Nanosheety na báze kovových a organických štruktúr na báze lantanoidov s jedinečnými vlastnosťami fluorescenčného zhášania pre dvojfarebné intracelulárne zobrazenie adenozínu v živých bunkách | npg materiály pre Áziu

Nanosheety na báze kovových a organických štruktúr na báze lantanoidov s jedinečnými vlastnosťami fluorescenčného zhášania pre dvojfarebné intracelulárne zobrazenie adenozínu v živých bunkách | npg materiály pre Áziu

Anonim

predmety

  • biosenzory
  • Kovovo-organické rámce

abstraktné

Dvojrozmerné (2D) materiály vzbudili obrovský záujem ako zhášače fluorescencie biomolekúl označených farbivom na použitie v biosenzíve. Nanosheety s kovovo-organickou štruktúrou (MOF), ako nový typ 2D materiálu, sa zriedka študovali ako bioanalytické platformy. Tu syntetizujeme sériu MOF (MOF-Ln) ultratenkých lantanoidov ako farbivom značenú aptamérovú platformu. Fluorescenčné zhášanie alebo regenerácia na nanočastiach MOF-Ln je určená nábojovými vlastnosťami (pozitívnymi alebo negatívnymi) značených fluoroforov. Negatívne nabité fluorofory zažívajú fluorescenčný proces „down-down“ a následne „down-down“, zatiaľ čo v prípade pozitívne nabitých fluoroforov dochádza k „fluorescenčnému„ down-down nasledovanému procesom “. Zaujímavé vlastnosti zhášania fluorescencie nanočastíc MOF-Ln z nich robia vynikajúcu dvojfarebnú snímaciu platformu pre intracelulárnu detekciu biomolekúl.

úvod

Dvojrozmerné (2D) nanomateriály priťahujú rozsiahly výskumný záujem kvôli svojim jedinečným fyzikálnym a chemickým vlastnostiam, ako aj ich potenciálnym vedeckým a technologickým aplikáciám v oblasti ukladania plynu, snímania, elektroniky, premeny a ukladania energie a elektrokatalýzy. 1 V oblasti biomedicínskych aplikácií sa 2D nanosheety s extrémne vysokou povrchovou plochou, ako napríklad grafén a jeho derivátový oxid grafénu, úspešne používajú na biomedicínske zobrazovanie, dodávanie liekov a liečbu rakoviny. 2, 3 Iné vznikajúce nanosheety (napríklad MoS 2, WS 2 a Mn02) s dobrou schopnosťou potlačenia fluorescenciou tiež vykazujú selektívnu adsorpčnú afinitu voči jednovláknovej DNA ( ss DNA) verzus dvojvláknová DNA ( ds DNA). 4, 5, 6, 7 Tieto výsledky inšpirovali štúdie na využitie potenciálnych biologických aplikácií nových 2D nanosheet. Veľmi nedávno boli tenké filmy alebo nanosheety v 2D kovovej organickej štruktúre (MOF) úspešne syntetizované a exfoliované niekoľkými skupinami. 8, 9, 10 Ich potenciálne biologické aplikácie sa ešte len musia preskúmať.

MOF sú fascinujúcou triedou funkčných materiálov, ktoré boli rozsiahle študované pre aplikácie v skladovaní plynu, katalýze 11, separácii 12 a snímaní. 14 MOF sú určite veľmi sľubné na výrobu multifunkčných luminiscenčných senzorov, pretože tak jednotky kovu, ako aj ligandy môžu poskytovať platformy na generovanie luminiscencie a niektoré hosťujúce molekuly naložené na MOF môžu tiež emitovať alebo indukovať luminiscenciu. 14 Rôzne MOF už boli navrhnuté a syntetizované na chemické a biochemické snímanie. 15 Ich mikrometrické monokryštály alebo polykryštalické prášky obmedzujú ich použitie v biologických systémoch, najmä zobrazovanie in vivo a uvoľňovanie liečiva. Preto sa osobitný záujem sústredil na miniaturizáciu štruktúr MOF do režimu nanometrov. 16, 17

V porovnaní s existujúcimi nanomateriálmi (ako sú anorganické kvantové bodky, Au nanočastice a organické lipozómy a polyméry) majú MOF (nanomateriály) (NMOF) potenciálne výhody ako nové platformy pre nanomedicínu. Na jednej strane NMOF vykazujú vyššiu úroveň štrukturálnej prispôsobiteľnosti (vrátane veľkosti pórov, tvaru a morfológie) správnym výberom a kombináciou kovových iónov a mostíkových ligandov. Na druhej strane sú NMOF prirodzene biologicky odbúrateľné po dokončení zamýšľanej úlohy. Nedávno sa skúmalo niekoľko NMOF ako nanokarbérov pre biomedicínske zobrazovanie a dodávanie liekov. 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 Lin a spolupracovníci 19, 23 použili NMOF na uvoľňovanie liečiv alebo na vytvorenie cytotoxických reaktívnych kyslíkových (napríklad 1 O 2 ) druhov na liečbu rakoviny. 22 Tiež použili fluorescenčné NMOF na snímanie intracelulárneho pH v reálnom čase v živých bunkách. 20 Hoci je ich štúdia stále v plienkach, NMOF vykazovali veľký potenciál ako nový typ terapeutickej a / alebo biologickej zobrazovacej platformy.

Vzhľadom na dobré biologicky odbúrateľné vlastnosti a štrukturálnu prispôsobiteľnosť NMOF sme pripravili sériu nových nanočastíc MOF (MOF-Ln) na báze lantanidu a preskúmali sme ich použitie ako snímacej platformy na báze aptaméru na detekciu DNA a malých biomolekúl. Objemové kryštály MOF-Ln sa pripravili s použitím kyseliny 2, 2'-tiodioctovej (S (CH2COO) 23-, TDA) ako premosťujúceho ligandu. Použitím lítiovej interkalačnej metódy bolo 25 MOF-Ln kryštálov exfoliovaných do ultratenkých MOF-Ln nanosheet. Ako nanočastice DNA adsorbovali MOF-Ln nanosheety farbivom značenú ss DNA sondu prostredníctvom van der Waalsovej sily, ktorá znížila intenzitu fluorescencie farbív (tetrametylrodín (TAMRA) a fluoresceín (FAM)) v dôsledku prenosu náboja z farbte molekuly na ióny lantánu. Pokiaľ bola prítomná cieľová DNA, hybridizovala s farbivom značenou DNA na nanočastiach MOF-Ln. Vytvorená farbená ds DNA oddelená od nanočastíc MOF-Ln v dôsledku zníženej adsorpčnej afinity spôsobenej rigiditou dvojreťazcovej štruktúry, čo vedie k získaniu fluorescencie TAMRA- ds DNA, ako už bolo pozorované v tradičnom 2D nanosondy. 26, 27 Fluorescencia FAM-značenej ds DNA sa však neočakávane zastavila. Tento fenomén preukázal, že po hybridizácii s cieľovou DNA došlo u TAMRA-DNA k „fluorescenčnej“ fluorescenčnej odpovedi, zatiaľ čo k „DNA“ k odozve došlo u FAM-DNA.

Na základe týchto zistení sme navrhli nanoseetový komplex adenozín-5'-trifosfát (ATP) -aptamér / MOF-Ln na sledovanie aktivity ATP v živých bunkách. ATP aptaméry značené FAM a TAMRA sa použili na zostavenie viacerých nanočastíc farbiva-aptaméru / MOF-Ln. Úpravou molekulového pomeru TAMRA-aptaméru k FAM-aptaméru nanesenému na nanosheety farbív-aptamér / MOF-Ln sa tieto použili ako dvojfarebné nanosondy na testovanie aktivity ATP. Nanosheety farbív-aptamér / MOF-Ln dávali na začiatku zelenú fluorescenčnú farbu. Po interakcii s ATP sa aptamér zmenil na štruktúry vnútornej slučky a oddelil sa od nanočastíc MOF-Ln, čo viedlo k zmene fluorescenčnej farby na červenkastú oranžovú („obrátenie“ pre TAMRA-aptamér a „zníženie“ pre FAM-aptamer). Okrem toho sa nanosheety farbív-aptamér / MOF-Ln úspešne použili na zacielenie intracelulárneho ATP. Výsledky ukazujú, že dvojfarebná nanoprobe poskytuje citlivú zmenu fluorescencie alebo farby pre ATP a sľubuje, že bude ideálnou diagnostickou metódou na meranie ATP v živých bunkách.

Experimentálne procedúry

Syntéza MOF-Lns

Použila sa aj zmes TDA (0, 8 mmol) a La (N03) 3 (0, 4 mmol) (Nd (N03) 3, Eu (N03) 3, Tb (N03) 3 a Er (N03) 3 ) sa rozpustí v 20 ml roztoku NaOH (75 ml) a uzavrie sa v 30 ml liekovke. Zmes reagovala pri 140 ° C počas 24 hodín.

Exfoliácia MOF-Lns

Exfoliácia MOF-Lns sa uskutočnila nasledovne: 5 mg prekurzora MOF-Ln sa suspendovalo v 2 ml EtOH. Zmes bola podrobená pôsobeniu ultrazvuku počas 30 minút. Čiastočne exfoliované MOF-Lns sa potom zozbierali centrifugáciou pri rýchlosti 8000 ot / min a dvakrát sa n- hexánom. Na ďalšie odlupovanie sa zozbierané MOF-Lns suspendovali v 10 ml 0, 16 M n -butyllítia v hexáne a miešali sa 20 hodín pri 25 ° C pod atmosférou N2. MOF-Lns interkalované s Li sa následne umiestnili do EtOH / H20 (9/1, obj./obj . ) Na 1 hodinu. Finálne pripravené nanosheety MOF-Ln sa získali odstredením (14 000 ot / min).

Fluorescenčné snímanie DNA

Pri typickom meraní bola fluorescenčná sonda P1 (20 nM FAM-P1 alebo 15 nM TAMRA-P1) zmiešaná s nanočasmi MOF-Ln (0, 2 mg ml- 1 ) v 10 mM fosfátom pufrovanom soľnom roztoku (PBS). tlmivý roztok (pH 7, 4) obsahujúci 100 mM NaCI a 4 mM MgCl2 počas 5 minút. Potom bola do zmesi pridaná cieľová DNA TI s rôznymi koncentráciami (od 2 do 50 nM) a hybridizovaná s P1 počas 5 minút pri laboratórnej teplote. Zmerala sa fluorescencia zmesi.

Detekcia fluorescenčného adenozínu

FAM-značená AAA (FAM-P2, 20 nM) alebo TAMRA-značená AAA (TAMRA-P2, 15 nM) fluorescenčná sonda sa inkubovala s MOF-La nanosheetmi (0, 2 mg ml- 1 ) v 10 mM PBS pufra (pH 7, 4) obsahujúceho 100 mM NaCI a 4 mM MgCl2 počas 5 minút. Potom roztok ATP (uridíntrifosfát, guanozíntrifosfát, cytidíntrifosfát, glutatión, ľudský sérový albumín, kyselina askorbová alebo histamín) s vhodnou koncentráciou (30 nM pre roztok FAM-P2 + MOF-La a 25 nM pre roztok TAMRA- Roztok P2 + MOF-La) sa pridal k roztoku P2 + MOF-La. Po ponechaní zmesi inkubovať 10 minút pri teplote miestnosti sa zaznamenali fluorescenčné spektrá zmesi.

Bunková kultúra

Bunky ľudského karcinómu prsníka MCF-7 sa kultivovali v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu s 10% fetálneho hovädzieho séra, 5% penicilín streptomycín glutamínu a 5% pyruvátu sodného (všetko od GIBCO, Grand Island, NY, USA) pri zvlhčovaní pri 37 ° C. atmosféra obsahujúca 5% CO2.

Dvojfarebné zobrazenie adenozínu v živých bunkách

Komplex AAA + MOF-La označený farbivom (Dye-P2 + MOF-La) bol pripravený nasledujúcim spôsobom: K 1 ml sa pridali 2 μl FAM-P2 (25 μM) a 2 μl TAMRA-P2 (25 μM). PBS pufor (0, 01 M, pH 7, 4) obsahujúci 100 mM NaCI a 4 mM MgCl2. Potom sa do zmesi pridali nanočastice MOF-La (0, 2 mg ml- 1 ). Zmes sa miešala 2 hodiny pri teplote miestnosti. Pripravený Dye-P2 + MOF-La sa zozbieral odstredením (14 000 ot / min) a redispergoval sa v 10 ml PBS (0, 01 M, pH 7, 4) obsahujúcom 100 mM NaCI a 4 mM MgCl2 s konečnou koncentráciou 0, 1 mg ml -1 pre ďalšie intracelulárne experimenty.

Jeden deň pred zobrazením sa bunky naočkovali na šesťjamkové doštičky, aby sa získala vhodná hustota. Potom sa do jamiek pridalo 20 ul zásobného roztoku Dye-P2 + MOF-La a inkubovalo sa 4 hodiny, aby sa pripravili bunky MCF-7 absorbované Dye-P2 + MOF-La. Pred zobrazením sa do jamiek pridal FMD (konečná koncentrácia: 300 nM) a inkuboval sa počas 30 minút na zobrazovanie mitochondrií. Potom bolo staré Eaglovo médium modifikované Dulbeccom odstránené a trikrát premyté pufrom PBS (0, 01 M, pH 7, 4). Obrázky sa získali použitím konfokálneho fluorescenčného mikroskopu.

Výsledky a diskusia

Kryštalizácia MOF-Lns

Ln koordinačné polyméry boli hydrotermálne syntetizované z Ln (N03) 3 (Ln = La, Nd, Eu, Tb a Er) a TDA ligandu v roztoku hydroxidu sodného. Získali sa kryštalické produkty (MOF-La, MOF-Nd, MOF-Eu a MOF-Tb) (doplnkový obrázok S1). Štruktúry kryštalických vzoriek MOF-Ln boli monitorované práškovou rôntgenovou difrakciou. Ako je znázornené na obrázku la, kryštalická MOF-Tb dobre korešpondovala s MOF-Eu {[Eu 2 (TDA) 3 ] · 2H20}, ktorá bola pripravená v našej predchádzajúcej práci 28 (obrázok 1b), ale líšila sa od MOF- La a MOF-Nd. Tento rozdiel v štruktúrach vzoriek MOF-Ln by mohol byť výsledkom kontrakcie lantanoidu. 29 Jednokryštalické rôntgenové difrakčné údaje ukázali, že MOF-La kryštalizoval v ortorombickej vesmírnej skupine Pbcn a bol formulovaný ako [La2 (TDA) 3 ] · 2H20, s koordinačnou štruktúrou nie úplne rovnakou ako je štruktúra MOF. -Eu (doplnková tabuľka S1). Zjednodušená štruktúra bunkových buniek MOF-La je znázornená na obrázku 1c; Ióny 3+ boli koordinované deviatimi atómami kyslíka a jedným atómom síry. Premostenie reťazcov TDA centrami La 3+ vytvorilo listy, ktoré vytvorili vrstvené štruktúry ako na obrázku 1d a doplnkovom obrázku S2. Podľa infračerveného spektra Fourierovej transformácie píky pochádzajúce zo skupiny COO koordinovaného TDA ligandu boli pri všetkých MOF-Lns 1650 a 1566 cm -1 . Výsledky ukázali, že ióny Ln 3+ (La 3+, Nd 3+, Eu 3+ a Tb 3+ ) boli koordinované s TDA rovnakým spôsobom (doplnkový obrázok S3). Ako je znázornené na obrázkoch skenovacej elektrónovej mikroskopie, všetky MOF-Lns sa spojili s 2D vrstvami (obrázok 2a1 a doplnkový obrázok S4).

Image

Štrukturálna charakterizácia MOF-Lns. a ) práškové rôntgenové difrakčné obrazce MOF-Lns. ( b ) 3D lamelárna štruktúra MOF-Eu pri pohľade pozdĺž a -axi. c ) koordinačné prostredie MOF-La. d ) 3D lamelárna štruktúra MOF-La pri pohľade pozdĺž osi.

Obrázok v plnej veľkosti

Image

Exfoliácia a charakterizácia nanočastíc MOF-Ln. a ) Obrázok MOF-La snímacej elektrónovej mikroskopie (SEM) v hromadnom stave. ( a 2 a b 1) SEM a TEM snímky nanočastíc MOF-La pripravené ultrazvukom počas 30 minút. ( a 3, b 2 a b 3) SEM a TEM snímky nanočastíc MOF-La pripravené pomocou Li interkalačnej metódy. ( c 1 a c 2) Typický mikroskopický obraz atómovej sily a súvisiaci výškový profil nanočastíc MOF-La. ( c 3) difrakčný obrazec elektrónovej difrakcie zvolenej oblasti nanofeetu MOF-La.

Obrázok v plnej veľkosti

Exfoliácia vrstvených nanočastíc MOF-Ln.

Kryštály MOF-Ln sa nedali priamo dispergovať v rozpúšťadlách (vrátane organických rozpúšťadiel a vody) jednoduchým spoliehaním sa na rozpúšťadlá, aby sa minimalizovala energia exfoliácie. Preto sa skúmali rôzne spôsoby odlupovania, aby sa pripravili vysoko dispergovateľné 2D nanofóry MOF. Použitím MOF-La ako príkladu bol vrstvený MOF-La čiastočne exfoliovaný do nanočastíc pomocou ultrazvuku v etanole počas 10 minút (doplnkový obrázok S5). So zvýšením času ultrazvuku na 30 minút sa získali viacvrstvové nanosheety (obrázok 2a2 a bl). Li interkalované sypké materiály (ako sú MoS 2 a WS 2 ) môžu byť exfoliované do monovrstiev nútenou hydratáciou. 25, 30, 31, 32 Štruktúry MOF-Lns sú veľmi podobné MoS 2 alebo WS 2, najmä MOF-Eu a MOF-Tb (doplnkové obrázky S6 a S7). V tejto štúdii sme použili metódu interkalácie Li na ďalšie odlupovanie viacvrstvových nanočastíc MOF-Ln. Ako je znázornené na obrázku 2b2, ultratenké MOF-La nanosheety sa získali, keď reakcia hromadného MOF-La s n -butyllítiom pokračovala 10 hodín. Keď sa reakčný čas predĺžil na 20 hodín, nanofólie MOF-La boli úplne odlúpené a získalo sa viac nanosietet (obrázok 2a3 a b3).

Výsledky zo zvoleného plošného elektrónového difraktogramu a mikroskopie atómovej sily naznačili, že pripravený nanoškrup MOF-La bol kryštalickou listovou štruktúrou s ultratenkou hrúbkou cca. 2, 0 nm (doplnkový obrázok S8 a obrázok 2c1 – c3) a že veľkosť väčšiny exfoliačných nanočastíc MOF-La bola menšia ako 500 × 500 nm. Naše výsledky ukázali, že nanosheety MOF-La exfoliované lítanovou interkalačnou metódou boli približne jedna až tri vrstvy a viac ako 50% boli jednovrstvové nanosheety (doplnkový obrázok S9). Naše výsledky okrem toho ukázali, že nanosheety MOF-Nd, MOF-Eu a MOF-Tb by mohli byť exfoliované rovnakým spôsobom interakcie Li (doplnkový obrázok S10).

Nanosheety MOF-Ln ako zhášače fluorescencie DNA značenej farbivom

Schopnosť fluorescenčného zhášania pripravených nanočastíc MOF-Ln sa hodnotila pomocou ss DNA značenej farbivom (P1, ako sonda génu potláčajúceho nádor Homo sapiens ). Obrázok 3 ukazuje typické fluorescenčné emisné spektrá TAMRA-P1 a FAM-P1 v 10 mM PBS, obsahujúce rôzne koncentrácie cieľovej DNA T1, po pridaní nanočastíc MOF-La. V prípade TAMRA-P1 sa intenzita fluorescencie rýchlo znížila, keď sa nanočastice MOF-La pridali do aptamérového roztoku 15 nM (obrázok 3a), čo bolo podobné javu pozorovanému pre ďalšie 2D nanosheety (grafén, oxid grafénu) alebo MoS2). Po hybridizácii s cieľovou DNA Tl sa získala silná emisia fluorescencie (obrázok 3a). Účinnosť regenerácie sa zvýšila s koncentráciou cieľovej DNA T1. Tento jav demonštroval, že afinita nanočastíc MOF-La k ds DNA bola slabšia ako k ss DNA. V prípade FAM-P1 sa však pozoroval odlišný jav tlmenia fluorescencie. Očakávalo sa, že intenzita fluorescencie FAM-P1 by sa po zmiešaní s nanočasticami MOF-La znížila. Po hybridizácii s Tl sa fluorescencia skupín FAM ďalej utlmila (obrázok 3b) namiesto obnovenia fluorescencie pozorovaného pre TAMRA-P1. Účinnosť zhášania sa zvýšila s koncentráciou sondy FAM-P1.

Image

Fluorescenčné zhášacie vlastnosti nanočastíc MOF-Ln. Fluorescenčné spektrá TAMRA-P1 (15 nM) ( a ) a FAM-P1 (20 nM) ( b ) s rôznymi koncentráciami T1 (0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 40 a 50 nM) v 10mM PBS obsahujúcom 0, 2 mg.ml -1 MOF-La nanosheet. Vložky ukazujú viditeľné zmeny fluorescencie TAMRA-P1 (1, 25 μM) ( a ) a FAM-P1 (1, 25 μM) ( b ) ožiarené svetlom 365 nm.

Obrázok v plnej veľkosti

Okrem toho sa študovala špecificita sfarbenej P1 sondy s použitím troch typov DNA sekvencií, vrátane dokonale komplementárneho cieľa T1, jednozložkovej nezhodnej sekvencie MT1-1 a šesťzložkovej nezhodnej sekvencie MT1-2. Ako je znázornené na doplnkovom obrázku S11, farbivo značená P1 sonda fungovala dobre, rozlišovala T1 a nezhodované porasty (MT1-1 a MT1-2).

V prípade nanočastíc MOF-Nd, MOF-Eu a MOF-Tb sme našli podobné vlastnosti na potlačenie fluorescencie ako v prípade nanosheetov MOF-La (doplnkový obrázok S12). Schopnosť fluorescenčného zhášania nanočastíc MOF-Ln sa však znížila s kontrakciou lantanoidom. Ako je znázornené na obrázku 4a, účinnosť fluorescenčného zhášania TAMRA-P1 na nanočastiach MOF-Ln klesla z približne 55% na 47%, 32% a 23% so znížením iónového polomeru z La 3+ (1, 0 Á), na ióny Nd3 + (0, 98 Á), Eu 3+ (0, 95 Á) a Tb 3+ (0, 92 Á). V porovnaní s inými 2D materiálmi (napríklad oxidom grafénu a MoS 2 ), 5, 33, 34 bola fluorescenčná zhášacia schopnosť všetkých MOF-Ln nanosheetov nižšia. Predpokladáme, že zhášanie fluorescencie, ku ktorému dochádza na nanometroch MOF-Ln, je založené na prenose náboja z fluorescenčných molekúl na ióny lantánu. Keď je FAM- s DNA alebo TAMRA- s adsorbovaná na povrchu MOF-La nanohreku, stále existuje vzdialenosť ( asi 8 Á) od fluorescenčných skupín (FAM alebo TAMRA) k iónom lantánu (obrázok 4b)., Táto vzdialenosť môže blokovať efektívny prenos náboja a ovplyvňovať účinnosť zhášania fluorescencie. Od La 3+ do Tb 3+ sa polomer iónov lantánu postupne zmenšuje v dôsledku kontrakcie lantanidu. Väčšia veľkosť polomeru iónov La 3+ umožňuje, aby boli fluorescenčné skupiny bližšie k iónu La 3+ a môže dôjsť k účinnému zhášaniu fluorescencie v porovnaní s iónmi Nd 3+, Eu 3+ a Tb 3+ s menšou veľkosťou.

Image

Charakterizácia farbivom značenej DNA adsorpcie na nanočasticiach MOF-Ln. a ) Účinnosť TAMRA-P1 na zhášanie fluorescencie na nanočastiach MOF-Ln. F ° a F sú fluorescenčné intenzity TAMRA-P1 v neprítomnosti a prítomnosti nanočastíc MOF-Ln. ( b ) Schematické znázornenie adsorpcie farbiva značenej DNA na nanočasticiach MOF-Ln. ( c ) Zeta potenciály nanočastíc MOF-Ln v H20 a PBS. d ) UV-viditeľné absorbančné spektrá DNA označenej FAM na nanočastiach MOF-La. ( e, f ) rôntgenové fotoelektrónové spektroskopické spektrá nanočastíc MOF-La v rôznych prostrediach.

Obrázok v plnej veľkosti

Ako bolo zistené meraním potenciálu zeta (obrázok 4c), povrch nanočastíc MOF-Ln bol kladne nabitý v čistej vode, pretože povrchové ióny Ln 3+ neboli úplne koordinované. Kladný náboj nanočastíc MOF-Ln klesal so znižovaním iónového polomeru. Je možné, že menšie ióny Ln 3+ boli ľahšie zabudované do karbonylových skupín na okraji nanosheet MOF-Ln. Bolo tiež pozorované, že nanočastice MOF-Ln boli negatívne nabité v PBS kvôli adsorpcii / koordinácii HP04-2 na povrchové ióny Ln 3+ . Absolútny negatívny náboj nanočastíc MOF-Ln klesal so znižovaním iónového polomeru, pravdepodobne v dôsledku sterickej inhibície iónov menšej veľkosti. Keď FAM-DNA DNA hybridizovala so svojou komplementárnou cieľovou DNA, vytvorená FAM- ds DNA sa oddelila od povrchu nanočastíc MOF-Ln. Za experimentálnych podmienok nahradili negatívne nabité karboxylové a fenolické hydroxylové skupiny na FAM adsorbované HPO 4 2- ióny a adsorbovali sa na okraj nanočastíc MOF-Ln, čo umožnilo pozitívnu reabsorpciu oddelenej DNA FAM- ds pozitívne nabitá hrana nanočastíc MOF-Ln, kde ióny Ln 3+ ešte neboli úplne koordinované z dôvodu elektrostatických atrakcií.

Adhézia FAM- ds DNA na MOF-La nanosheety bola potvrdená detekciou zvyškov FAM- ds DNA (FAM-P1 + T1) v supernatante získanom odstredením. Ako je uvedené na doplnkovom obrázku S13A, po odstránení nanočastíc MOF-La centrifugáciou bola intenzita fluorescencie supernatantu FAM-P1 + T1 oveľa nižšia ako intenzita čistého FAM-P1 + T1, čo preukázalo, že väčšina FAM-P1 + T1 boli adsorbované na nanočastiach MOF-La a odstránené odstredením. Ako sa očakávalo, intenzita fluorescencie supernatantu TAMRA-P1 + T1 bola podobná ako u čistého TAMRA-P1 + T1 (doplnkový obrázok S13B), čo naznačuje, že takmer všetky TAMRA-P1 + T1 boli rozpustené v roztoku namiesto adsorbovania na nanočastíc MOF-La.

Priama adsorpcia FAM na ióny Ln 3+ skracuje ich vzdialenosť, takže efektívny prenos náboja ľahko nastáva z FAM na ióny Ln 3+ . V skutočnosti bolo pozorované intenzívne fluorescenčné zhášanie FAM- ds DNA na MOF-La nanosheetoch s zhášajúcou účinnosťou približne 88% (obrázok 3b). DNA TAMRA- ds obsahujúca pozitívne nabité skupiny však nemohla nahradiť adsorbovaný HPO 4 2- ; tak sa oddelil od nanočastíc MOF-Ln a obnovila sa jeho fluorescencia.

Mechanizmus zhášania fluorescencie pre FAM- ds DNA na nanočasticiach MOF-La bol potvrdený UV-viditeľnou absorpciou a charakterizáciou röntgenovej fotoelektrónovej spektroskopie (XPS). Ako je opísané na obrázku 4d, FAM-DNA (FAM-P1) bola charakterizovaná absorpčným pásom FAM (495 nm). Pridanie nanočastíc MOF-La spôsobilo modrý posun Soretovho pásma FAM. 35 Keď FAM-P1 hybridizoval s T1, absorpčný pás DNA FAM- ds sa nezískal, čo naznačuje, že DNA FAM- ds bola stále adsorbovaná na nanočasticiach MOF-La. Tento jav sa potvrdil aj charakterizáciou XPS (obrázky 4e a f). Absorpcia FAM-P1 a TAMRA-P1 na nanočastiach MOF-La spôsobila modré posuny väzbovej energie La 3d približne o 1 eV. Avšak po P1 hybridizovanom s T1 sa TAMRA- ds DNA oddelená od povrchu nanočastíc MOF-La a obnovila sa väzbová energia La 3d, zatiaľ čo DNA FAM- ds sa pripojila k okraju nanočastíc MOF-La. a modrý posun väzbovej energie La 3d bol stále pozorovaný. Tieto výsledky naznačujú, že ss DNA farbená farbivom sa môže adsorbovať na povrchu nanočastíc MOF-La. V prítomnosti cieľovej DNA sa vytvorená TAMRA-značená ds DNA bude oddeliť od povrchu nanočastíc MOF-Ln, zatiaľ čo vytvorená FAM-značená ds DNA zostane pripojená k okraju nanosheetov MOF-Ln v dôsledku elektrostatickej interakcie.

Intracelulárne testovanie adenozínu v živých bunkách pomocou nanočastíc MOF-Ln ako dvojfarebných snímacích platforiem

Ako trieda molekúl ssDNA / RNA sa aptaméry používajú na molekulárne rozpoznávanie s vysokou afinitou a špecifickosťou. 36, 37, 38, 39 V tejto štúdii sa farbivá značené ATP aptaméry na MOF-La nanosheetách použili na intracelulárne dvojfarebné fluorescenčné zobrazenie ATP. FAM-značený ATP-aptamér (FAM-P2) a TAMRA-značený ATP-aptamér (TAMRA-P2) sa inkubovali spolu s nanočasticami MOF-La za vzniku komplexu Dye-P2 + MOF-La, na ktorom FAM-P2 a TAMRA-P2 boli adsorbované pri rovnakej molárnej koncentrácii. V prítomnosti cieľového ATP indukovala špecifická väzba Dye-P2 s ATP tvorbu tuhej štruktúry. Podobne ako pri DNA DNA bola afinita tejto rigidnej konformácie ATP aptaméru k povrchu nanočastíc MOF-La veľmi slabá. Toto snímanie ATP bolo založené na zvýšení fluorescencie TAMRA a znížení fluorescencie FAM po pridaní cieľového ATP.

Selektivita adenozínového senzora na báze MOF-La sa testovala porovnaním zmien intenzity fluorescencie FAM a TAMRA vyvolaných ATP a inými biomolekulami, ako je napríklad uridín trifosfát, cytidín trifosfát, guanozín trifosfát, ľudský sérový albumín, glutatión, kyselina askorbová a histamín. Ako je znázornené na obrázku 5a-c, ATP indukoval fluorescenčné obnovenie TAMRA na TAMRA-P2 + MOF-La a ďalej utlmil fluorescenciu FAM na FAM-P2 + MOF-La. Naopak, pri použití iných biomolekúl sa nepozorovali žiadne zjavné zmeny vo fluorescenčných signáloch. Tieto výsledky naznačujú, že biosenzor farbiva-P2 + MOF-La vykazoval dobrú selektivitu voči adenozínom. Okrem toho biosenzor farbiva-P2 + MOF-La tiež vykazoval dobrú selektivitu voči adenozínom v reálnych vzorkách, napríklad v ľudskej plazme a bunkových extraktoch (doplnkový obrázok S14).

Image

Selektivita adenozínového senzora na báze MOF-La. ( a ) Maximálne intenzity fluorescencie sondy FAM-P2 + MOF-La (zelený stĺpec, detekovaný pri 518 nm) a sondy TAMRA-P2 + MOF-La (červený stĺpec, detekovaný pri 582 nm) pre rôzne biomolekuly. ( b, c ) Fluorescenčné spektrá FAM-P2 (20 nM) ( b ) a TAMRA-P2 (15 nM) ( c ) zmiešané s nanočasticami MOF-La (0, 2 mg ml −1 ) v prítomnosti ATP ( uridíntrifosfát (UTP), guanozíntrifosfát (GTP) alebo cytidíntrifosfát (CTP)) s koncentráciami 30 nM ( b ) a 25 nM ( c ). d ) Kalibraćné krivky na detekciu adenozínu (0, 5–15 nM) podía F ' TAMRA (ćervená) a F'FAM (modrá). e ) Kalibračná krivka na detekciu adenozínu (0, 5–15 nM) založená na pomere F ' TAMRA / F ' FAM .

Obrázok v plnej veľkosti

Vrcholový pomer intenzity fluorescencie F / F0 (kde F a F ° sú najvyššie intenzity fluorescencie v prítomnosti a neprítomnosti cieľa) bol vynesený proti koncentrácii ATP (obrázok 5d). Biosenzor Dye-P2 + MOF-La vykazoval lineárny rozsah od 0, 5 do 15 nM a dolný detekčný limit 500 pM pre ATP, porovnateľný s predtým uvedenými hodnotami. 5, 40 Ďalej bola pozorovaná priaznivá lineárna korelácia medzi F / FO sondy TAMRA-P2 + MOF-La ( F'AMAM ) a F / FO sondy FAM-P2 + MOF-La ( F'FAM) ) (Obrázok 5e). Koncentrácia adenozínu sa preto môže vypočítať na základe pomeru F ' TAMRA / F ' FAM .

Okrem toho zeta potenciál nanočastíc MOF-La bol -29, 1 mV pri pH 7, 5 v PBS (doplnkový obrázok S15), čo by umožňovalo nanosheetám stabilne sa dispergovať v biosystéme. 41 Na základe vyššie uvedených charakteristík sa biosenzor farbivo-P2 + MOF-La použil na intracelulárnu detekciu adenozínu v bunkách ľudského karcinómu prsníka MCF-7 pomocou konfokálnej mikroskopie. Po MCF-7 boli bunky inkubované s farbivom-P2 + MOF-La, intracelulárne molekuly adenozínu interagovali s farbivom-P2 (obrázok 6a). Ožiarením svetlom 488 nm sa pozorovala zreteľná zmena fluorescencie zodpovedajúca FAM pri 500 - 550 nm (zelená) a TAMRA pri 550 - 650 nm (červená). Ako je znázornené na zlúčených obrázkoch na doplnkovom obrázku S16, so zvýšením doby inkubácie sa farba fluorescencie zmenila z kelly green na červenkastú oranžovú. Tieto zistenia naznačujú, že farbivo-P2 cielilo adenozíny za vzniku duplexnej konfigurácie, čo viedlo k oddeleniu molekúl farbiva od povrchu nanočastíc MOF-La a následnému získaniu fluorescencie. Skenovací experiment Z s použitím konfokálnej mikroskopie potvrdil, že farbivo-P2 + MOF-La endocytovalo do buniek MCF-7 (doplnkový obrázok S17).

Image

Intracelulárne fluorescenčné zobrazenie adenozínov. a ) Schematické znázornenie intracelulárneho adenozínového sondovania v živých bunkách s použitím farbiva-P2 + MOF-La. b ) Monitorovanie adenozínu v živých bunkách. ( c - e ) Konfokálne zobrazenie intracelulárnej vizualizácie adenozínov s inkubačným časom 2 až 6 hodín a kvantifikácia adenozínov dvojfarebnou fluorescenciou. Mierka: b, 25 μm; c, 30 um; d, e, 10 um.

Obrázok v plnej veľkosti

Aktivita adenozínu v jednotlivých bunkách bola tiež monitorovaná biosenzorom farbivo-P2 + MOF-La. Ako je znázornené na obrázku 6b, po inkubácii počas 4 hodín sa farba fluorescencie v rôznych bunkách zmenila zo zelenej na červenú. Rozdiel vo farebnej emisii sa monitoroval aj v jednotlivých bunkách (obrázok 6c – e). Aktivita adenozínu bola jasne pozorovaná v rôznych bunkách a rôznych oblastiach jednej bunky. Vypočítaním pomeru F ' TAMRA / F ' FAM bola koncentrácia adenozínu v živých bunkách čiastočne stanovená (údaje uvedené na obrázku 6) na základe kalibračnej krivky na obrázku 5e. Koncentrácia adenozínov v živých bunkách inkubovaná s biosenzorom farbivo-P2 + MOF-La 2 alebo 4 hodiny sa mohla monitorovať od 0, 5 do 15 nM. Keď inkubačná doba bola viac ako 6 hodín, boli pomery F ' TAMRA / F ' FAM nad lineárnym rozsahom metódy s použitím pripraveného biosenzora farbiva-P2 + MOF-La. Na detekciu vysokých koncentrácií adenozínov (> 15 nM) by sa malo počas prípravy komplexu farbivo-P2 + MOF-La inkubovať viac FAM-P2 a TAMRA-P2 s nanočasticami MOF-La.

Vzhľadom na to, že bunkový ATP sa produkuje prevažne v mitochondriách počas aeróbneho dýchania, spolu sa monitorovala distribúcia adenozínov a mitochondrií v živých bunkách. MitoTracker Deep Red FM (FMD, od YEASEN, Šanghaj, Čína) (doplnkový obrázok S18), komerčne dostupný mitochondriálny indikátor, 43 sa použil na kolokalizáciu mitochondriou. Ako je znázornené na obrázku 7a-c, potom, čo sa farbivo-P2 + MOF-La a FMD spolu farbili v bunkách MCF-7, niektoré adenozíny sa monitorovali okolo mitochondrií. HeLa bunky sa tiež použili na monitorovanie distribúcie adenozínov v živých bunkách (doplnkový obrázok S19). Pretože adenozíny všeobecne existujú v mitochondriách a cytosóloch, distribúcia adenozínov sa neprekrývala dobre s distribúciou mitochondrií (biela farba na obrázku 7 a doplnkový obrázok S19C; excitačná vlnová dĺžka bola 644 nm).

Image

Konfokálne fluorescenčné obrazy buniek MCF-7 inkubovaných s farbivom-P2 + MOF-La a FMD. ( a - c ) Jednotlivé bunky inkubované s farbivom P2 + MOF-La a FMD počas 4 hodín. Mierka: 10 μm.

Obrázok v plnej veľkosti

V kontrolnom experimente sa FAM-P3 (náhodná DNA P3 značená FAM) a TAMRA-P3 (náhodná DNA P3 značená TAMRA) zmiešali s nanočasticami MOF-La, aby sa pripravil komplex farbivo-P3 + MOF-La, ktorý bol podobný komplexu farbivo-P2 + MOF-La. Po inkubácii komplexu farbivo-P3 + MOF-La s bunkami MCF-7 počas 6 hodín (doplnkový obrázok S20) nedošlo k žiadnej zjavnej zmene intenzity fluorescencie. Tieto výsledky ukazujú, že komplex farbivo-P2 + MOF-La sa môže použiť ako selektívna snímacia sonda na detekciu biomolekúl v živých bunkách.

závery

Syntetizovali sme a charakterizovali sériu ultratenkých MOF-Ln nanosheetov. Tieto MOF-Ln nanosheety vykazovali zaujímavú schopnosť potlačenia fluorescenciou pre DNA značenú farbivom. Fluorescencia ss DNA značenej FAM, nesúca záporné náboje, bola čiastočne zhášaná nanočasticami MOF-Ln. Pri hybridizácii s komplementárnou cieľovou DNA sa FAM- ds DNA oddelila od povrchu nanočastíc MOF-Ln a znova sa pripojila k okraju nanosheet elektrostatickou interakciou medzi FAM a Ln 3+ . Fluorescencia ss DNA značenej TAMRA, ktorá nesie kladné náboje, však vykazovala rovnaké zhášacie a regeneračné vlastnosti na nanočasticiach MOF-Ln ako na tradičných 2D materiáloch. Zistili sme, že nanočastice MOF-La vykazovali lepšiu schopnosť potlačenia fluorescencie ako nanočastice MOF-Eu kvôli kontrakcii lantanoidu. Kombináciou týchto výhod sa nanosheety MOF-La úspešne použili ako dvojfarebná snímacia platforma na intracelulárnu detekciu DNA a malých molekúl. Táto práca odhalila nové vlastnosti nanočastíc MOF-Ln. Sme presvedčení, že tieto nanosheety môžu byť potenciálne použité ako nový typ platformy pre rozšírené biologické aplikácie.

Doplnková informácia

Word dokumenty

  1. 1.

    Doplnková informácia

    Doplňujúce informácie sprevádzajú dokument na webovej stránke NPG Asia Materials (//www.nature.com/am)