Kctd12 podporuje tumorigenézu uľahčovaním prechodu g2 / m závislého na cdc25b / cdk1 / aurora | onkogén

Kctd12 podporuje tumorigenézu uľahčovaním prechodu g2 / m závislého na cdc25b / cdk1 / aurora | onkogén

Anonim

predmety

  • Signalizácia kontrolného bodu
  • mitosis
  • onkogény
  • Nádorové biomarkery

abstraktné

Deregulácia bunkového cyklu vedie k nekontrolovanej bunkovej proliferácii a tumorigenéze. Pochopenie molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom progresie bunkového cyklu, môže poskytnúť stopy vedúce k identifikácii kľúčových proteínov zapojených do vývoja rakoviny. V tejto štúdii sme uskutočnili proteomickú analýzu na identifikáciu nových regulátorov bunkového cyklu. Zistili sme, že tetramerizačná doména draslíkového kanála obsahujúca 12 (KCTD12) bola významne upregulovaná v M fáze v porovnaní so S fázou. Zistili sme tiež, že nadmerná expresia KCTD12 nielen uľahčovala G2 / M prechod a indukovala proliferáciu rakovinových buniek, ale tiež podporovala rast subkutánnych nádorov a index proliferácie Ki-67 u myší. Pokiaľ ide o mechanizmus, ktorý je základom týchto javov, bola na cyklíne závislá kináza 1 (CDK1) identifikovaná ako interagujúci partner KCTD12 pomocou imunoprecipitácie a hmotnostnej spektrometrie, ktorá preukázala, že KCTD12 aktivovala CDK1 a Aurora kinázu A (Aurora A) a že účinky KCTD12 Fosforylácia CDK1 a proliferácia buniek boli zrušené umlčaním cyklu 25B (CDC25B) delenia buniek. Okrem toho Aurora A fosforylovala KCTD12 na seríne 243, čím sa iniciuje slučka pozitívnej spätnej väzby, ktorá je nevyhnutná na to, aby KCTD12 uplatňovala svoje účinky podporujúce rakovinu. Ďalej sme analyzovali úrovne expresie rôznych génov a korelácie medzi expresiou týchto génov a prežitím pomocou mikroarray nádorového tkaniva a súborov údajov Gene Expression Omnibus (GEO). Údaje ukázali, že expresia KCTD12 bola významne zvýšená pri rakovine krčka maternice a pľúc. Čo je dôležitejšie, vysoká expresia KCTD12 bola spojená s väčšími veľkosťami nádorov, vyššími patologickými štádiami a slabým prežitím pacientov. Súhrnne naša štúdia demonštruje, že KCTD12 sa viaže na CDC25B a aktivuje CDK1 a Aurora A na uľahčenie prechodu G2 / M a podporu tumorigenézy a že Aurora A fosforyluje KCTD12 v seríne 243, aby spustil pozitívnu spätnoväzbovú slučku, čím zosilňuje účinky KCTD12. Os KCTD12-CDC25B-CDK1-Aurora A má teda dôležité dôsledky pre diagnózy a prognózy rakoviny.

úvod

Deregulácia bunkového cyklu je spoločnou črtou ľudských rakovín, ktorá vedie k najmenej dvom charakteristickým znakom rozvoja rakoviny, konkrétne k nekontrolovanej bunkovej proliferácii a genomickej a chromozomálnej nestabilite. 1, 2, 3 Je známe, že správny vývoj v bunkovom cykle monitorujú členovia rodiny cyklín-dependentných kináz (CDK), ktorých aktivita je regulovaná špecifickými aktivátormi (cyklíny) a inhibítormi (rodina Ink4 a Cip / Kip). členovia). 4 Konštitutívna aktivácia CDK spôsobuje významnú zmenu fosforylácie proteínu a riadi progresiu cyklu nádorových buniek, čo vedie k neplánovanej proliferácii buniek a tumorigenicite. 5, 6 Tieto zistenia naznačujú, že CDK môžu byť terapeutickým cieľom pri liečbe rakoviny u ľudí. Rastúci počet dôkazov naznačuje, že aberantná aktivácia CDK je spôsobená rôznymi genetickými a epigenetickými udalosťami; 4, 7, 8, molekulárne mechanizmy, ktoré sú základom týchto javov, však zostávajú neúplne pochopené. Preto sú naliehavo potrebné štúdie identifikujúce nové molekuly a regulačné cesty, ktoré sa zúčastňujú na regulácii CDK a bunkovom cykle.

Medzi štyrmi sekvenčnými fázami bunkového cyklu sú najdôležitejšie fázy S fáza, v ktorej dochádza k replikácii DNA, a M fáza, v ktorej sa bunka delí na dve dcérske bunky. Komplexné a systematické skúmanie mechanizmov regulujúcich kontrolné body bunkového cyklu vo fáze S a vo fáze M môže výskumníkom poskytnúť dôležité informácie, ktoré im umožnia získať rozsiahle znalosti o regulácii bunkového cyklu. Proteomické techniky sa široko používajú pri výskume bunkových cyklov, 9, 10, 11, 12, 13, najmä v štúdiách, ktoré sa snažia identifikovať fosforylované proteíny a proteínové komplexy. V tejto štúdii sme použili stabilné izotopové označovanie aminokyselinami v bunkovej kultúre (SILAC), kvantitatívnu proteomickú techniku 14 v modeli bunkovej synchronizácie, na systematickú analýzu proteínov, ktoré sú rozdielne exprimované medzi fázou S a fázou M, a na identifikáciu nových regulátorov. progresie bunkového cyklu. Spomedzi 54 proteínov identifikovaných vyššie uvedenou analýzou sme upozornili tetramerizačnú doménu draselného kanála obsahujúcu 12 (KCTD12), člena rodiny KCTD, ktorého funkcia v bunkovom cykle nie je známa.

KCTD12 má dve konzervované väzbové domény, doménu vírusu BR-C, ttk a bab (BTB) / kiahní a zinkových prstov (POZ) bohatú na a-helixy a p-násobky na svojom N-konci a doménu bohatú na p-násobky na svojom C-termináli. 15 KCTD12 gén bol prvýkrát identifikovaný z ľudskej fetálnej kochleárnej cDNA knižnice 16 a jeho kódujúci proteín KCTD12 indukuje desenzibilizáciu K + prúdu aktivovanú receptorom GABA B väzbou na podjednotky aktivovaného G-proteínu, ktoré interferuje s aktivácia efektorového K + kanála. 17, 18 Čo je dôležitejšie, nadmerná expresia KCTD12 a korelácia medzi nadmernou expresiou KCTD12 a vyššími stupňami nádorov boli hlásené v štúdiách týkajúcich sa gastrointestinálnych stromálnych nádorov; V štúdiách týkajúcich sa rakoviny hrubého čreva sa však preukázalo, že KCTD12 funguje ako supresor tumoru. 20 Úloha KCTD12 pri rakovine teda zostáva nejasná a kontroverzná.

Bolo zdokumentované, že fosforylácia CDK1 je regulovaná CDC25, Wee1 a Myt1. Aktivita CDK1 je inhibovaná, keď je proteín fosforylovaný pomocou Wee1 a Myt1 počas bunkovej interfázy, ale je aktivovaný a podporuje progresiu bunkového cyklu, keď je defosforylovaný CDC25 počas prechodu G2 / M. 21 Aurora kináza A (Aurora A) môže okrem toho fosforylovať a aktivovať CDC25 a potom aktivovať CDK1 na podporu rýchleho a včasného vstupu bunky do mitózy. 22 CDK1 iniciuje vstup bunky do mitózy a aktiváciu Aurory A, čím vytvára slučku pozitívnej spätnej väzby v ľudských bunkách. 23 V tejto štúdii imunoprecipitácia spojená s proteomickou analýzou ukázala, že KCTD12 interaguje s CDK1 a cyklom bunkového delenia 25B (CDC25B). Skúmali sa teda molekulárne mechanizmy zodpovedné za reguláciu KCTD12 Aurora A, ako aj mechanizmy, pomocou ktorých KCTD12 vykazuje pozitívne účinky na fosforyláciu Aurora A prostredníctvom aktivácie CDK1. Ďalej sme uskutočňovali experimenty in vitro a in vivo, aby sme určili funkciu KCTD12 pri regulácii bunkového cyklu a tumorigenéze, ako aj jeho klinický význam pri rakovine krčka maternice a rakovine pľúc.

výsledok

KCTD12 je nový proteín, ktorý sa podieľa na regulácii bunkového cyklu

Aby sme identifikovali nové regulátory bunkového cyklu, vykonali sme synchronizáciu bunkového cyklu pomocou metódy dvojbloku s tymidínom a nocodazolom (obrázok la). Výsledky prietokovej cytometrie ukázali, že bunkový model bol úspešne zavedený, s viac ako 90% HeLa buniek synchronizovaných v každom štádiu (obrázok 1b). Za účelom priameho rozlíšenia buniek M fázy sa uskutočnili testy prietokovou cytometriou s protilátkami fosfo-H3 (H3P) a výsledky ukázali, že približne 70% synchronizovaných buniek fázy M bolo pozitívnych na H3P (obrázok 1c). Vzhľadom na účinnosť značenia protilátky je možné vyvodiť záver, že> 70% rakovinových buniek sa úspešne synchronizovalo s fázou M. Účinnosť synchronizácie buniek bola potvrdená na molekulárnej úrovni analýzou westernovým prenosom, ktorej výsledky ukázali hladiny expresie markerov každej fázy bunkového cyklu (obrázok 1d). Pomocou kvantitatívnej analýzy SILAC sme zistili, že 54 proteínov, vrátane proteínového cyklínu B1 špecifického pre mitózu, bolo exprimovaných na úrovni, ktorá bola najmenej 1, 5-krát vyššia v M fáze ako v S fáze (doplnková tabuľka S1), čo naznačuje, že synchronizované bunky sa môže použiť ako bunkový model na identifikáciu nových regulátorov bunkového cyklu. Spomedzi týchto diferenčne exprimovaných proteínov nás zaujal KCTD12, ktorý nebol spojený s bunkovým cyklom a nemá neznámu biologickú funkciu. Aby sme potvrdili naše proteomické údaje, uskutočnili sme westernový prenos, ktorého výsledky ukázali, že úrovne expresie KCTD12 sa cyklicky menili počas bunkového cyklu. Čo je dôležitejšie, výsledky ukázali, že expresia KCTD12 klesla vo fáze S, bola takmer úplne neprítomná vo fáze G2 a bola obnovená v fáze M (obrázok 1e). Zistili sme, že boli detekované dva pásy KCTD12 a ten istý jav bol zaznamenaný aj v predchádzajúcich publikovaných prácach iných skupín. 20, 24, 25 Pretože deregulácia bunkového cyklu je spoločnou črtou rakoviny u ľudí, v tejto štúdii sme sa zamerali na úlohu KCTD12 v progresii rakoviny a mechanizmy, ktoré sú základom jej účinkov na rakovinu. Doteraz tieto mechanizmy neboli objasnené.

Image

KCTD12 sa diferenčne exprimuje medzi M fázou a S fázou v HeLa bunkách. a) pracovný postup pre synchronizáciu bunkového cyklu a experimenty SILAC. Bunky boli pestované v 13C-lyzínovom médiu, aby sa získali ťažké AA-značené ASY bunky alebo normálne kultivačné médium a synchronizované s fázami G1 / S, S, G2, M a G1 použitím metódy dvojitého bloku s tymidínom a nokodazolom. Kvantitatívna proteomická analýza sa uskutočnila s použitím modifikovanej metódy Spike-in SILAC na porovnanie proteínových profilov fáz M a S. ( b) Účinnosť synchronizácie bunkového cyklu sa skúmala prietokovou cytometriou. ASY: asynchrónne bunky. ( c ) Percento buniek M fázy sa detegovalo prietokovou cytometriou so značením protilátky H3P. IgG AF488, negatívna kontrola; ASY, asynchrónne bunky. ( d) Overenie účinnosti synchronizácie buniek analýzou expresie špecifických markerov bunkového cyklu pomocou westernového prenosu. ASY: asynchrónne bunky. ( e) Hladiny expresie KCTD12 v rôznych fázach bunkového cyklu boli stanovené pomocou westernového prenosu.

Obrázok v plnej veľkosti

Klinický význam KCTD12 pri rakovine ľudí

Aby sme určili klinický význam KCTD12 u rakoviny u ľudí, skúmali sme hladiny expresie KCTD12 pomocou imunohistochémie pomocou tkanivového mikročipu obsahujúceho 93 párov primárnych tkanív rakoviny krčka maternice a susedných normálnych tkanív. KCTD12 bol lokalizovaný v cytoplazme nádorových buniek, podobne ako jeho lokalizácia v rakovine hrubého čreva. 20 Zistili sme silnejšie cytoplazmatické farbenie KCTD12 v 64 (68, 8%) tkanivách rakoviny krčka maternice ako v zodpovedajúcich normálnych tkanivách (obrázok 2a). Najmä 84, 9% (79/93) nádorových tkanív malo vysokú expresiu KCTD12, zatiaľ čo iba 39, 8% (37/93) normálnych tkanív malo vysokú expresiu KCTD12. Na rozdiel od toho iba 15, 1% nádorových tkanív vykazovalo nízku až strednú expresiu KCTD12, zatiaľ čo 60, 2% normálnych tkanív malo nízku až strednú expresiu KCDT12 (obrázok 2b). Imunohistochemická analýza expresie KCTD12 v 75 pároch tkanív rakoviny pľúc a zodpovedajúcich normálnych tkanivách ukázala podobné výsledky (obrázok 2c). Výsledky tejto analýzy ukázali, že väčšina tkanív rakoviny pľúc vykazovala stredne až vysokú expresiu KCTD12, zatiaľ čo všetky normálne tkanivá vykazovali nedetegovateľnú expresiu KCTD12 (obrázok 2d). Analýza profilov génovej expresie dvoch kohort pacientov z databázy Gene Expression Omnibus (GEO) tiež ukázala, že expresia KCTD12 je výrazne zvýšená v tkanive rakoviny krčka maternice v porovnaní s normálnym tkanivom (obrázok 2e). Ďalej, aby sme určili, či KCTD12 môže byť prognostickým markerom pre pacientov s rakovinou, uskutočnili sme imunohistochemickú analýzu expresie KCTD12 v kohorte pacientov s rakovinou pľúc s údajmi o prežití. Zaznamenali sme významnú koreláciu medzi úrovňami expresie KCTD12 nádoru a veľkosťou nádoru, ako aj patologickým štádiom T u 88 pacientov s rakovinou pľúc, ktorí podstúpili predliečebný chirurgický zákrok (tabuľka 1). Čo je dôležitejšie, poznamenali sme, že pacienti s vysokými hladinami expresie KCTD12 v nádore mali významne kratšie prežitie (stredné prežitie = 33, 0 mesiacov) ako pacienti s nízkymi hladinami expresie KCD12 v nádore (stredné prežitie = 54, 0 mesiacov). Okrem toho analýza log-rank ukázala, že vysoká expresia KCTD12 významne korelovala s kratším prežitím (log-rank = 6, 887, P = 0, 0086; obrázok 2f). Naše výsledky naznačujú, že KCTD12 môže hrať dôležitú úlohu pri rakovine ľudí.

Image

Klinický význam KCTD12 pri rakovine krčka maternice a pľúc. a) Reprezentatívne výsledky imunohistochemického vyfarbenia na expresiu KCTD12 v tkanivách rakoviny krčka maternice av susedných netumorových tkanivách. ( b) Štatistická analýza ukázala, že expresia KCTD12 bola významne zvýšená v tkanivách rakoviny krčka maternice v porovnaní s nenádorovými tkanivami ( n = 93). ( c ) Reprezentatívne výsledky imunohistochemického vyfarbenia na expresiu KCTD12 v tkanivách rakoviny pľúc a spárovaných netumorových tkanivách. ( d) Hladiny expresie KCTD12 boli v tkanivách rakoviny pľúc zvýšené v porovnaní s tkanivami bez nádoru ( n = 75). ( e ) Analýza expresie KCTD12 v rakovine krčka maternice a spárovaných normálnych tkanivách pomocou databázy GEO. ( f) Kaplan-Meierova analýza celkového prežitia u 88 pacientov s rakovinou pľúc stratifikovaných podľa úrovne expresie KCTD12 nádoru.

Obrázok v plnej veľkosti

Tabuľka v plnej veľkosti

KCTD12 podporuje proliferáciu rakovinových buniek

Ďalej sme študovali biologickú funkciu KCTD12 v rakovinových bunkách. Test proliferácie buniek WST-1 ukázal, že knockdown KCTD12 významne inhiboval proliferáciu HeLa buniek (obrázky 3a a b). Uskutočnili sme test tvorby kolónií, aby sme stanovili účinky KCTD12 na schopnosť tvoriť kolónie rakovinových buniek, ktorých výsledky ukázali, že bunky HeLa s knockdownovaním KCTD12 vytvorili menej kolónií ako negatívne kontrolné bunky (obrázok 3c). Ďalej sme zistili, že nadmerná expresia KCTD12 mala opačný účinok na proliferáciu buniek HeLa (obrázky 3d a e) a tvorbu kolónií (obrázok 3f). Okrem toho sme potvrdili účinky KCTD12 na podporu rakoviny v bunkách A549 rakoviny pľúc vykonaním experimentov so ziskom a stratou funkcie (doplnkové obrázky S1a – d).

Image

KCTD12 podporuje proliferáciu buniek v rakovinových bunkách krčka maternice. ( a - c) HeLa bunky boli transfekované siRNA proti KCTD12 (100 nM) alebo si-Control. Úrovne kinetickej expresie KCTD12 a aktínu sa stanovili westernovým prenosom ( a ) a schopnosť bunkovej proliferácie a tvorby kolónií sa skúmala pomocou testu WST-1 ( b ) a testu tvorby kolónií ( c ). Western blotting v paneli c sa uskutočnil 24 hodín po transfekcii siRNA. ( d - f) Bunky HeLa transfekované plazmidom exprimujúcim KCTD12 (1 μg) alebo vektorovou kontrolou sa porovnávali, pokiaľ ide o expresiu KCTD12 ( d ), proliferáciu buniek ( e ) a schopnosť tvorby kolónií ( f ). Bary, sd; * P <0, 05; *** P <0, 001 v porovnaní s kontrolnými bunkami.

Obrázok v plnej veľkosti

KCTD12 interaguje s CDC25B a aktivuje signalizáciu CDK1

Za účelom preskúmania mechanizmov pôsobenia, ktoré sú základom účinkov KCTD12 pri rakovine, sme uskutočnili imunoprecipitáciu spojenú s kvapalinovou chromatografiou s tandemovou hmotnostnou spektrometriou (LC-MS), aby sme identifikovali jej interagujúce proteíny (doplnková tabuľka S2). Spomedzi identifikovaných proteínov nás upozornil CDK1, jeden z najdôležitejších regulátorov progresie bunkového cyklu. Vykonali sme imunofluorescenčné farbenie a Co-IP, aby sme potvrdili výsledky proteomickej analýzy. Výsledky tejto analýzy ukázali, že KCTD12 a CDK1 ko-lokalizované v cytoplazme metafázových buniek (obrázok 4a) a že KCTD12 by mohol interagovať priamo s CDK1 v bunkách M fázy (obrázok 4b). Tiež sme zistili, že nadmerná expresia KCTD12 aktivovala CDK1, zistenie podporené naším pozorovaním defosforylácie CDK1 na Thr14 / Tyr15 (p-CDK1; Obrázok 4c, vľavo). Okrem toho knockdown KCTD12 významne zvýšil hladiny expresie p-CDK1 (obrázok 4c, vpravo). Za účelom preskúmania, či je KCTD12 dôležitý pre prechod G2 / M, sme uskutočnili testy prietokovou cytometriou v bunkách HeLa knockdown KCTD12. Dáta ukázali, že umlčanie KCTD12 významne znížilo percento buniek fázy M (obrázok 4d). Je zaujímavé, že Aurora A, jeden z downstream cieľov CDK1, 26, bol fosforylovaný pri Thr288 v bunkách nadmerne exprimujúcich KCTD12; zatiaľ čo knockdown KCTD12 mal opačný účinok (obrázok 4c). Ako je znázornené na obrázku 4e, účinky KCTD12 na fosforyláciu Aurora A by sa mohli zrušiť blokádou CDK1 s ATP-konkurenčným a selektívnym inhibítorom CDK1 Ro-3306, čo naznačuje, že KCTD12 môže fosforylovať Aurora A prostredníctvom CDK1. Okrem toho výsledky testu tvorby kolónií naznačujú, že aktivita CDK1 bola požadovaná pre účinky KCTD12 na podporu rakoviny (obrázok 4f). Ďalej sme skúmali molekulárne mechanizmy, ktoré sú základom účinkov KCTD12 na aktivitu CDK1. Vzhľadom na to, že CDK1 je defosforylovaný na Thr14 / Tyr15 pomocou CDC25B, dôležitého proteínu bunkového cyklu, keď bunky vstúpia do mitózy, 27, 28 sme predpokladali, že CDC25B sa môže podieľať na regulácii CDK1 sprostredkovanej KCTD12. Naša hypotéza bola silne podporená údajmi, ktoré ukazujú, že KCTD12 priamo interagoval s CDC25B (obrázok 4g). Okrem toho defosforylácia CDK1 indukovaná pomocou KCTD12 bola významne oslabená knockdownom CDC25B (obrázok 4h, ľavý panel) a naopak, fosforylácia CDK1 indukovaná umlčaním KCTD12 mohla byť tiež eliminovaná nadmernou expresiou CDC25B (obrázok 4h, pravý panel). Funkčne, umlčanie CDC25B významne zrušilo KCTD12-indukovanú proliferáciu buniek v HeLa bunkách (obrázok 4i). Celkovo naše výsledky ukazujú, že KCTD12 môže tvoriť komplex s CDC25B a CDK1, a tak aktivovať CDK1 a podporovať prechod G2 / M a proliferáciu buniek.

Image

KCTD12 interaguje s CDC25B, aby podporoval G2 / M prechod a proliferáciu buniek defosforyláciou CDK1. a ) Konfokálna imunofluorescenčná analýza lokalizácie KCTD12 a CDK1 v HeLa bunkách. KCTD12, zelená; CDK1, červená; DAPI sa použil na označenie jadier; prezentované bunky sú v metafáze. ( b ) HeLa bunky sa synchronizovali do fázy M a lyzáty celých buniek sa imunoprecipitovali s protilátkou CDK1 a potom sa expresia KCTD12 detegovala westernovým prenosom. ( c ) HeLa bunky boli transfekované plazmidom exprimujúcim KCTD12 (1 μg, 24 h, ľavý panel) alebo si-KCTD12 (100 nM, 24 h, pravý panel) a p-Aurora A, Aurora A, p- Hladiny expresie CDK1 a CDK1 v experimentálnej skupine sa porovnávali s hladinami v kontrolnej skupine pomocou westernového prenosu. Aktín bol zahrnutý ako kontrola nakladania. ( d ) Zníženie KCTD12 znížilo percento buniek fázy M. Bunky označené pomocou IgG AF488 sa použili ako negatívna kontrola. ( e) Inhibícia aktivity CDK1 s Ro-3306 (30 nM, 24 h) zoslabila účinok KCTD12 (1 μg, 24 h) na fosforyláciu Aurora A. ( f) Ro-3306 znížil KCTD12-indukovanú proliferáciu buniek. HeLa bunky boli ošetrené Ro-3306 (30 nM, 24 h) alebo transfektované samotným plazmidom exprimujúcim KCTD12 (1 μg, 24 h) alebo bola porovnávaná kombinácia a bola porovnaná schopnosť tvorby kolónií. ( g ) Interakcia medzi KCTD12 a CDC25B bola skúmaná Co-IP testom v HeLa bunkách synchronizovaných v M fáze. ( h) plazmid exprimujúci KCTD12 (1 μg) alebo vektorová kontrola sa kotransfekovali do buniek HeLa s siRNA proti CDC25B (100 nM) alebo si-Control (ľavý panel); naopak, siRNA proti KCTD12 (100 nM) alebo si-Control sa transfekovala do HeLa buniek s alebo bez plazmidu exprimujúceho CDC25B (pravý panel). Bunky boli zozbierané 24 hodín po transfekcii a úrovne expresie KCTD12, CDC25B, p-CDK1 a CDK1 boli stanovené westernovým prenosom. ( i ) HeLa bunky boli kotransfektované KCTD12-exprimujúcim plazmidom alebo vektorovou kontrolou a si-CDC25B alebo si-Control a schopnosť buniek tvoriť kolónie bola porovnávaná testom tvorby kolónií. Bary, sd; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001 v porovnaní s bunkami transfekovanými plazmidom exprimujúcim KCTD12.

Obrázok v plnej veľkosti

KCTD12 je fosforylovaný Aurora A v seríne 200 a seríne 243

Ďalej sme študovali mechanizmy zodpovedné za posun pásma KCTD12 smerom hore vo fáze M (obrázok 1d). Údaje, ktoré ukazujú, že pás KCTD12 bol významne posunutý dole, keď boli bunkové lyzáty ošetrené alkalickou fosfatázou z teľacieho čreva (CIP; doplnkový obrázok S2a), nás viedli k hypotéze, že tento jav možno pripísať fosforylácii KCTD12. 29 Získali sme databázu obsahujúcu údaje týkajúce sa proteínovej fosforylácie počas progresie bunkového cyklu 30 a zistili sme, že KCTD12 môže byť fosforylovaný pomocou Aurory A. Aby sme overili, že fosforylácia KCTD12 v M fáze bola regulovaná pomocou Aurory A, uskutočnili sme experiment zahŕňajúci selektívny inhibítor Aurora kinázy. (VX-680). Výsledky experimentu ukázali, že fosforylácia KCTD12, ktorá bola indikovaná lokalizáciou pásu, bola odstránená pôsobením VX-680 (doplnkový obrázok S2b). Fosforylácia KCTD12 a mechanizmy, z ktorých tento proces vychádza, sa overili imunoprecipitáciou s použitím protilátky KCTD12 a následnej analýzy westernovým prenosom s použitím fosfoserínovej protilátky. Ako sa očakávalo, ošetrenie VX-680 (obrázok 5a) a knockdown Aurora A (obrázok 5b) významne znížili hladiny fosforylácie KCTD12 v HeLa bunkách. Pretože sa predpokladalo, že KCTD12 bude fosforylovaný Aurora A na 4 serínových miestach, skonštruovali sme 4 plazmidy s mutáciami S185G, S187A, S200A a S243A, aby sme určili, ktoré serínové miesto bolo fosforylované Aurorou A. Ko-transfektovali sme HeLa bunky s Aurora A a KCTD12. plazmidy divého typu alebo mutantné plazmidy. Výsledky experimentu ukázali, že Aurora A významne zvýšila hladiny fosforylácie KCTD12 (obrázok 5c) a že KCTD12 sa mohol stále fosforylovať, keď bol mutovaný S185 alebo S187, ale nemohol byť fosforylovaný, keď bol mutovaný S200 alebo S243 (obrázok 5d). Preto sme dospeli k záveru, že Aurora A môže fosforylovať KCTD12 na S200 a S243, ale nie na ďalších 2 serínových miestach. Celkovo naše zistenia naznačujú, že KCTD12 je regulovaný Aurora A fosforyláciou.

Image

KCTD12 je fosforylovaný Aurora A v seríne 200 a seríne 243. a ) HeLa bunky boli ošetrené DMSO alebo VX-680 (0, 5 uM, 24 h). Bunkové lyzáty sa imunoprecipitovali s protilátkou KCTD12 a naviazané proteíny sa analyzovali imunoblottingom s fosfoserínovou protilátkou. Hladiny expresie p-Aurora A a aktínu boli stanovené v lyzátoch celých buniek. ( b ) Porovnanie hladín fosforylácie KCTD12 v HeLa bunkách transfekovaných siRNA proti Aurora A (100 nM, 24 h) alebo kontrolných siRNA s tými v netransfekovaných HeLa bunkách sa hodnotilo imunoprecipitáciou a westernovým prenosom. ( c ) Nadmerná expresia Aurora A (1 μg, 36 h) v HeLa bunkách mala pozitívny účinok na fosforyláciu KCTD12. ( d ) HeLa bunky boli kotransfekované plazmidom exprimujúcim Aurora A a plazmidom exprimujúcim divoký typ KCTD12 alebo mutantom S185G, S187A, S200A, S243A. Hladiny fosforylácie KCTD12 sa detegovali imunoprecipitáciou a westernovým prenosom. Všimnite si, že KCTD12 nemohol byť fosforylovaný Aurora A, keď bolo miesto serínu 200 alebo serínu 243 mutované.

Obrázok v plnej veľkosti

Fosforylácia KCTD12 v seríne 243 je nevyhnutná na podporu proliferácie rakovinových buniek a tumorigenézy

Aby sme určili, či je fosforylácia KCTD12 v seríne 200 a seríne 243 Aurora A potrebná na účinky KCTD12 na podporu rakoviny, uskutočnili sme sériu experimentov in vitro a in vivo . Najprv sme transfekovali HeLa bunky plazmidom exprimujúcim divoký typ KCTD12, mutantom KCTD12 S200A, mutantom KCTD12 S243A alebo vektorovou kontrolou a analyzovali sme schopnosť týchto buniek tvoriť kolónie. Výsledky ukázali, že nadmerná expresia divého typu KCTD12 alebo KCTD12 S200A mutantu zvýšila schopnosť tvorby kolónií v HeLa bunkách, zatiaľ čo nadmerná expresia KCTD12 S243A mutantu nevykazovala tento účinok (obrázok 6a a doplnkový obrázok S3), čo naznačuje, že fosforylácia KCTD12 pri serín 200 nie je potrebný pre svoje účinky na proliferáciu rakovinových buniek. Ako je znázornené na obrázku 6b, údaje WST-1, ktoré ukazujú, že proliferácia HeLa buniek podporovaných KCTD12, ale nie KCTD12 S243A, potvrdila, že serín 243 hrá dôležitú úlohu v biologickej funkcii KCTD12. Pokiaľ ide o mechanizmus, ktorý je základom tohto javu, zistili sme, že nadmerná expresia KCTD12 divokého typu, ale nie mutantu S243A, by mohla významne zvýšiť percento buniek vstupujúcich do fázy M (obrázok 6c). Tieto údaje naznačujú, že KCTD12 uľahčoval G2-M-M fázový prechod a že serín 243 je potrebný pre tento proces. Ďalej, aby sme preskúmali úlohu KCTD12 pri uľahčovaní tumorigenicity in vivo , subkutánne sme injikovali HeLa bunky ektopicky exprimujúce divoký typ KCTD12, mutant S243A alebo vektorovú kontrolu nahým myšiam. Výsledky tohto experimentu ukázali, že HeLa bunky stabilne exprimujúce divoký typ KCTD12 tvorili väčšie nádory ako bunky exprimujúce vektorovú kontrolu (607, 1 ± 146, 8 oproti 261, 9 ± 115, 0 mm3; P <0, 01); stimulačné účinky KCTD12 na rast nádoru sa však zrušili, keď sa serín 243 v KCTD12 zmutoval (obrázok 6d). Okrem toho porovnania nádorových xenoimplantátov imunohistochémiou ukázali, že stimulačné účinky KCTD12 na rast nádoru bolo možné pripísať zvýšeniu proliferácie buniek, čo potvrdzuje naše pozorovanie vyššieho indexu proliferácie Ki-67 (priemerný index sa zvýšil z 39, 5 ± 7, 9) % v kontrolnej skupine vektorov na 70, 7 ± 6, 6% v skupine KCTD12 divokého typu; P <0, 01; obrázok 6e). Súhrnne tieto údaje ukázali, že KCTD12 riadil progresiu bunkového cyklu a tumorigenicitu a že serín 243 je pre tieto účinky rozhodujúci.

Image

Fosforylácia KCTD12 na Ser243 je nevyhnutná na proliferáciu buniek krčka maternice a tumorigenézu. ( a - c) HeLa bunky boli transfekované plazmidom exprimujúcim divoký typ KCTD12, mutantom S243 alebo prázdnym vektorom (1 μg, 24 h). Schopnosť buniek proliferovať a tvoriť kolónie bola porovnávaná medzi tromi skupinami pomocou tvorby kolónií ( a ) a testov WST-1 ( b ) a bola uskutočnená prietoková cytometria na stanovenie percentuálneho podielu buniek vo fáze M v týchto troch skupinách. bunky transfekované uvedenými plazmidmi ( c ). ( d ) Obrázky nádorov (ľavý panel) a rastových kriviek (pravý panel) subkutánnych nádorov tvorených HeLa-KCTD12, HeLa-KCTD12 S243A alebo vektorových kontrolných buniek u nahých myší ( n = 6). ( e ) imunofarbenie na Ki-67 v nádorových xenoimplantátoch z 3 skupín (ľavý panel) a kvantifikácia indexu proliferácie nádoru (pravý panel). Bary, sd; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001 v porovnaní s kontrolami, pokiaľ nie je uvedené inak.

Obrázok v plnej veľkosti

KCTD12 uľahčuje interakciu medzi CDC25B a CDK1

Ďalej sme skúmali mechanizmy, ako je fosforylácia KCTD12 v seríne 243 dôležitá pre jeho úlohu pri podpore bunkovej proliferácie. Imunoprecipitačné experimenty ukázali, že schopnosť KCTD12 interagovať s CDK1 bola významne zrušená, keď bol serín 243 KCTD12 mutovaný (obrázok 7a), a rovnaký jav bol pozorovaný, keď boli bunky ošetrené inhibítorom Aurora A VX-680 (obrázok 7b) ), zatiaľ čo väzba KCTD12 na CDC25B nebola narušená za žiadnych podmienok. Pretože interakcia medzi CDC25B a CDK1 je potrebná pre prechod G2 / M a vyššie uvedené zistenia naznačujú, že fosforylácia KCTD12 v seríne 243 je dôležitá pre jej účinky na prechod G2 / M a proliferáciu buniek (obrázok 6), ďalej sme skúmali dopady KCTD12 a jeho miesta S243 na interakciu CDC25B a CDK1. HeLa bunky boli transfekované plazmidom exprimujúcim mutant KCTD12 alebo S243A divokého typu a úroveň expresie CDC25B bola stanovená v imunoprecipitátoch CDK1. Výsledky ukázali, že divoký typ KCTD12, ale nie mutant S243A, uľahčil interakciu CDC25B a CDK1 (obrázok 7c). Ďalej sme skúmali účinky Aurory A na interakciu CDC25B a CDK1. Ako je uvedené na obrázku 7d, interakcia medzi CDK1 a CDC25B bola významne znížená v bunkách ošetrených VX-680. Celkovo naša štúdia naznačuje, že KCTD12 uplatňuje svoje účinky na rakovinu tým, že vytvára komplex s CDC25B a CDK1, a fosforylácia KCTD12 v seríne 243 je nevyhnutná pre interakciu KCTD12 a CDK1, ale nie je to rozhodujúci faktor pre interakciu s CDC25B. Fosforylácia KCTD12 v S243 by tiež mohla uľahčiť interakciu CDC25B a CDK1 na aktiváciu CDK1 a jeho downstream cieľa Aurora A, ktorý zase fosforyluje KCTD12 v seríne 243 na aktiváciu KCTD12, čím sa iniciuje pozitívna spätnoväzbová slučka, ktorá uľahčuje vstup buniek do mitózy. a podporuje proliferáciu rakovinových buniek (obrázok 7e).

Image

KCTD12 interaguje s CDC25B a CDK1 za vzniku slučky pozitívnej spätnej väzby a uľahčuje prechod G2 / M. ( a, b ) fosforylácia KCTD12 S243 bola nevyhnutná pre jeho interakciu s CDK1, ale nie s CDC25B. Bunky HeLa transfekované plazmidom divokého typu KCTD12 alebo plazmid mutantného S243A (1 μg, 24 h) sa použili na vykonanie imunoprecipitačných testov ( a ) a bunky ošetrené s VX-680 (0, 5 μM, 24 h) sa použili na stanovenie vplyvu Aurory A na interakciu KCTD12 a CDC25B alebo CDK1 ( b ). ( c ) HeLa bunky sa transfekovali s plazmidom exprimujúcim mutant KCTD12- alebo S243A divokého typu (1 μg, 24 h) a expresia CDC25B sa analyzovala v imunoprecipitátoch CDK1 imunoblotovaním. Hladiny expresie CDK1, CDC25B, KCTD12 a aktínu boli tiež stanovené v lyzátoch celých buniek. Bunky použité na imunoprecipitáciu boli synchronizované do fázy M. ( d ) Interakcia CDC25B a CDK1 v HeLa bunkách ošetrených s DMSO alebo VX-680 (0, 5 μM, 24 h) sa hodnotila imunoprecipitáciou a westernovým prenosom. Bunky boli synchronizované do fázy M na imunoprecipitáciu. ( e ) Schematický diagram, ktorý sumarizuje, ako slučka pozitívnej spätnej väzby KCTD12-CDC25B-CDK1-Aurora uľahčuje vstup buniek do mitózy.

Obrázok v plnej veľkosti

diskusia

Ako jedna z charakteristických znakov rakoviny vedie dysregulácia bunkového cyklu k tumorigenéze a progresii rakoviny. Mechanizmy, ktoré sú základom tohto fenoménu, však treba objasniť. Sú naliehavo potrebné štúdie systematicky identifikujúce a charakterizujúce nové regulátory progresie bunkového cyklu. V tejto štúdii nám úspešné vytvorenie modelu synchronizácie buniek umožnilo vyčistiť rakovinové bunky v každej fáze a porovnať ich proteínové profily pomocou SILAC a LC-MS / MS. Identifikáciou cyklínu B1, proteínu špecifického pre mitózu 31, ako jedného z proteínov exprimovaných na vyššej úrovni v M fáze ako v S fáze, sme preukázali, že táto skríningová stratégia je účinným nástrojom na identifikáciu proteínov, ktoré sú rozdielne exprimované v každej bunke. fázu cyklu, ako aj nové regulátory spracovania bunkového cyklu. Tu uvádzame prvý dôkaz naznačujúci, že KCTD12 môže uľahčiť vstup rakovinových buniek do fázy M a podporovať proliferáciu buniek a tumorigenézu.

Aktivácia CDK1 podporuje tvorbu mitotického vretienka a separáciu centrosómov a nakoniec indukuje bunkovú mitózu. 32, 33 Je dobre známe, že CDK1 sa môže aktivovať pomocou CDC25B defosforyláciou v mieste Thr14 / Tyr15, ale nie je jasné, či sú do tohto procesu zapojené ďalšie molekuly. In present study, by performing immunoprecipitation and mass spectrometry, we identified CDK1 as an interacting partner of KCTD12, which can dephosphorylate and activate CDK1 and thus promote cell proliferation. Moreover, we found that KCTD12 bound to CDC25B and that CDC25B knockdown significantly abrogated the effects of KCTD12 on CDK1 and the malignant phenotype in cancer cells (Figure 4), suggesting that KCTD12 may interact with both CDK1 and CDC25B to form a complex and thus play an important role in cell cycle regulation and cancer development. Our results indicate that aberrant CDK1 signaling activation plays a role in cancer cell proliferation and may thus be a potential therapeutic target in the treatment of human cancer. Recent advances in chemistry biology and detection technology have been found to be instrumental in identifying inhibitors of protein binding. 35 As we have uncovered evidence that the interaction between KCTD12 and CDK1 play an important role in cancer progression, our next step is to screen these protein binding inhibitors to determine their usefulness in cancer therapy.

Aurora A modifies the structure and function of the cytoskeleton and chromosomes and thus regulates cell cycle progression. 36 Aurora A also interacts with BRCA1 to induce breast tumorigenesis 37 and regulates the transcription of human telomerase reverse transcriptase through c-myc pathways in ovarian and breast epithelial carcinomas. 38 Phosphorylation is the most common post-translational modification of proteins. 39 The results of our immunoprecipitation and mutation experiments indicated that KCTD12 can be phosphorylated by Aurora A at serine 200 and serine 243, and the results of our functional assays showed that serine 243 but not serine 200 is required for the cancer-promoting effects of KCTD12 (Figure 6, Supplementary Figure S3). Interestingly, Aurora A, a downstream target of CDK1, was found to be phosphorylated by KCTD12 (Figure 4), a finding indicative of the existence of a positive regulatory loop in which KCTD12 facilitates the entry of cancer cells into M phase and promotes cancer cell proliferation by activating CDK1 signaling, and Aurora A phosphorylates KCTD12 at serine 243. This feedback loop is necessary for KCTD12 to regulate cell cycle progression and tumorigenesis.

Studies aiming to develop effective diagnostic and prognostic biomarkers for cancer are urgently needed. In this study, we found that KCTD12 plays an important role in cell cycle regulation and tumorigenesis in cervical and lung cancers and report for the first time that KCTD12 is frequently upregulated in cervical and lung cancers. Our findings strongly suggest that KCTD12 may be a useful diagnostic biomarker for these cancers. More importantly, higher KCTD12 expression in primary tumors is significantly correlated with unfavorable tumor stages and shorter survival in patients with lung cancer. To determine the clinical significance of KCTD12 in cervical cancer, we searched for a tissue microarray with survival data. Unfortunately, cervical cancer cohorts with survival data are lacking. Cervical cancer is the third most common cancer among women worldwide and leads to 275 000 deaths every year. 40 Our study demonstrated the prognostic value of KCTD12 in lung cancer; however, the potential of KCTD12 as a prognostic marker in cervical cancer warrants further investigation.

Materiály a metódy

Cell lines and drugs

Human cervical cancer HeLa cells and lung cancer A549 cells (ATCC, Rockville, MD, USA) were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) at 37 °C with 5% CO 2 . The cell lines were authenticated by short tandem repeat profiling, and tested for mycoplasma contamination. VX-680 and Ro-3306 were purchased from Selleck Chemicals (Huston, TX, USA) and dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO).

Cell cycle synchronization

We employed the double-block method with thymidine and nocodazole (Sigma, San Francisco, CA, USA) to develop the cell cycle synchronization model. 41 For the first block, HeLa cells in exponential phase were treated with 2.5 m M thymidine for 18 h and then washed with PBS and released in medium for 10 h. For the second block, the cells were treated with 2.5 m M thymidine for 16 h. Some G1/S phase cells were subsequently collected. The remaining cells were released again, and S phase and G1 phase cells were collected 4 and 15 h later, respectively. G2 phase cells were collected upon being released and treated with nocodazole (100 ng/ml) for 8 h, and M phase cells were collected upon being released and treated with nocodazole for 10 h.

SILAC labeling and LC-MS/MS analysis

Normal Dulbecco's modified Eagle's medium deficient in arginine (R) and lysine (K) was supplemented with L-[13C6, 15N4] arginine (R10) and L-[13C6] lysine (K6) for 'heavy' labeling, whereas L-[12C6, 14N4] arginine (R0) and L-[12C6, 14N2] lysine (K0; Thermo Fisher Scientific) were used for 'light' labeling, as described previously. 42, 43 Equal amounts of 'light' and 'heavy' proteins were subsequently mixed and loaded onto SDS–PAGE gels for pre-separation. After in-gel digestion, the peptide mixtures were analyzed by reverse-phase LC-MS/MS.

Plasmids, siRNAs and transfection

Flag-KCTD12 and Aurora A plasmids were generated by PCR amplification of sequences obtained from a colon cancer cDNA library and cloned into a pCMV-N-flag and pcDNA3.1 vector, respectively. The following primers were used to generate the KCTD12 and Aurora A plasmids: KCTD12: forward (5′-CCGGAATTCCACCTCTCTGTCATGGCTCT-3′) and reverse (5′-CTGCAGAGAACTCAGCACCAAG-3′); Aurora A: forward (5′-CGCGGATCCATGGACCGATCTAAAGAAAACTGCA-3′) and reverse (5′-CGCGATATCCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCAGACTGTTTGCTAGCTGATTCT-3′). Transfection was performed using Lipofectamine TM 3000 reagent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), according to the manufacturer's recommendations. HeLa cells stably expressing wild-type KCTD12, KCTD12 S243A mutants or empty vectors were established with approximately 2 weeks of G418 selection. The siRNA sequences used in this study are listed in Supplementary Table S3.

Miestna mutagenéza

A site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) was used to generate KCTD12 S243A, S185G, S187A and S200A mutant constructs for the creation of a pCMV-N-flag-KCTD12 vector, according to the manufacturer's instructions. The primers used for these experiments are listed in Supplementary Table S4.

Western blotting

The cell pellets were suspended in lysis buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) and incubated on ice for 30 min. The cell lysates were subsequently centrifuged at 14000 g for 30 min at 4 °C, after which supernatant was mixed with loading buffer and boiled for 5 min at 95 °C before being loaded onto a sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel for electrophoresis. The proteins were subsequently transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes (Millipore, Billerica, MA, USA). After being blocked with 5% fat-free milk in Tris-buffered saline-Tween 20 (TBST), the membranes were probed with the appropriate primary antibodies, followed by the corresponding horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies (Cell Signaling Technology). The signals were detected by Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) and visualized by exposure to autoradiographic film. Antibodies against the following proteins were used for the experiment: KCTD12 (#I5523-1-AP) and cyclin A2 (# 66391-1-Ig), which was obtained from Proteintech Group (Chicago, IL, USA); andcyclin B1 (#sc-7393), cyclin D1 (#sc-8396), cyclin E (#sc-377100), CDK1 (#sc-954), p-CDK1 (#sc-12340-R), and actin (#sc-8432), which were obtained from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); and CDC25B (#ab124819), Aurora A (#ab1287) obtained from Abcam (Cambridge, MA, USA).

Flow cytometric cell cycle analysis

The cells were fixed with 70% alcohol for 1 h at −20 °C and then stained with propidium iodide (PI) staining buffer (PBS containing 33 μg/ml PI, 0.13 mg/ml RNaseA, 10 m M EDTA, 0.5% TritonX-100) for 10 min at room temperature. Cell cycle analysis was performed on a BD Accuri C6 Analyzer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Flow cytometry analyses of the cells stained with phospho-H3 AF488 antibody (#3465; H3P, Cell Signaling Technology) were performed as described previously. 44 Briefly, the fixed cells were treated with 0.25% Triton X-100 on ice for 15 min, and then incubated with H3P antibody (1:1600 in 1% BSA) for 3 h at room temperature. The H3P antibody-labeled cells were subsequently stained with PI and analyzed on a flow cytometer.

Test WST-1

Cell viability was measured using a WST-1 Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). Briefly, the cells were seeded in 96-well plates at an approximate density of 2000 cells were seeded per well. At the indicated time points, 10 μl of WST-1 reagent was added to the wells. The cells were subsequently incubated for 4 h at 37 °C. The absorbance was measured at a wavelength of 450 nm.

Stanovenie kolónií

Colony-formation assay was performed as described previously. 45 Briefly, the cells were seeded in six-well plates at an approximate density of 500 cells per well. After 14 days, the cells were fixed with methanol and stained with 0.1% crystal violet. The number of colonies was counted for analysis.

imunofluorescencia

The cells were fixed in 4% paraformaldehyde and permeabilized with 0.1% TrintonX-100 for 10 min before being blocked with 10% goat serum for 2 h. The cells were then incubated with primary antibodies against the indicated proteins (KCTD12 and CDK1) overnight at 4 °C before being washed 3 times × 5 min with 1% TBST. The cells were subsequently incubated with the appropriate fluorescent secondary antibodies for 2 h at room temperature before being counterstained with 40, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) and observed by laser scanning confocal microscopy (Carl Zeiss AG, Jena, Germany).

Co-immunoprecipitation (Co-IP)

The cell lysates were pre-washed with IgG (Santa Cruz Biotechnology) and protein A/G Sepharose beads (Invitrogen, Gaithersburg, MD, USA) for 1 h at 4 °C, and the cell supernatants were incubated with the appropriate primary antibody overnight at 4 °C before being incubated with protein A/G Sepharose beads for 4 h. The beads were washed thrice with lysis buffer and eluted in 2 × SDS/PAGE loading buffer for immunoblotting. For LC-MS/MS analysis, the lanes on the silver-stained gels were cut into several bands and in-gel digested, after which the peptide mixtures were analyzed by LC-MS/MS.

Tumorigenicity in nude mice

The in vivo tumorigenesis experiment was performed as described previously. 46, 47 Female BALB/c nude mice aged 6–8 weeks were maintained under standard conditions and cared for according to the institutional guidelines for animal care. Briefly, HeLa cells stably overexpressing wild-type KCTD12, mutant KCTD12, or vector controls were suspended in a 1:1 mixture of PBS/Matrigel and then subcutaneously injected into the flanks of the mice. Tumor size was measured with calipers every three days, and tumor volume was calculated using the following equation: V =(length × width 2 )/2. All animals were sex- and age-matched in the animal experiments, and littermates were used. The investigators were not blinded to the experimental groups. All animals were killed at the end of the study, and their tumors were collected for further analysis. All the animal experiments were approved by the Ethics Committee for Animal Experiments of Jinan University.

Immunohistochemistry and staining evaluation

Imunohistochémia sa uskutočňovala tak, ako sa už opísalo. 48 A human cervical cancer tissue microarray containing 93 pairs of cervical cancer tissues and adjacent normal tissues (Shanghai Outdo Biotech, Shanghai, China), a human lung cancer tissue microarray containing 75 pairs of lung cancer tissues and adjacent normal tissues (Shanghai Outdo Biotech), and a human lung cancer tissue microarray containing 88 lung cancer tissue samples with survival data (Shanghai Outdo Biotech), as well as tumor xenograft sections, were deparaffinized in xylene, rehydrated in a graded series of ethanol solutions and processed for immunohistochemistry. After the slides were subjected to antigen retrieval and blocked with normal serum, they were incubated with a KCTD12 or Ki-67 antibody (Dako, Mississauga, ON, Canada) overnight at 4 °C, washed with PBS, and then incubated with the appropriate peroxidase-conjugated secondary antibody (Dako). Immunostaining was visualized using 3, 3'-diaminobenzidine (Dako), which served as a chromogen, and the sections were counterstained with hematoxylin. The investigators were blinded to sample identity in the assessment of Ki-67 in tumor xenograft sections. KCTD12 immunostaining was evaluated based on scores representing the percentage of positively stained tumor cells and the staining intensity grade. These scores were determined by two independent pathologists. The percentages of positively stained tumor cells were scored according to the following scale: 0, <10%; 1, 10–30%; 2, 30–50%; 3, 50–80%; and 4, 80–100%; and the staining intensities were classified into the following four categories: 0, no staining; 1, weak staining; 2, moderate staining; 3, strong staining. Ki-67 staining was assessed as described previously. 49

Štatistická analýza

The results were analyzed using GraphPad PRISM software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA), and the data from different experiment were compared by Student's t -test and expressed as the mean±sd Sample size in animal experiments was chosen on the basis of literature documentation of similar well-characterized experiments, and no statistical method was used to predetermine sample size. Pearson's chi-square test was performed to analyze the association between KCTD12 expression levels and categorical clinicopathological variables. Survival analysis was performed using the Kaplan-Meier method with the log-rank test. P <0, 05 sa považoval za štatisticky významný.

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplnková informácia

    Doplňujúce informácie sú priložené k tomuto dokumentu na webovej stránke Oncogene (//www.nature.com/onc).