Identifikácia kinázových substrátov pomocou testu s ťažkou atp kinázou a kvantitatívnej hmotnostnej spektrometrie vedecké správy

Identifikácia kinázových substrátov pomocou testu s ťažkou atp kinázou a kvantitatívnej hmotnostnej spektrometrie vedecké správy

Anonim

predmety

  • kinázy
  • proteomiky

abstraktné

Kinázové kinázové obrazovky založené na hmotnostnej spektrometrii hrajú zásadnú úlohu pri objavovaní kinázových substrátov, avšak mnohí trpia biologickým a technickým šumom alebo vyžadujú geneticky zmenené systémy enzýmov a kofaktorov. Opisujeme spôsob, ktorý kombinuje stabilné y- [18O2] -ATP s klasickými in vitro kinázovými testami v súčasnom kvantitatívnom proteomickom pracovnom toku. Náš prístup zlepšil detekciu známych substrátov nereceptorovej tyrozínkinázy ABL1; a identifikovali potenciálne nové substráty in vitro .

úvod

Tyrozínkinázy hrajú ústrednú úlohu v mnohých dráhach transdukcie bunkových signálov a pri ľudských patológiách sa často nachádzajú neregulované 1, 2 . Ideálne je plne porozumieť funkcii kinázy; mali by byť známe tak interaktory, ako aj substráty. V posledných rokoch sa objavili rôzne kombinácie in vitro kinázových testov spojených s hmotnostnou spektrometriou (MS) na detekciu kinázových substrátov 3 . Napriek adaptácii pôvodnej Kestrelovej metodiky 4, 5, nešpecifická fosforylácia pozadia a šum súvisiaci s kvantifikáciou obmedzili citlivosť a spoľahlivosť kinázových testov založených na MS. V snahe osloviť bývalého, Shah et al . vytvorili adenozíntrifosfátové (ATP) kinázy citlivé na analógy (AS), ktoré sa prednostne viažu na „objemné“ deriváty ATP 6 . Tieto geneticky upravené AS-kinázy špecificky označujú substráty napríklad tiofosfátom, ktorý sa dá rozlíšiť od konvenčnej fosfátovej skupiny pomocou MS. Nie všetky kinázy však možno konvertovať na AS-kinázy a niektoré môžu stratiť funkčnosť a / alebo substrátovú špecificitu 7 . Fyziologickejší prístup spočíva v použití prirodzene exprimovaných kináz v kombinácii so stabilným izotopovo značeným ATP. Nahradením 16 atómov v y-fosfátovej skupine ATP za 18 izotopov sa získa hmotnostný posun 2 amu na atóm kyslíka 8 . Kinázou sprostredkovaný transfer „ťažkej“ 18O-značenej y-fosfátovej skupiny na proteínový substrát následne označuje novo zavedené fosfoskupiny 9, 10 . Výhody takýchto analógov ATP boli predtým demonštrované, napr . Detekcia fosforylačných miest 9 ; stanovenie špecifickosti inhibítorov kinázy 8 ; meranie aktivity kinázy v jadre 11 a identifikácia substrátov CDC28 alebo ERK1 10, 12 . Doteraz však použitie 18 O-značeného ATP v oblasti proteomiky nie je rozsiahle.

Predstavujeme „ťažkú“ ATP kinázovú analýzu kombinovanú s kvantitatívnou hmotnostnou spektrometriou (HAKA-MS), ktorá spoľahlivo identifikuje in vitro kinázové substráty. Ako model bola vybraná dobre študovaná nereceptorová tyrozínkináza ABL1. Táto technika umožňuje disekciu substrátov in vitro z bazálneho fosfoproteómu, čo je hlavnou výzvou pre prirodzene sa vyskytujúci „ľahký“ ATP 3 . V HAKA-MS sa to riešilo: (i) globálnou a ireverzibilnou inaktiváciou endogénnych kináz použitím 5 '- [p- (fluórsulfonyl) benzoyl] adenozínu (FSBA) 13 ; (ii) porovnanie fosforylácie substrátu medzi konštitutívne aktívnym ABL1-PP (P242E, P249E) a katalyticky neaktívnym ABL1-Kin - (K290R); iii) vizualizácia modelov časovej fosforylácie; a (iv) substitúciu prirodzene sa vyskytujúceho ATP verziou označenou 18O v in vitro kinázovom teste 9, 10, 12 .

výsledok

Stratégia HAKA-MS na identifikáciu substrátov ABL1

Bunkové imunopurifikované ABL1-PP a ABL1-Kin - sa zmiešali s cytosolickým extraktom buniek HEK293 ošetreným FSBA, ako je znázornené na obr. 1. FSBA sa široko používa ako prototypová afinitná značka na báze nukleotidov pre kinázy a ďalšie väzby ATP. proteíny. Fluorosulfonylová časť tohto analógu ATP môže reagovať s nukleofilnými zvyškami, tj konzervovaným lyzínom v ATP väzbovom mieste kináz za vzniku kovalentného aduktu, ktorý ireverzibilne zaberá väzbové miesto ATP 14, 15 . Inhibičná účinnosť FSBA bola predtým preukázaná 13, 14, 16 a 1 mM FSBA je dostatočný na potlačenie endogénnej kinázovej aktivity (doplnkový obrázok 1). Akákoľvek zvyšková kinázová aktivita v extrakte bude zrejmá v kinázovej kontrole ABL-Kin - . Nadbytok FSBA a endogénny ATP sa odstránili filtráciou. Kinázová reakcia bola iniciovaná pridaním 'ťažkého' ATP a kinázové reakčné páry boli utlmené po 30, 90 a 150 minútach. Časové body boli vybrané na základe imunoblotov a-fosfotyrozínu (a-pY), ktoré vykazovali dočasné zvýšenie fosforylácie pre aktívny ABL1-PP pred plató na 150 minút (doplnkový obrázok 2). Proteíny boli redukované, alkylované, štiepené a fosfotyrozínové peptidy obohatené imunopurifikáciou. Po označení činidlami TMT 6-plex, aby sa umožnilo relatívne kvantifikovanie naprieč 6 vzorkami (obr. 2a); spojené vzorky boli ďalej obohatené imobilizovanou afinitnou chromatografiou na kov (IMAC) 17 a analyzované pomocou nano-LCMS. Značenie TMT a združovanie peptidov sa uskutočňovalo po obohatení pY-peptidom, pretože na označenie miligramov východiskovej látky by bolo potrebné nereálne množstvo činidla ( tj 2–5 mg). Aby sa predišlo ďalšej experimentálnej variabilite, je tiež nevyhnutné uskutočňovať imunoprecipitačný postup v rôznych TMT kanáloch tak dôsledne a opatrne, ako je možné. Získané údaje boli prehľadávané proti ľudskej databáze proteínov SwissProt s variabilnými modifikáciami serínovej, treonínovej (+80 Da) a tyrozínovej fosforylácie (+80 a +84 Da pre „ľahkú“ a „ťažkú“ verziu).

Image

Cytosolické frakcie boli ošetrené inhibítorom pankinázy FSBA, aby sa ireverzibilne zrušila aktivita bunkovej kinázy. Súčasná výmena za pufer kinázového testu; a odstránenie nadbytku FSBA a endogénneho ATP sa dosiahlo ultrafiltráciou. Paralelne boli konštitutívne aktívne ABL1-PP a neaktívne ABL1-Kin imunopurifikované proteínovými guľôčkami Sepharose. Pred kinázovým testom boli spracované frakcie lyzátu a premyté frakcie kinázových guľôčok rovnomerne rozdelené, zmiešané a kinázová reakcia bola zahájená pomocou 'ťažkého' 18O-značeného ATP. Aby sa získala kinetická séria fosforylácie, páry aktívnych / neaktívnych kinázových reakcií sa ochladili v definovaných časových bodoch. Po enzymatickom štiepení boli peptidy koncentrované extrakciou v tuhej fáze a peptidy obsahujúce fosfotyrozín obohatené imunoprecipitáciou. Eluované peptidy sa chemicky modifikovali s izobarickými amín-reaktívnymi tandemovými hromadnými značkami (TMT), aby sa získali vzorky multiplexu 3x2. Po druhom obohatení fosfopeptidmi imobilizovanou afinitnou chromatografiou na kove (IMAC) sa vzorka analyzovala pomocou LCMS.

Obrázok v plnej veľkosti

Image

Príklad spektra MS 2 zodpovedajúceho tryptickému peptidu odvodenému od SRC8, ktorý obsahuje hlásené miesto fosforylácie ABL1. Priradené fragmentové ióny poskytujú peptidovo špecifické sekvenčné informácie, ktoré sa používajú na výpočtové porovnanie údajov so zodpovedajúcim peptidom v proteínovej databáze. Určité fragmentové ióny ( tj y8 a b7) jednoznačne priradia fosfátovú skupinu (+84 Da) k Y421 a nie k S417, S418 alebo S426. ( a ) Zväčšenie TMT reportérovej iónovej oblasti na ilustráciu relatívneho množstva jednotlivých multiplexovaných vzoriek pre tento špecifický peptid obsahujúci fosfotyrozín. Intenzita iónov TMT 6-plex sa použila na vytvorenie individuálnych relatívnych pomerov alebo na vykreslenie kinetiky postupu reakcie. b ) ióny pY-imónia pre „ľahké“ ( m / z 216, 04) a „ťažké“ ( m / z 220, 04) verzie fosfopeptidu. Existencia a relatívny výskyt imóniových iónov poskytujú jednoznačný dôkaz fosforylácie zvyškov tyrozínu a kontroly kvality príslušného spektra. c ) prekurzorový ión MS 1 peptidu obsahujúceho fosfotyrozín s izotopológmi „ľahký“ ( m / z 683, 6848) a „ťažký“ ( m / z 685, 0192). Oba izotopológy (modré a červené píky) vykazujú typické rozdelenie izotopov 12 C / 13 C (1 amu separácia), ale s malým prekrytím v dôsledku malého ∆ m / z 1, 333 Th. Prekurzorová iónová selekcia monoizotopického piku (ružová oblasť) bola v izolačnom okne ± 0, 4 Th a čiastočne zahŕňala „svetelný“ izotopológ (štvrtý 13C-izotopický pík).

Obrázok v plnej veľkosti

HAKA-MS ABL1 identifikovala 180 jedinečných fosfotyrozínových (pY) miest zo 130 fosfoproteínov, ktoré prešli kritériami filtra a ručnou validáciou. Väčšina fosfopeptidov mala jednoducho fosforylovaný zvyšok tyrozínu. Ďalšie fosfoskupiny v serínových, treonínových alebo tyrozínových zvyškoch boli zrejmé u 21 peptidov. Spárované peptidy obsahujúce pY segregujú do dvoch odlišných skupín; obsahujúce buď „ľahké“ alebo „ťažké“ fosfotyrozínové skupiny. Iba šesť pY-peptidov bolo identifikovaných ako obe formy. Dôvodom bolo: (i) výlučné obsadenie fosfotyrozínového peptidu; a / alebo (ii) koexistencia izotopológov (obr. 2c) a preferenčná izolácia a fragmentácia silnejšieho iónu. Ako je uvedené vyššie 9, hmotnostné prírastky označili miesta de novo fosforylácie a umožnili rozrezanie nových fosfo-miest z už existujúceho „ľahkého“ fosfoproteómu. Exogénne kontaminanty, napr . Stopařské fosfoproteíny z ABL1-PP a ABL1-Kin - imunopurifikácia, boli vylúčené z údajov, pretože príspevok takýchto proteínov sa vyskytoval iba pre „ľahké“ miesta. V súlade s Xue a kol . 10 je náš test robustnejší a citlivejší ako pri normálnom ATP. Rovnaký hmotnostný posun (+4 Da) bol tiež pozorovaný pre ióny fragmentu amónneho fragmentu špecifické pre fosfotyrozín pri m / z 216, 0420 a m / z 220, 0505 (obr. 2b). Tieto ióny potvrdzujú prítomnosť peptidu fosforylovaného tyrozínom. Pretože výber iónov nie je úplne presný, môže dôjsť k vylúhovaniu (koizolácii) kontaminujúcich iónov s podobným m / z . V dôsledku malého ∆ m / z sa výberom „ťažkého“ izotopu neúmyselne zachytí tretí alebo štvrtý izotopický pík „ľahkého“ izotopológa (obrázok 2c). V dôsledku toho bude spektrum MS 2 proporcionálne obsahovať fragmenty, TMT- a pY-imóniové ióny pochádzajúce z oboch prekurzorových iónov. Tým môže byť ohrozené priradenie fosfopeptidov a kvantifikácia založená na TMT. Na minimalizáciu ko-izolácie izotopológov „ťažkého“ / „ľahkého“ fosfopeptidu a iných kontaminantov bola zvolená veľmi úzka šírka izolácie prekurzorových iónov ± 0, 4 Thomson. Tento kompromis bol vybraný napriek skutočnosti, že taká úzka šírka izolácie je považovaná za suboptimálnu pre skorú generáciu Q-Exact bez segmentovaného kvadrupólu 18, 19 . Toto nastavenie môže viesť k nižšej miere identifikácie, ale považovalo sa za potrebné v tomto experimente s princípom princípu, kde sa dôraz kládol na identifikáciu domnelých substrátov pomocou kvantifikácie TMT. Budúce aplikácie HAKA-MS by využili väčší hmotnostný posun prevedenej fosfátovej skupiny o 6 Da (1804-ATP alebo 18O3-ATP) v kombinácii s prístrojmi novšej generácie, ktoré umožňujú presnú izoláciu izotopológov bez zníženia citlivosti. Ako opatrenie na kontrolu kvality je ako inkluzívne alebo vylučovacie kritérium ideálne vhodné rozdelenie pY-imónneho iónu v jednotlivých spektrách. Pretože „ľahké“ hladiny pY do značnej miery zostávajú dočasne nezmenené, vylúhovanie iónov môže vykompenzovať kvantifikáciu „ťažkého“ pY (doplnkový obrázok 3).

Dáta TMT 6-plex sa použili na: (i) vytvorenie jednotlivých párov pomerov ABL1-PP / ABL1-Kin (doplnkový obrázok 4); a (ii) vykreslenie normalizovaných rozptylových diagramov založených na intenzite (Obr. 3a, Doplnkový Obr. 5). Zatiaľ čo pomery vykazovali násobné rozdiely medzi aktívnym a neaktívnym ABL1 pre jednotlivé časové body, druhý prístup umožnil stanovenie kinetických rýchlostí. Ako sa očakávalo, „ľahké“ a „ťažké“ miesta PY vykazovali zreteľné globálne časové vzorce. Väčšina „svetelných“ miest zostala nezmenená, s výnimkou všeobecného 1, 9-násobného posunu pre aktívny ABL1 (doplnkový obrázok 4). Táto asymetria pravdepodobne vyplýva z interferencií zavedených purifikáciou kinázy a / alebo z účinku izotopologickej pY-iónovej ko-izolácie. Na rozdiel od toho „ťažké“ pY miesta vykazovali zreteľnú divergenciu medzi aktívnou a neaktívnou fosforyláciou ABL1 (obr. 3a). Zatiaľ čo neaktívne kontroly zostali relatívne stabilné, hladiny aktívneho ABL1-PP sa rýchlo zvyšovali. Neprekvapuje, že fosforylácia pY sledovala asymptotický trend charakteristický pre kinetiku postupu reakcie 20 . V dôsledku významných rozdielov predstavujú tieto novo-fosforylované proteíny in vitro substráty ABL1. (Obr. 3b, Doplnková tabuľka S1). Z nich je 18% známych substrátov ABL1 (11 zo 61 proteínov) a zvyšných 82% (50 proteínov) predstavuje potenciálne nové substráty identifikované pomocou HAKA-MS. DDX3X, LARP1 a RBM14 boli potvrdené ako nové ABL1 substráty v cicavčích bunkách (obr. 4, doplnkový obr. 6). Väčšia frakcia 18 proteínov (30% z celku) bola fosforylovaná pri preferovanom ABL1 YxxP konsenzuálnom motíve 21, čo je kritérium, ktoré sa často používa na ďalšie zvýšenie dôveryhodnosti identifikovaných substrátov z in vitro kinázových testov. V prípade 13 proteínov bolo identifikovaných viac pY miest in vitro, ako je znázornené pre SRC8 a ABI2 (obr. 5). Je dôležité si uvedomiť, že in vitro testy kinázy uskutočňované s bunkovými extraktmi majú inherentné riziko pozorovania neobvyklých interakcií proteín-substrát. Dôvodom je to, že sa obvykle používajú neendogénne koncentrácie aktívnej kinázy a bunková štruktúra sa odstráni. Identifikované substráty sa preto všeobecne nazývajú „ in vitro “. Ako je podrobne diskutované v Knight et al . 3, je vhodné dodatočne potvrdiť biologický význam in vivo biochemickými a / alebo inými proteomickými prístupmi.

Image

( a ) Intenzita TMT reportérových iónov peptidov obsahujúcich fosfotyrozín sa normalizovala a vyniesla do grafu proti príslušnému časovému bodu testu kinázy. Spojovacie čiary sú zobrazené pre aktívny ABL1-PP (oranžový) alebo neaktívny ABL1-Kin - (modrý). Pretože „ťažké“ fosfátové skupiny chýbajú pred pridaním 18 O-značeného ATP, línie sa extrapolovali cez pôvod (vyznačené hypoteticky). Bolo zrejmé jasné oddelenie kinetických trendových línií pre aktívny a neaktívny ABL1. b ) Všetkých 61 identifikovaných in vitro substrátov ABL1 s najmenej jedným „ťažkým“ fosfotyrozínovým zvyškom. Známe a validované substráty sú uvedené zelenou farbou a fialovou farbou. Bielkoviny s fialovým tieňovaním obsahujú preferovaný ABL1 YxxP konsenzuálny motív (hodnota p <0, 05, motív skóre: 4, 63; násobné zvýšenie: 3, 16; www.motif-x.med.harvard.edu). Veľkosť guľôčok označuje počet fosfotyrozínov na substrát. ( c ) Porovnanie distribúcie pomeru ABL1-PP / ABL1-Kin pri 90 minútach pre HAKA-MS (vpredu) oproti kinázovému testu uskutočnenému s normálnym ATP (späť). „Ľahké“ a „ťažké“ peptidy obsahujúce pY sú označené sivou a červenou farbou. V oboch prípadoch je globálna distribúcia bimodálna s plytkým priesečníkom. Pre test normálnej ATP kinázy sa prahová hodnota predpokladaných in vitro ABL1 substrátov aproximovala zmiešaným gaussovským zhlukovaním. Prvý a druhý klaster sa považujú za hluk a substráty in vitro . Porovnanie s HAKA-MS odhalilo, že bez ohľadu na medznú prísnosť ( tj . Ružová, ≥ 4), údaje z normálneho testu ATP môžu obsahovať veľa falošne pozitívnych výsledkov (sivé). Naopak, skutočné pozitíva (červená) boli vylúčené.

Obrázok v plnej veľkosti

Image

( a ) Fosforylačná kinetika pre DDX3X peptid DKDAYSSFGSR. „Ťažká“ fosfátová skupina sa nachádza na Y69. Vypočítané konštanty rýchlosti ( k ) sú vynesené do grafu pre konštitutívne aktívny ABL1-PP a katalyticky neaktívny ABL1-Kin-. Chybové úsečky predstavujú dve štandardné odchýlky (2σ) od priemeru. b ) Biochemická validácia fosforylácie tyrozínu DDX3X sprostredkovaná ABL1. HAX-značený DDX3X bol prechodne kotransfekovaný v bunkách HEK293 v prítomnosti ABL1, ABL1-Kin-, ABL1-PP alebo prázdneho vektora. DDX3X bol imunopurifikovaný HA guľôčkami a stav tyrozínovej fosforylácie bol vyhodnotený imunofarbením a-fosfotyrozínom (4G10). Celkové hladiny DDX3X-HA, ABL1 a tyrozín-fosforylovaných proteínov sa vizualizovali imunofarbením proti a-HA, a-ABL1 a a-fosfotyrozínu (4G10).

Obrázok v plnej veľkosti

Image

Pre substrát korccinu Src (SRC8) a ABL interaktor 2 (ABI2) boli identifikované viaceré „ťažké“ miesta pY; pričom posledne menovaný obsahoval YxxP ABL1 konsenzusový motív na všetkých troch miestach. Grafy ukazujú kinetiku postupu reakcie založenú na TMT 6-plex s rôznymi rýchlostnými konštantami určenými pre každé z pY-miest.

Image

a

Image

, predstavujú rýchlostnú konštantu a strednú rýchlostnú konštantu. Chybové úsečky predstavujú dve štandardné odchýlky (2σ) od priemeru.

Obrázok v plnej veľkosti

Analogicky k Molden et al . 11, HAKA-MS umožňovala stanovenie rýchlosti fosforylácie špecifickej pre miesto; čím sa poskytujú potenciálne informácie o modus operandi kinázy. Dodatočné časové body používajúce TMT 10-plex by zlepšili presnosť určenia kinetickej rýchlosti. Aby sa zistilo, či boli miery konverzie závislé od hojnosti proteínov v cytosolovom extrakte, boli vynesené rýchlostné konštanty proti relatívnemu množstvu použitím metodiky top3 bez značiek 22 . Nezistila sa žiadna korelácia, a preto fosforylácia substrátu nie je ovplyvnená zvýšenými hladinami kinázy a / alebo substrátov (doplnkový obrázok 7).

Monitorovanie dynamiky fosforylácie pomocou multiplexovania TMT

Publikované testy in vitro na kinázach založené na MS obvykle využívajú normálne merania ATP a jednotlivé časové body, ktoré sú citlivé na biochemické a technické variácie, ako je znázornené na obrázku 3c pre časový interval 90 minút. Keď sa test uskutočňoval iba so „ľahkým“ ATP (doplnková tabuľka S2), pozorovaná bimodálna distribúcia bola pozoruhodne podobná HAKA-MS. Za účelom stanovenia prahu pre domnelé substráty sa použila gaussovská zhluková analýza. Boli pozorované dva vzájomne sa spájajúce gaussovské zhluky s maximami v pomeroch 1, 34 a 9, 45. Tieto sa považujú za hluk a prípadne za substráty. Pre zoznam domnelých substrátov bola zvolená ľubovoľná hranica ≥4. Bez ohľadu na takú prísnu hranicu histogram HAKA-MS odhalil, že ak sa použije iba normálny ATP, údaje môžu stále obsahovať veľa falošne pozitívnych výsledkov (sivé). Ako už bolo uvedené vyššie 10, 13, čísla substrátov odvodených od in vitro kinázovej skúšky pre jednu kinázu sú nadhodnotené. Naopak, citlivosť testu sa zníži, keď sa odstránia potenciálne substráty in vitro s nižšou mierou konverzie (násobné zvýšenie) (červená).

diskusia

Aby sa predišlo artefaktom súvisiacim s in vitro , je nevyhnutné zachovať štruktúru proteínov a posttranslačné modifikácie. Inaktivácia FSBA kinázy minimálne ovplyvňuje natívny stav proteínov; zatiaľ čo fosfatázovému a tepelnému spracovaniu 10 by sa malo vyhnúť, pretože rozpoznávanie substrátov ABL1 je čiastočne koordinované prostredníctvom domény SH2 23, 24 viažucej fosfotyrozín. Jednou z potenciálnych nevýhod zachovania stavu fosforylácie je však znížená citlivosť na substráty, ktoré sú už prítomné v bunkách v hlavnej fosforylovanej forme. V dôsledku toho stechiometria „ľahkých“ a „ťažkých“ izotopológov a celkový počet fosfopeptidov určí, či sa peptidy dajú zistiť pomocou LCMS za podmienok závislých od údajov. V snahe prekonať tento nedostatok bola navrhnutá mierna defosforylácia bunkovej frakcie obohatenej fosfoproteínmi pred testom kinázy in vitro10. Tu bola uvedená zvýšená citlivosť na identifikáciu substrátu ERK1 pomocou siKALIP. Takéto tvrdé lyzátové ošetrenie sa môže vyžadovať pre vysoko aktívne serín / treonínkinázy, avšak potreba defosforylovaných bunkových extraktov má malý vplyv na tyrozínkinázy, pretože bunky vykazujú veľmi nízke hladiny tyrozínovej fosforylácie 24, 25 . Po dohode Xue a kol . a ďalší ukázali, že tento prístup nezlepšil detekciu fosfotyrozínového peptidu, a preto by nemal byť obmedzujúcim faktorom 10, 25, 26 .

Okrem toho čistenie ABL1-PP a ABL1-Kin - priamo z buniek udržuje fyziologické bunkové prostredie kináz; tj interakcie s esenciálnymi proteínovými kofaktormi. V porovnaní s existujúcimi prístupmi 3, 10 zvyšuje HAKA-MS spoľahlivosť a spoľahlivosť identifikácie substrátu in vitro disekciou nových fosforylačných miest z bazálneho fosfoproteómu a integráciou kinetiky rýchlosti fosforylácie pre neaktívnu a aktívnu kinázu. Posledne uvedené poskytuje ďalšie kvalitatívne kritérium na rozlíšenie priamych ABL1 kinázových substrátov od potenciálnych sekundárnych účinkov spôsobených neinhibovanou kinázovou aktivitou alebo ne-kinázovými účinkami. Okrem toho pozorovaná dynamika fosforylácie môže poskytnúť cenné poznatky o sekvencii intramolekulárnych fosforylačných udalostí a mohla by sa teoreticky rozšíriť nad rámec porovnania iba aktívnej verzus neaktívnej kinázy. Už existujúce fosforylačné miesta môžu pôsobiť ako modulárne väzbové domény a určovať následné interakcie substrát-kináza 27 . Preto je vhodné zachovať stav fosforylácie v spojení s komplexmi natívnej kinázy, čo je v ostrom kontraste s metódou siKALIP 10 . HAKA-MS je teda vysoko prospešná, pretože sa ľahko kombinujú ľahko dostupné technológie a obchádza sa mnoho úskalí in vitro kinázových testov založených na MS. Nakoniec sa predpokladá, že tento prístup bude všeobecne použiteľný pre všetky kinázy na zjemnenie a nové vymedzenie krajiny kinázového substrátu.

metódy

DNA konštrukty, protilátky a reagenty

ABL1, ABL1-Kin - a ABL1-PP boli klonované do plazmidov pSGT, ako bolo opísané vyššie 28 . HA-DDX3X bol klonovaný do plazmidu pIE pomocou klonovacej stratégie Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Protilátka ABL1 (24–21) bola produkovaná interne. Protilátka na detekciu fosfotyrozínových proteínov (4G10) sa pôvodne produkovala interne a nedávno sa kúpila od Millipore (05-777). a-LARP1 (ab86359), a-RBM14 (ab70636), a-tubulín (DM1A) a a-HA-7 (ab49969) boli zakúpené od Abcam (Cambridge, UK), Santa Cruz (Dallas, TX, USA), a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Bunková kultúra a transfekcia

Bunky HEK293 sa kultivovali v DMEM (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), doplnenom 10% fetálnym teľacím sérom (FCS) (LifeTechologies, Carlsbad, CA, USA), antibiotikami (penicilín, 100 U / ml a streptomycín, 100 μg / mL; GE Healthcare, Chalfont St Giles, Spojené kráľovstvo). Bunky HEK293 sa prechodne transfekovali pomocou Polyfect (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) podľa pokynov poskytnutých výrobcom a zozbierali sa 36 hodín po transfekcii.

Imunopurifikácia a imunoblotovanie

Bunky sa lyžovali v IP-tlmivom roztoku (50 mM Tris-HCl, SIGMA-Aldrich, St.Louis, MO, USA a Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko), pH 7, 5, 150 mM NaCI (Merck KGaA), 5 mM EDTA (SIGMA- Aldrich), 5 mM EGTA (SIGMA-Aldrich), 1% NP-40 (Merck KGaA) doplnený inhibítormi proteázy a fosfatázy (1 mM Na3V04 (SIGMA-Aldrich), koktail inhibítora (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN), USA), 50 mM NaF (SIGMA-Aldrich), 0, 1 mM PMSF (fenylmetánsulfonylfluorid (SIGMA-Aldrich), 0, 005 mg / ml TPCK (tosyl fenylalanylchlórmetylketón) (Sanova Pharma GesmbH, Viedeň, Rakúsko), aby sa získal celý proteín. bunkové extrakty (WCE) Na cytoplazmatickú extrakciu boli bunky pozbierané a lyzované na ľade počas 5 minút v tlmivom roztoku N (300 mM sacharóza, 10 mM HEPES pH 7, 9, 10 mM KCl, 0, 1 mM EDTA, 0, 1 mM EGTA, 1 mM DTT). 0, 75 mM spermidínu, 0, 15 mM spermínu, 0, 1% nonidet P-40, 50 mM NaF, 1 mM Na3 V04, proteázové inhibítory). Výsledný supernatant obsahujúci cytoplazmatickú frakciu bol oddelený od peletovaných jadier a zhromaždené v čerstvej skúmavke. Obsah proteínu sa stanovil pomocou Bradfordovej skúšky (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) s y-globínom (BioRad) ako štandardom.

Na imunoprecipitáciu anti-HA sa guľôčky priamo konjugované s protilátkou HA-7 (Sigma-Aldrich) inkubovali s proteínovými extraktmi počas 2 hodín na rotujúcom kolese pri 4 ° C, premyli sa 3x v IP pufri a naviazaný materiál sa uvaril a eluovala sa v Laemmliho tlmivom roztoku (4 x). Na imunoprecipitáciu endogénneho LARP1 a RBM14 sa 2 mg vopred vyčistených proteínových extraktov inkubovali s 1 μg príslušnej protilátky a inkubovali sa 2 hodiny na kolese pri 4 ° C. Následne sa pridalo 50 μl guličiek sefarózy poteínu G (GE Healthcare) a vzorky sa inkubovali ďalšiu hodinu pri 4 ° C. Guľôčky boli premyté 3x v IP-tlmivom roztoku, resuspendované v Laemmliho tlmivom roztoku a varené 5 minút pri 95 ° C, aby sa eluoval naviazaný materiál.

Proteíny boli podrobené elektroforéze pomocou SDS-PAGE a prenesené na nitrocelulózové membrány (GE-Healthcare, Chalfont St Giles, Buckinghamshire, UK). Po blokovaní 5% mliekom alebo 3% BSA sa membrány inkubovali počas 2 hodín pri teplote miestnosti alebo cez noc pri 4 ° C s vybranými protilátkami. Proteínové signály sa vizualizovali prostredníctvom sekundárnych protilátok konjugovaných s enzýmom HRP (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA) a vizualizovali sa pomocou detekčného činidla imunoblottingu ECL (GE Healthcare). Alternatívne sa použili sekundárne protilátky konjugované s IRdye (Rockland Immunochemicals Inc., Limerick, PA, USA) a signály sa detegovali pomocou infračerveného zobrazovacieho systému Odyssey (LI-COR, Lincoln, NE, USA).

Príprava cytosolických frakcií ošetrených FSBA

Približne 30 mg cytosolovej frakcie sa nechalo rozmraziť na ľade a pôsobilo sa na ňu pri koncentrácii 10 mg / ml 5 '- [p- (fluórsulfonyl) benzoyl] adenozínu (FSBA) v DMSO v konečnej koncentrácii 1 mM FSBA a 3% DMSO. počas 1 hodiny pri 30 ° C za jemného trepania pri 300 ot./min. Zbytkové reaktívne činidlo FSBA a zlúčeniny s nízkou molekulovou hmotnosťou, ako napríklad endogénny ATP, sa odstránili ultracentrifugáciou s 15 ml 10 K 10CO MWCO Amicon Ultra-4 odstredivé filtračné jednotky (Merck KGaA) pri 4 000 x g pri RT. Proteíny boli premyté 4 x pôvodného objemu IP-tlmivým roztokom, opätovne rozpustené v 0, 5 ml IP-tlmivom roztoku, zmiešané do čerstvej skúmavky, zmiešané s 2 x kinázovým tlmivým roztokom (80 mM Tris-HCI, pH 7, 5, 50 mM MgCl2 (SIGMA- Aldrich), 2 mM DTT (SIGMA-Aldrich), 2 mM Na3V04, 50 mM NaF) a uchovávajú sa na ľade.

Imunopurifikácia a stanovenie kinázy

Na kinázový test sa proteíny ABL1 imunoprecipitovali v pomere 3, 5 μl ABL1 protilátky na 0, 8 mg extraktu z celých buniek a 65 μl suspenzie guľôčok G-sefarózy (GE-Healthcare). Pre každú kinázovú reakciu s 5 mg FSBA-ošetrenej a odsolenej frakcie bunkových proteínov bol pripravený ekvivalent ABL1-Kin - a ABL1-PP imunopurifikovaný z 3, 2 mg celkového lyzátu buniek HEK293. Guľôčky boli premyté 2 x IP pufrom a 1 x KA pufrom (40 mM Tris-HCI, pH 7, 5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT), spojené a resuspendované v KA pufri. Guľôčky boli rovnomerne rozdelené do eppendorfových skúmaviek, bola pridaná 5 mg bunková proteínová frakcia ošetrená FSBA a kinázová reakcia bola zahájená pridaním „ľahkej“ (SIGMA-Aldrich) alebo „ťažkej“ 18O2-ATP (Organisch-Chemisches Institut, UZH, Švajčiarsko) 29 v konečnej koncentrácii 1 mM. Po inkubácii počas 30, 90 a 150 minút pri teplote miestnosti (~ 23 ° C) na rotačnom kolese sa reakcia zastavila pridaním tuhej močoviny na konečnú koncentráciu 8 M. Vzorky sa vírili a uchovávali sa na ľade.

Tryptické štiepenie a čistenie peptidov

Denaturované vzorky proteínov boli redukované (10 mM DTT), alkylované (55 mM jódacetamid, IA), zvyškové IA zhášané (5 mM DTT) a vzorky boli nariedené tlmivým roztokom trietylamónium-bikarbonát (TEAB) pH 8 na konečnú koncentráciu 4 M močoviny., Vzorky boli štiepené endoproteinázou LysC (1: 400) počas 12 hodín pri 37 ° C a následne tryptickým štiepením (1:50) počas ďalších 24 hodín pri 37 ° C po ďalšom zriedení močoviny na 1, 5 M. Trávenie bolo ukončené 30 ml. % TFA a akákoľvek zrazenina bola odstránená odstredením pri 14 000 ot / min počas 10 minút pri 4 ° C. Okyslené peptidy boli purifikované extrakciou v tuhej fáze pomocou Sep-Pak klasickej C18 náplne (Waters, Milford, MA, USA). Peptidy boli postupne eluované zvyšujúcim sa percentom acetonitrilu v 0, 1% TFA až do 50% a spojené eluáty boli rýchlo zmrazené v tekutom dusíku. Organické rozpúšťadlo sa odstránilo lyofilizáciou a peptidy sa opätovne rozpustili v IP-pufri (100 mM Tris-HCI, pH 7, 4, 0, 3% NP-40) pri približne 3, 5 mg / ml. Nerozpustné látky sa odstránili odstredením pri 14 000 ot./min. Pred a-fosfotyrozínom IP.

Obohatenie fosfotyrozínom, TMT 6-plex značenie a IMAC obohatenie

Perličky s rýchlym tokom proteínov G sefaróza (GE Healthcare) boli konjugované s rovnakými množstvami (12 μg / 60 μl suspenzie) anti-fosfotyrozínových protilátok P-Tyr-100 (Cell-Signaling Technologies Inc., Denvers, MA, USA), 4G10 (Millipore, Billerica, MA, USA) a PT66 (SIGMA-Aldrich). Premyté guľôčky boli rovnomerne rozdelené do šiestich skúmaviek Eppendorf a inkubované so vzorkami resolubilizovaného peptidu najmenej 12 hodín na rotačnom kolese pri 4 ° C. Guľôčky boli premyté 1 x IP tlmivým roztokom s NP40 a bez NP40, raz 10 mM Tris-HCI, pH 7, 4, a potom boli eluované fosfotyrozínové peptidy 2 x 70 ul 5% kyseliny mravčej. Organické rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuovom koncentrátore pri 45 ° C, dokiaľ nezostali -2–4 μL a peptidy sa znova pufrovali na 500 mM TEAB pH 8. Značenie TMT 6-plex sa uskutočňovalo podľa pokynov výrobcu s výnimkou že peptidy boli rozpustené v polovici odporúčaného vodného tlmivého roztoku. Značiaca reakcia sa zastavila po 90 minútach pridaním 8 ul hydroxylamínového roztoku. Značené vzorky sa spojili a organické rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuovom koncentrátore. Okyslené peptidy sa čistili pomocou extrakčných špičiek na pevnej fáze obsahujúcich materiál POROS10R2 s reverznou fázou (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Premyté peptidy boli eluované 80% acetonitrilom obsahujúcim 0, 1% TFA priamo na čerstvo pripravený materiál na afinitnú chromatografiu s imobilizovaným kovom (IMAC) podľa Ficarro et al . 17 . Premyté fosfopeptidy boli eluované z materiálu IMAC pomocou 1, 4% roztoku amoniaku obsahujúceho 1, 5 mM kyseliny etyléndiamíntetraoctovej (EDTA). Rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuovom koncentrátore, kým nezostalo asi 2 až 4 μl a potom sa resuspendoval v celkom 9–20 μL 5% kyseliny mravčej na analýzu pomocou LCMS.

Kvapalinová chromatografická hmotnostná spektrometria

Fosfotyrozínové peptidy obohatené z kinázových testov s použitím „ľahkého“ ATP sa analyzovali na hmotnostnom spektrometri Orbitrap Velos s hybridným lineárnym zachytením (LTQ) a pomocou „ťažkého“ ATP na prístroji Q-Exactive (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) s použitím verzie Xcalibur. 2.1.0.1160 a 3.0.63. Peptidy boli separované konfiguráciou s dvoma stĺpcami (pred a analyticky) buď na systéme Agilent 1200 HPLC nanoflow (Agilent Biotechnologies, Palo Alto, CA), alebo na systéme DIONEX Ultimate 3000 nanoflow (ThermoFisher Scientific) pomocou zdroja nanoelektrosprejových iónov s použitím kvapaliny križovatka (Proxeon, Odense, Dánsko). Rozpúšťadlá na separáciu LCMS naštiepených vzoriek boli nasledujúce: rozpúšťadlo A pozostávalo z 0, 4% kyseliny mravčej vo vode a rozpúšťadlo B sa skladalo z 0, 4% kyseliny mravčej v 70% metanole a 20% izopropanolu. Z termostatizovaného mikroautosampleru sa 8 μl zmesi tryptického peptidu automaticky naplnilo do lapacej kolóny (Zorbax 300SB-C18 5 um, 5 x 0, 3 mm, Agilent Biotechnologies, Palo Alto, CA) pri prietokovej rýchlosti 20 ul / min. 0, 1% TFA sa použilo na naplnenie a premytie pred-kolóny. After washing, the peptides were eluted by back-flushing onto a 18 cm fused silica analytical column with an inner diameter of 50 μm packed with C18 reversed phase material (ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 μm, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Germany). The peptides were eluted from the analytical column with a 27 minute gradient ranging from 3 to 30 percent solvent B, followed by a 25 minute gradient from 30 to 70 percent solvent B and, finally, a 7 minute gradient from 70 to 100 percent solvent B at a constant flow rate of 100 nL/min. For the analysis of the cytosolic proteome, approximately 400 μg of a tryptic digest of the cytosolic fraction was separated into 20 fractions by RP-HPLC at pH10 on an Agilent 1200 HPLC system (Agilent Biotechnologies) prior to the analysis by nano-LCMS. Fractions were acidified and solvent removed in a vacuum concentrator at 45 °C until ∼ 2–4 μL remained. Samples were reconstituted in 5% formic acid and analysed as duplicates on a DIONEX Ultimate 3000 nanoflow system coupled to a Q-Exactive mass spectrometer (ThermoFisher Scientific).

The analysis was performed in a data-dependent acquisition mode using a top 10 method for both instruments. Instrument settings for the LTQ Orbitrap Velos were as follows: precursor ions were fragmented by a hybrid collision-induced dissociation (CID) followed by higher-energy collisional dissociation (HCD). Maximal ion accumulation times were 50 and 250 ms, with target values of 5, 000 and 200, 000 ions for the LTQ and the C-trap, respectively. FTMS scans were performed at a resolution of 60, 000 and 7, 500 for MS 1 and MS 2, respectively. For the Q-Exactive, the maximal ion accumulation time was 250 ms, with target values of 3 × 10 6 ions for MS scans at a resolution of 70, 000 and 50, 000 ions for MS 2 scans at a resolution of 35, 000. Dynamic exclusion for selected ions was 60 s. A single lock mass correction at m/z 445.12003 was employed 30 . The threshold for switching from MS to MSMS for the Orbitrap Velos was 5, 000 counts and normalised collision energy (NCE) was 35% and 40% for CID and HCD, respectively. For the Q-Exactive, MS 2 scans were triggered at a 1% underfill ratio (~2, 000 counts) with an NCE of either 25% or 28% for unlabelled or TMT-labelled samples, respectively.

Analýza dát

Acquired raw data files were processed using the Proteome Discoverer 1.4.0.288 platform and utilising Mascot (v2.3.02, MatrixScience, London, UK) and Sequest HT database search engines and Percolator validation software node (V2.04) to remove false positives with a false discovery rate (FDR) of 1% under strict conditions. In addition, the phosphoRS 3.0 node was used to validate peptide phosphorylation and assignment of normal 'light' phosphorylated sites. For 'heavy' phosphorylated sites or Sequest HT search results this computational tool is not available. Searches were performed with full tryptic digestion against the human SwissProt database v2014.03_20140331 (40, 055 sequences including isoforms obtained from varsplic.pl 31 and appended known contaminants) with up to two miscleavage sites. Oxidation (+15.9949 Da) of methionine and phosphorylation (+79.9963 Da) of serine, threonine and tyrosine were set as variable modifications, whilst carbamidomethylation (+57.0214 Da) of cysteine residues and TMT 6-plex labelling of peptide N-termini and lysine residues were set as fixed modifications. For data sets containing 'heavy' pY-sites, a modification of 18 O 2 -phosphorylation (+83.9880 Da) was chosen as a variable modification on tyrosine residues in addition to normal phosphorylation. Orbitrap Velos data were searched with mass tolerances of ±10 ppm and 0.6/0.1 Da on the precursor and fragment ions (CID/HCD), respectively. Q-Exactive data were searched with mass tolerances of ±20 ppm and 0.045 Da on the precursor and fragment ions (HCD only), respectively. Results were filtered to include peptide spectrum matches (PSMs) with Mascot ion scores of ≥17, Sequest HT cross-correlation factor (Xcorr) scores of ≥1.7 and medium and high peptide confidence. Lower peptide thresholds and medium peptide confidence settings were chosen to apply less stringent settings for the candidate list before manual curation. For the 'light' phosphorylations on serine, threonine and tyrosine residues, phosphoRS 3.0 was used to compute probability values and all peptides with scores >70 were included except ambiguous phosphorylation site assignments. For all 'heavy' pY-peptides, MS 2 spectra were manually inspected and excluded from the final list if: (i) any ambiguity persisted; (ii) no phosphotyrosine was present; (iii) precursor ion isolation was compromised by contaminating co-eluting isobaric peptide ions; (iv) no phosphotyrosine containing b - or y -fragment ions were detected; (v) no phosphotyrosine-specific immonium ions were detected; or (vi) no 'heavy' phosphotyrosine-specific immonium ion was detected. TMT-reporter ion intensities were extracted with a centroid mass tolerance of 80 ppm that was determined from the smallest delta mass deviation from theoretical. Raw TMT intensity values were either used to determine peptide ratios; or were normalised to the most intense reporter ion and subsequently used to generate scatter plots and kinetic rate values (see supplementary material). Unless otherwise stated, the mean value and the respective standard deviation was calculated for multiple spectra of identical PSMs. Further data processing was achieved with R Studio (v0.98.1091), GraphPad Prism (v6.01) and Windows Office Excel (v2013).

Dostupnosť údajov

The mass spectrometry data have been deposited to the ProteomeXchange Consortium with the identifier PXD002133 and can be accessed via the user name, ; and the password, 6ZiwAkNn.

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplnková informácia

Komentáre

Odoslaním komentára súhlasíte s tým, že budete dodržiavať naše zmluvné podmienky a pokyny pre komunitu. Ak zistíte, že je niečo urážlivé alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte ho ako nevhodné.