pharmingen; 2 μg ml- 1 ). Použité sekundárne protilátky boli konjugované s Alexa Fluor 488 alebo 594 (Invitrogen). Obrázky sa získali na zobrazovacom mikroskope Axioplan 2 (Zeiss) digitálnym fotoaparátom ORCA-ER (Hamamatsu). Vaskulárna hustota bola vyjadrená ako pomer MECA-32-pozitívnej vaskulárnej oblasti k celkovej 4 ', 6-diamidino-2-fenylindolovo-pozitívnej životaschopnej nádorovej oblasti vynásobenej 100. Histologické vzorky boli preskúmané vyškoleným patológom s odbornosťou na choroby CRC.,

Štatistické analýzy

Rozdiely v skupinách boli vyhodnotené dvojstranným Studentovým t- testom. Korelácie boli vyhodnotené Pearsonovými korelačnými koeficientmi. Analýza nepredvídaných udalostí sa vyhodnotila pomocou obojstranného Fisherovho exaktného testu, pričom sa ako vstupné údaje použili skutočné čísla myší. Pre analýzy prežitia podľa Kaplana-Meiera sa hodnoty P vypočítali pomocou Log-rank testu a pomery nebezpečenstva sa vypočítali pomocou Apc Min / + ; Myši Villin-Cre ako porovnávací prostriedok. Hodnoty P menšie ako 0, 05 sa považovali za významné.

Ďalšie informácie

Ako citovať tento článok: Enquist, IB et al. Metastáza pečene nezávislá od lymfatických uzlín v modeli metastatického kolorektálneho karcinómu. Nat. Commun. 5: 3530 doi: 10, 1038 / ncomms4530 (2014).

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplnková informácia

    1 až 6 a doplnková tabuľka 1

Komentáre

Odoslaním komentára súhlasíte s tým, že budete dodržiavať naše zmluvné podmienky a pokyny pre komunitu. Ak zistíte, že je niečo urážlivé alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte ho ako nevhodné.