Vysoko kontrastná mikroštruktúrna vizualizácia prírodných acelulárnych matíc pomocou fázovej röntgenovej tomografie | vedecké správy

Vysoko kontrastná mikroštruktúrna vizualizácia prírodných acelulárnych matíc pomocou fázovej röntgenovej tomografie | vedecké správy

Anonim

predmety

  • Aplikovaná fyzika
  • tkaniva

abstraktné

Bunkové lešenia získané decellularizáciou sú kľúčovým nástrojom v regeneratívnej medicíne samy osebe a sú hnacou silou vývoja syntetických lešení budúcej generácie, ktoré by sa mohli stať dostupnými na trhu. V tomto rámci je zobrazenie kľúčom k pochopeniu vnútornej štruktúry lešenia, ako aj k ich interakcii s bunkami a inými orgánmi vrátane ideálne po implantácii. Lešenia širokého spektra zložitých orgánov (pažerák, pľúca, pečeň a tenké črevo) sa zobrazili pomocou počítačovej tomografie s kontrastnou fázou röntgenového žiarenia (PC-CT). Kvalita obrazu bola dostatočne vysoká na vizualizáciu mikroarchitektúry lešenia a na detekciu hlavných anatomických znakov, ako je napríklad ezofageálna mukozálna submukózna separácia, pľúcne alveoly a črevné kliny. Tieto výsledky sú dlho žiadaným krokom v oblasti regeneratívnej medicíny; história a skenovacia elektrónová mikroskopia boli doteraz zlatým štandardom pre štúdium štruktúry lešenia. Sú však deštruktívne: preto nie sú vhodné na zobrazovanie lešenia pred transplantáciou a nemajú vyhliadky na použitie po transplantácii. PC-CT je naopak nedeštruktívne, 3D a plne kvantitatívne. Dôležité je, že demonštrujeme nielen dosiahnutie vysokej kvality obrazu v dvoch rôznych synchrotronových zariadeniach, ale aj komerčným röntgenovým zariadením, ktoré túto metódu sprístupňuje každému výskumnému laboratóriu.

úvod

Dopyt po transplantácii orgánov sa v poslednom desaťročí rýchlo zvýšil. Súčasne závažný nedostatok darcov a pravdepodobné odmietnutie transplantovaných orgánov bránia uspokojeniu tohto dopytu. Tkanivové inžinierstvo (TE), vznikajúca subdisciplína regeneratívnej medicíny, ponúka terapeutickú alternatívu. Zameriava sa na vývoj vhodných náhrad tkanív a orgánov z lešení bez buniek, ktoré sú obývané kmeňovými bunkami príjemcu orgánov 1 . Všeobecne je výzvou vytvoriť lešenia, ktoré umožňujú a podporujú rast buniek, čo si vyžaduje biokompatibilitu, vhodný biodegradačný profil a mechanické vlastnosti, komponenty a mikroarchitektúru, ktorá napodobňuje prostredie navrhovaného orgánu. Lešenia sa tradične delia na syntetické materiály a prírodné acelulárne matrice (ACM). Zatiaľ čo syntetické lešenia preukázali značný úspech v predklinických aj klinických aplikáciách jednoduchých orgánov, ako je močový mechúr, močová trubica a priedušnica 2, 3, 4, doteraz našli obmedzené použitie na výrobu komplexnejších modulárnych orgánov, ako je napríklad pečeň. a pľúca. Naopak, ACM majú vysoký potenciál pri výrobe zložitých lešení kvôli svojej vnútornej schopnosti znovu vytvoriť trojrozmernú makro- a mikroarchitektúru každého orgánu 5 . Pochopenie ich interakcie s bunkami používanými na ich opätovnú osídlenie môže poskytnúť kľúčový nástroj pre budúci vývoj zložitejších syntetických lešení: vyžaduje si to vhodnú nedeštruktívnu metódu zobrazovania, ktorá je hlavnou témou článku.

ACM sú získané zo zvieracích alebo ľudských orgánov, ktoré boli ošetrené na odstránenie buniek a imunogénneho materiálu. Pri vhodnom postupe odstránenia buniek sa odstráni bunkový materiál, pričom sa zachovajú mikroarchitektúry tkanív, mechanické vlastnosti, extracelulárna matrica (ECM) a súvisiace rastové faktory. ACM sa však vo všeobecnosti získali s použitím tvrdých chemikálií, ktoré majú tendenciu ničiť ECM, a preto bránia translácii do klinického použitia. Súčasný výskum je zameraný na vývoj „jemných“ stratégií spomalenia, ktoré eliminujú populáciu buniek pri zachovaní mikroarchitektúry a zložiek ECM 6 . Toto je obzvlášť dôležité pre orgány, ktoré majú zložitú štruktúru aj funkčnosť (napr. Pľúca, pečeň, obličky a orgány patriace do gastrointestinálneho traktu), pretože zachovanie mikroarchitektúry je zásadnou požiadavkou na presný rast buniek a prípadnú transplantáciu. Overenie procesu decelularizácie vyžaduje pochopenie toho, či bola zachovaná mikroarchitektúra natívneho tkaniva. Aj keď by sa to dosiahlo vizualizáciou lešenia po decellularizácii, komunite TE v súčasnosti chýba zobrazovacia modalita, ktorá by bola schopná vytvárať obrazy s dostatočne vysokým kontrastom a rozlíšením, pričom by bola nedeštruktívna 7 . Väčšina zavedených zobrazovacích modalít možno použiť iba v obmedzenej miere. MicroCT nedosahuje dostatočný kontrast mäkkých tkanív. Magnetická rezonancia (MRI) sa snaží dosiahnuť požadované priestorové rozlíšenie (ideálne mikrometre) v krátkom čase skenovania. MRI skenery sú navyše nákladné a prístupné je ťažké, zatiaľ čo na zvládnutie vysokej priepustnosti vzoriek by sa vyžadovala vhodná zobrazovacia modalita. Histológia a skenovacia elektrónová mikroskopia (SEM) poskytla užitočné snímky ACM 8 a sú najbežnejšie používanými prostriedkami na overenie metód spomaľovania; vyžadujú si však deštruktívnu prípravu vzoriek. Toto je hlavná nevýhoda vzhľadom na to, že lešenia nie je možné zobraziť pred transplantáciou. Okrem toho sa implantované lešenie nakoniec budú musieť monitorovať in vivo , čo zdôrazňuje naliehavú požiadavku na nedeštruktívne zobrazovanie s vysokým kontrastom a vysokým rozlíšením.

V tomto článku demonštrujeme, že limity zavedených zobrazovacích modalít možno prekonať pomocou počítačovej tomografie s röntgenovým fázovým kontrastom (PC), CT, ktorá bola nedávno skúmanou rádiografickou metódou, ktorá využíva namiesto fázových posunov namiesto útlmových rozdielov generovanie kontrastu 9 . PC-CT bol predtým aplikovaný na vzorky tkanivového inžinierstva 10, 11 ; široká škála vzoriek však ešte nebola braná do úvahy. Prezentujeme obrázky ACM pochádzajúcich z pažeráka, pečene, pľúc a tenkého čreva, pretože tieto orgány sú v súčasnosti predmetom záujmu komunity TE 12, 13, 14, 15 . Zlyhanie týchto orgánov si väčšinou vyžaduje transplantáciu ako definitívnu liečbu a kvôli kritickému nedostatku darcov sa silne spoliehajú na pokroky v regeneratívnej medicíne.

Lešenia boli odvodené pomocou novej, „jemnej“ decellularizačnej metódy nazvanej detergentné enzymatické ošetrenie (DET) a jej variácie 6, 8, 16 . V minulosti kvantifikácia DNA, histológia a SEM ukázali, že DET spoľahlivo zachováva mikroarchitektúru lešenia. Vďaka vysokému rozlíšeniu, silnému kontrastu mäkkých tkanív a odmernej povahe demonštrujeme, že PC-CT umožňuje rovnaké hodnotenie bez akéhokoľvek farbenia alebo deštruktívnej prípravy vzorky. Je to veľmi hodnotný výsledok pre komunitu TE, pretože a) umožňuje ľahké hodnotenie spoľahlivosti procesu decelularizácie ab) umožňuje zobrazovacie lešenia pred transplantáciou, čo znamená, že táto metóda by sa v konečnom dôsledku mohla použiť na kontrolu kvality v regeneratívna medicína. Okrem toho nedeštruktívna povaha a vysoká penetrácia metód zobrazovania röntgenovou fázou môžu v budúcnosti umožniť následné transplantácie po transplantovaných lešeniach in vivo .

Zatiaľ čo väčšina obrázkov sa uskutočňovala pomocou synchrotrónového žiarenia, kľúčovým výsledkom prezentovaným v tomto článku je demonštrácia, že porovnateľná kvalita obrazu sa dosahuje pomocou laboratórneho nastavenia, ktoré umožňuje rýchle a rozsiahle prijatie metódy v rámci komunity TE. Aj keď tu demonštrujeme kvalitu obrazu porovnateľnú s kvalitou získanou pri synchrotrónoch použitím PC-CT systému založeného na osvetlení okrajov, dá sa očakávať podobná kvalita obrazu aj so systémom založeným na mriežke 17, vďaka čomu sú uvedené výsledky ešte všeobecnejšie a prístupnejšie pre širšia komunita.

Materiály a metódy

príprava vzorky

Všetky chirurgické zákroky a chov zvierat sa uskutočňovali v súlade s pokynmi britského ministerstva vnútra podľa zákona o zvieratách (Scientific Procedures) z roku 1986 a boli schválené miestnou etickou komisiou (University College London, UK; licencia projektu: 70/2719).

pažerák

Dospelí novozélandskí králici boli usmrtení podaním predávkovania intravenóznym pentobarbitálnym sodíkom (Sigma, UK). Brucho sa sterilizovalo 70% etanolom a urobil sa stredný rez, aby sa úplne odhalili dutiny brušnej a hrudnej. Pažerák sa zozbieral z krčnej časti do gastroezofágovej križovatky. Pažerák pažeráka bol kanylovaný a premytý fosfátom pufrovaným soľným roztokom obsahujúcim 5% antibiotického antimykotického roztoku (PBS / AA; Sigma, UK). Bola premývaná kontinuálnym dodávaním tekutiny pomocou valčekovej pumpy Masterflex L / S s premenlivou rýchlosťou (Cole-Parmer, UK) pri 1 ml / min. Pažerák sa naplnil detergentno-enzymatickým ošetrením (DET) pozostávajúcim z deionizovanej vody (odpor 18, 2 MU / cm; dH20) pri 4 ° C počas 24 hodín, 4% deoxycholátu sodného (Sigma, UK; SDC) pri teplote miestnosti (RT) počas 4 hodín a 2 000 kU deoxyribonukleázy-I (Sigma, UK; DNáza-I) v 1 M chloridu sodnom (Sigma, UK; NaCl). Proces sa opakoval počas troch cyklov, aby sa zabezpečila dostatočná decelularizácia. Po ošetrení boli konštrukty konzervované pri 4 ° C v PBS / AA. Vzorky sa fixovali v 2, 5% glutaraldehyde (GA) v 0, 1 M fosfátovom pufri a nechali sa 24 hodín pri 4 ° C. Po fixácii GA boli vzorky fixované v 1% Os04 / 0, 1 M fosfátovom pufri (pH 7, 4). Po opláchnutí dH20 sa vzorky dehydratovali v odstupňovanej sérii etanol-voda na 1000% etanolu a kritický bod sa vysušil pomocou C02.

pľúca

Dospelé potkany Sprague-Dawley s hmotnosťou 320 - 350 g sa usmrtili inhaláciou a vykrvácaním CO2. Vykonala sa torakotómia strednej línie, svaly hlavy a krku sa odrezali od stredovej čiary a priedušnica sa rozrezala nad cricoidnú chrupavku. Brzlík sa odstránil a pľúcna artéria sa kanylovala cez pravú predsieň, zaistila stehy, prepláchla sa PBS / AA a previedli sa dolné a horné duté žily. Pľúca sa mobilizovali z kricoidnej chrupavky a oddelili sa od svojich pripútaní k pažeráku a hrudnej dutine. Priedušnica sa kanylovala a prepláchla PBS / AA, aby sa umyl cievny strom a zabránilo koagulácii. Vzorky boli deellularizované prostredníctvom DET s intratracheálnou insufláciou s použitím buď kontinuálnej, alebo prerušovanej inflácie. V kontinuálnej skupine („kontinuálny DET“) bola priedušnica perfundovaná pomocou valčekovej pumpy Masterflex L / S s premenlivou rýchlosťou pri 0, 6 ml / min. Pľúca sa premývali dH20 pri 4 ° C počas 24 hodín, 4% SDC pri teplote miestnosti počas 4 hodín a 2 000 kU DNázy-I v 1 M NaCl pri teplote miestnosti počas 3 hodín. V intermitentnej skupine („Intermitent DET“) bola priedušnica perfundovaná pomocou injekčnej pumpy. Po simulácii vdychovacieho cyklu bola každá insuflácia injekčnej pumpy nasledovaná odobratím infúznej kvapaliny. Štyri po sebe nasledujúce insuflácie (každý trvajúci 30 sekúnd) každého roztoku (dH20, 4% SDC a 2 000 kU DNázy-I v 1 M NaCl) zahŕňali jeden cyklus. Uskutočnilo sa deväť cyklov, aby sa zabezpečilo dostatočné spomalenie. Po ošetrení boli konštrukty konzervované pri 4 ° C v PBS / AA. Vzorky sa fixovali a kritický bod sa sušil rovnakým spôsobom ako vzorky pažeráka (pozri predchádzajúcu podkapitolu). Okrem decelulárnych vzoriek sa pripravila nedelarizovaná kontrolná vzorka („čerstvá“) pľúca.

pečeň

Dospelé potkany Sprague-Dawley s hmotnosťou 320 - 350 g sa usmrtili inhaláciou CO2 a dislokáciou krčka maternice. Brucho sa sterilizovalo 70% etanolom a uskutočnil sa rez v tvare U, aby sa odhalila abdomino-panvová dutina. Boli identifikované brušná dolná vena cava (IVC) a portálna véna (PV) a PV bola kanylovaná pomocou kanyly 24 G (BD, UK), ktorá bola zaistená na mieste hodvábnym stehom 3-0 (Ethicon, UK). Brušná IVC sa blokovala pomocou hodvábnych stehov proximálne k pravej renálnej žile a IVC sa rozrezal. Membrána sa použila ako zadržiavací bod na uvoľnenie celej pečene z podporného tkaniva. Celý postup bol uskutočňovaný so zvláštnou opatrnosťou, aby nedošlo k poškodeniu Glissonovej kapsuly, ktorá obklopuje orgán. Pečeň sa pred deelullarizáciou premyla PBS / AA. Vzorky sa deelullarizovali intraportálnou insufláciou pomocou DET alebo EDTA-DET (enzymatické ošetrenie kyselinou etyléndiamíntetraoctovou detergentom). Na ošetrenie DET bola pečeň pripojená k valcovej pumpe Masterflex L / S s premenlivou rýchlosťou a premývaná dH20 počas 36 hodín pri 4 ° C. Inak, na ošetrenie EDTA-DET bola pečeň pripojená k valcovej pumpe Masterflex L / S s premenlivou rýchlosťou a preplachovaná 2 mM EDTA počas 15 minút a dH20 počas 36 hodín pri 4 ° C. Obe pečene DET a DET-EDTA sa potom preniesli pri teplote miestnosti a premývali sa 4% SDC počas 6 hodín, po čom nasledovala perfúzia 2 000 kU DNázy-I z hovädzieho pankreasu v 1 M NaCl počas 3 hodín. Prietok bol udržiavaný na 4, 5 ml / min pre infúziu dH20 a 6, 5 ​​ml / min pre kroky SDC a DNázy. Po ukončení cyklu decellularizácie boli lešenia pečene perfundované PBS / AA počas 30 minút a uložené v PBS / AA pri 4 ° C. Vzorky sa fixovali a kritický bod sa sušil rovnakým spôsobom ako predtým opísané vzorky. Okrem decelulárnych vzoriek bola pripravená aj nedelarizovaná kontrolná vzorka („čerstvá“) pečeň.

Tenké črevo

Dospelé potkany Sprague-Dawley s hmotnosťou 320 - 350 g sa usmrtili inhaláciou CO2 a dislokáciou krčka maternice. Po usmrtení sa brucho sterilizovalo 70% etanolom a urobil sa stredný rez, aby sa úplne odhalila brušná dutina. Vynikajúca mezenterická artéria (SMA) bola kanylovaná pomocou 27 G kanyly (BD, UK) a prepláchnutá PBS na premytie cievneho stromu a zabránenie koagulácie. Tenké črevo bolo vyrezané a odstránené en bloc z pylorusa do ileocekálnej chlopne a črevný lúmen bol kanylovaný a premytý PBS / AA. Črevný lúmen aj vaskulárny strom boli premyté kontinuálnym dodávaním tekutiny pomocou valčekovej pumpy Masterflex L / S s premenlivou rýchlosťou 1 ml / min. Črevo bolo infundované dH20 pri 4 ° C počas 24 hodín, 4% SDC pri RT po dobu 4 hodín a 2000 kU DNázy-I v 1 M NaCl pri RT po dobu 3 hodín. Proces sa opakoval až štyri cykly. Po ošetrení boli konštrukty konzervované pri 4 ° C v PBS / AA. Vzorky boli zafixované rovnakým spôsobom, ako bolo opísané vyššie opísané vzorky; v tomto prípade však neboli sušené kritickým bodom. Trubicové črevné lešenia s oboma koncami zviazanými „klobásou“ a priemernou dĺžkou 2 cm boli namočené cez noc v sterilnom 1% penicilíne / streptomycíne (PS) v PBS.

Zobrazovacie metódy

Všetky obrázky sa získali pomocou počítačovej tomografie s röntgenovým fázovým kontrastom (PC), ktorá je schopná poskytnúť objemový obraz s vysokým kontrastom, vysokým rozlíšením bez potreby deštruktívnej prípravy vzorky. Na rozdiel od konvenčných CT (alebo microCT), kde vzniká kontrast z rozdielov útlmu vo vzorke, kontrast v PC-CT pramení z fázového posunu, ktorý x-lúče trpia, keď prechádzajú hmotou 9 . Tento efekt môže byť až o tri rády väčší ako útlm 18, čo vysvetľuje vysoko zvýšený kontrast, ktorý bol pozorovaný pri zobrazovaní pomocou PC pre celý rad biologických vzoriek 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,

PC-CT na báze synchrotrónu

Vzorky pažeráka, pľúc a pečene sa zobrazili s použitím „PC-CT“ na báze propagácie založeného na biomedicínskej lúče (ID17) Európskeho synchrotrónového žiarenia (ESRF; Grenoble, Francúzsko). Schéma spôsobu je znázornená na obrázku 1 (a); obsahuje (kvázi) paralelný synchrotrónový lúč, stupeň rotácie vzorky a pixelovaný detektor. Kľúčovým rozdielom oproti konvenčnému rádiografickému usporiadaniu je zväčšená vzdialenosť medzi vzorkou a detektorom, ktorá v spojení so zdrojom dostatočnej priestorovej koherencie umožňuje vznik interferenčných prúžkov v dôsledku fázového posunu, ktorému x-lúče trpia, keď prechádzajú vzorkou., Použitie vhodných metód získavania fáz umožňuje prevádzať okraje do fázového kontrastu oblasti 26 .

Image

Obrázok v plnej veľkosti

Vzdialenosti od zdroja k vzorke a od objektu k detektoru boli približne 150 ma 3, 45 m. Rozmery polovice maxima (FWHM) plnej šírky zdroja boli horizontálne 123 μm a vertikálne 24 μm . Lúč bol monochromatizovaný kryštálom Laue / Laue kremík (1, 1, 1) s pevným výstupom na energiu 26 keV (AE / E = 0, 02%) a prefiltrovaný pomocou 0, 8 mm uhlíka a 3 mm hliníka. Detektorom bola FReLoN CCD kamera 27 spojená s 47 um hrubou GGG: Eu na scintilátore substrátu GGG, čo viedlo k efektívnej veľkosti pixla 3, 5 x 3, 5 μm2 . CT sken zahŕňal získanie 2000 rovnomerne rozmiestnených projekcií pri 360 ° rotácii vzorky. Expozičný čas bol 2 s na projekciu a celkové trvanie skenovania bolo približne 1, 5 hodiny. Algoritmus na získanie fázy „na jednu vzdialenosť“ podľa Paganin et al. 28 bol použitý na jednotlivé projekcie na premenu fázového kontrastného pruhu na fázový kontrast oblasti, čo si vyžaduje odhad pomeru fázového útlmu (často nazývaného „

Image
-ratio "). Obrázky boli rekonštruované pomocou
Image
- priemery v rozmedzí 350 - 1 000 (presné hodnoty na obrázok sú uvedené v nadpisoch príslušných obrázkov uvedených nižšie); boli určené na základe toho, čo poskytuje najlepšiu kvalitu obrazu. Malo by sa poznamenať, že Paganinov algoritmus môže potenciálne viesť k malej obete v priestorovom rozlíšení, ktorú by bolo možné prekonať použitím sofistikovanejšej metódy získavania fáz 29 . Rekonštrukcia CT sa uskutočňovala s FBP a v móde „polovičnej tomografie“, pretože vzorka sa počas rotácie 30 mierne pohybovala mimo zorného poľa. Obrázky boli spracované pomocou vlastného softvéru ESRF PyHST a analyzované a zobrazené pomocou ImageJ 31 a 3DSlicer.

Vzorky tenkého čreva sa zobrazili pomocou PC-CT zostavy „na báze analyzátora“ implementovanej na lúčovej línii SYRMEP (SYnchrotron Radiation for Medical Physics) synchrotrónu Elettra (Trieste, Taliansko). Schéma spôsobu je znázornená na obrázku 1 (b): obsahuje (kvázi) paralelný synchrotrónový lúč, stupeň rotácie objektu, analyzátor dvojitého kryštálu a pixelovaný detektor. Na rozdiel od „PC-CT“ založeného na propagácii je PC-CT „založený na analyzátore“ citlivý na lom röntgenového žiarenia, ktorý je priamo úmerný prvej derivácii fázového posunu. Rôntgenová refrakcia, tj mikroradiánske alebo submikroradiánske odchýlky od pôvodného smeru šírenia, sa pomocou kryštálového analyzátora prevádza na kontrast obrazu: v súlade so zákonmi Braggovej difrakcie modulátor kryštálu moduluje intenzitu lúča ako funkciu svojho vstupného uhla 32, Kryštál teda spôsobí, že lámané časti lúča dosiahnu detektor so zvýšenou alebo zníženou intenzitou, v závislosti od smeru a veľkosti uhla lomu. To sa prejavuje ako „kontrast okrajov“ na obrázkoch, tj ako tmavé a svetlé okraje na kontúrach a vnútorných črtách vzorky.

Vzdialenosť od zdroja k vzorke, od analyzátora k vzorke a od analyzátora k detektoru bola približne 23 m, 40 cm a 50 cm. Analyzátor kryštálov bol odrezaný z dvoch Si (1, 1, 1) kryštálov a naladený na prvú polovicu sklonu svojej kývacej krivky 33 . Detektorom bola CCD kamera (Photonic Science Ltd) s kužeľovou optikou spojenou so scintilačnou optikou Gd202S, čo viedlo k efektívnej veľkosti pixla 4, 5 x 4, 5 μm2 . Rozmery zdroja FWHM boli 135 μm horizontálne a 80 μm vertikálne. Lúč sa monochromatizoval monochromátorom Si (1, 1, 1) z dvojitého kryštálu na energiu 17 keV (AE / E = 0, 2%). Počas CT skenovania sa získalo 1440 rovnomerne rozmiestnených projekcií pri 360 °. Expozičný čas bol 0, 1 s na projekciu a celkové trvanie skenovania bolo 55 minút. Rekonštrukcia CT sa uskutočňovala pomocou FBP. Pretože sa nepoužil žiadny postup získavania fázy, CT obrázky vykázali okrem „okrajového kontrastu“ útlm v dôsledku lomu vo vzorke. Okrem toho môže byť na obrazoch prítomný určitý fázový kontrast založený na šírení kvôli jednosmernej citlivosti kryštálového analyzátora a nezanedbateľnej šíriacej vzdialenosti (90 cm) medzi vzorkou a detektorom. Obrázky boli spracované pomocou softvérového balíka PITRE 34 a analyzované a zobrazené v ImageJ a OsiriX.

Laboratórne PC-CT

Jeden exemplár pažeráka bol tiež zobrazený s použitím PC-CT zostavy „okrajového osvetlenia“ implementovaného komerčne dostupnou röntgenovou trubicou v laboratóriu radiačnej fyziky na University College London. Aj keď táto implementácia PC-CT bola pôvodne vyvinutá na synchrotrónoch 35, 36, nespolieha sa na koherenciu lúčov 37, 38 ; jeho pracovný princíp teda nie je porušený, ak je implementovaný pomocou röntgenových trubíc s relatívne veľkými ohniskovými bodmi. Schéma spôsobu je znázornená na obrázku 1 (c): obsahuje nekoherentný (kužeľový) lúč, stupeň rotácie objektu, dve dierované masky a pixelovaný detektor. Prvá maska ​​s apertúrou, umiestnená pred vzorkou, rozdeľuje prichádzajúci lúč do súboru jednotlivých lúčov, s postrannou vzdialenosťou medzi lúčmi, ktorá je dostatočná na to, aby boli fyzicky oddelené. Druhá clona masky, umiestnená pred detektorom, vytvára necitlivé oblasti medzi susednými stĺpcami pixlov. Ak je prvá maska ​​mierne zarovnaná s druhou tak, že polovica každého lúča padá na odkrytú časť pixelu a druhá polovica padá na zakrytú (stav „osvetlenie okraja“), dosiahne sa okrem útlm: röntgenové lúče, ktoré sa odchyľujú od svojej dráhy, spôsobujú na pixeli buď zvýšenú alebo zníženú intenzitu, v závislosti od smeru odchýlky 37 . Postup vyhradeného fázového získavania, vyžadujúci dva vstupné obrazy získané za podmienok protisvetelného okraja, umožňuje kvantitatívne extrahovanie kontrastu refrakčnej (tj rozdielovej fázy) 39 .

Vzdialenosť od zdroja k vzorke a detektora od vzorky k detektoru bola 1, 6 ma 0, 4 m. Zostava je vybavená röntgenovou trubicou Rigaku MicroMax 007 HF s rotujúcim terči molybdénu a ohniskom s horizontálnym rozmerom FWHM približne 70 μm . Trubica bola prevádzkovaná pri 35 kV a 25 mA, čo zodpovedá širokému spektru s priemernou energiou približne 18 keV. Detektorom bol plochý panel Hamamatsu C9732DK, pasívny pixel CMOS snímač s maticou 2400 x 2400 pixelov a veľkosťou pixelov 50 × 50 μm2 . Obdobia prvej a druhej clonovej masky (Creatv Microtech) boli 79 μm , respektíve 98 μm , a ich štrbinové otvory boli široké 23 μm a 29 μm . S týmito periódami bol zakrytý každý druhý stĺpec pixelov (konfigurácia „preskočenia riadkov“), čo znižuje účinok krížového hovoru medzi pixelmi 40 . Zorné pole zobrazovacieho systému definované veľkosťou masiek bolo 4, 8 x 4, 8 cm2. CT sken zahŕňal získanie 720 rovnomerne rozmiestnených projekcií nad 360 stupňov. V každom uhle natočenia sa získali dva výstupky za podmienok protiľahlého osvetlenia okrajov 39 . Okrem toho sa v každom uhle vzorka posunula desaťkrát o 7, 9 μm (desatina periódy v prvej maske clony), pri každom posunutí sa získala projekcia a tieto projekcie sa nakoniec rekombinovali. Tento postup, známy ako „rozkladanie“, sa používa na zvýšenie priestorového rozlíšenia v konečnom obrázku 41, 42, čo v tomto prípade robí konečné rozlíšenie laboratórnych snímok porovnateľným s rozlíšením snímok získaných na synchrotrónoch, kde je oveľa menšia. boli použité veľkosti pixlov. Spolieha sa na pozorovanie, že v PC-CT pri osvetlení okrajov je priestorové rozlíšenie nezávislé od veľkosti pixelov 41, čo je dôležitý znak, ktorý sa už využil pri implementáciách tvrdej röntgenovej mikroskopie 43 . Každá projekcia bola získaná s expozičným časom 1, 2 s. Celkový čas vystavenia živému vzorku bol 4, 8 hodiny, avšak celý skenovací postup trval približne 19 hodín, pretože obrazová zostava nebola optimalizovaná na rýchlosť pre túto štúdiu uskutočniteľnosti a nadmerný čas bol strávený na pohyboch motora, čítanie detektora - akvizície mimo a na plochom poli. V optimalizovanom nastavení by sa to výrazne skrátilo. Pokiaľ ide o celkový čas expozície, treba poznamenať, že pre túto vzorku bolo potrebné rozlíšenie omnoho vyššie, ako je rozlíšenie diktované pixelom, a preto sa použilo 10 krokov rozkladu, čo znamená 10-násobok celkovej expozície. Ak je rozlíšenie na úrovni pixelov dostatočné, dá sa očakávať podstatne kratší čas expozície. Chceli by sme tiež zdôrazniť, že celková expozícia by sa mohla znížiť o ďalší faktor dva použitím nedávno zverejneného postupu fázového načítania, ktorý je založený na získaní jedného obrázka iba v každom uhle 44 . Po získaní fázy 39 sa uskutočnila rekonštrukcia CT pomocou FBP. Použila sa špecializovaná funkcia filtrovania, aby sa zohľadnila rozdielna povaha snímok hranového osvetlenia, pričom sa „hranový kontrast“, ktorý je výsledkom lámania, premení na kontrastný fázový kontrast 45 . Na vykonanie spracovania obrazu bola napísaná rutina MATLAB. Obrázky boli analyzované a zobrazené pomocou ImageJ a 3DSlicer.

výsledok

Výsledky sú prezentované a diskutované jednotlivo pre každý orgán (pažerák, pľúca, pečeň a tenké črevo).

pažerák

Králičie pažeráky boli úspešne deelullarizované po troch cykloch DET, ako je zrejmé z histológie a kvantifikácie DNA (údaje nie sú uvedené). Obrázky ezofágového skeletu získané pomocou PC-CT na báze synchrotrónu sú znázornené na obr. 2 (a, b) vo forme priečneho rezu rekonštruovaným objemom a trojrozmerným vykreslením. Zodpovedajúce obrázky získané pomocou PC-CT v laboratóriu sú znázornené na obrázku 2 (c, d). Všetky obrázky odhalili neporušenú mikroarchitektúru lešenia, ktorá umožňuje identifikáciu všetkých vrstiev natívneho tkaniva, konkrétne: sliznice, submukózy, muscularis propria (MP) a adventitídy. V submukóze sa detegovali intaktné krvné cievy a medzi vnútornou kruhovou a vonkajšou pozdĺžnou vrstvou MP sa pozorovalo jasné vymedzenie. Vďaka silnému kontrastu obrazu boli vrstvy ľahko identifikovateľné a rozlíšiteľné, aj keď všetky sú zložené z mäkkého tkaniva s extrémne podobnými vlastnosťami rôntgenového zoslabenia a boli by nerozoznateľné od bežných mikroCT. Mukozálna submukózna separácia (MSS), náhradný marker poškodenia spojeného s decellularizáciou, sa detegovala po celom obvode dlhého segmentu lešenia a ukázala sa ako minimálna. Trojrozmerné vykresľovanie na obrázku 2 (b, d) umožňuje plne volumetrickú analýzu MSS, čo je výhoda oproti histológii a SEM. Malo by sa poznamenať, že kvalita obrázkov na synchrotrónových a laboratórnych obrázkoch je porovnateľná. To je pozoruhodné, ak vezmeme do úvahy, že prvé boli získané vysoko brilantným a koherentným synchrotrónovým žiarením, zatiaľ čo druhé boli získané komerčne dostupnou rôntgenovou trubicou.

Image

Obrázky ukazujú priečne rezy vzoriek [( a, c )] a trojrozmerné pohľady [( b, d )]. Všetky stĺpce stupnice predstavujú 500 um .

Obrázok v plnej veľkosti

pľúca

Pľúca potkanov boli úspešne odfarbené, ako už bolo opísané 16 . Predchádzajúca práca bola zameraná na zistenie, či by DET s nepretržitou alebo prerušovanou infláciou najlepšie udržiavala mikroarchitektúru a zistilo sa, že prerušovaný prístup k inflácii je lepší, ako ukazujú SEM a funkčné analýzy. Syntrotrónové PC-CT zobrazovanie pľúcnych vzoriek podporilo toto zistenie. Obrázky kontrolného čerstvého tkaniva, znázornené na obr. 3 (a, b) vo forme priečneho prierezu a trojrozmerného vykreslenia, vykazujú centrálne umiestnený bronchovaskulárny zväzok a periférnu pevne zabalenú alveolárnu sieť. Obrazy pľúcnych vzoriek, ktoré boli decellularizované pomocou kontinuálneho DET [Obr. 3 (c, d)] znázorňujú ACM, v ktorom bol bronchovaskulárny zväzok zväčšený stenčenými stláčanými stenami a nejasnou architektúrou. Toto je obzvlášť zrejmé pri trojrozmernom vykreslení lešenia [Obr. 3 (d)]. Zmeny v alveolárnej sieti boli tiež výrazné, buď vykazovali atektaktické zmeny, sekundárne ku kompresii alebo zväčšeniu v dôsledku prasknutia alveolárnej kapilárnej membrány a spojenia viacerých alveol. V porovnaní s tým bolo možné pozorovať, že intermitentný DET produkoval ACM, v ktorom sa úplne zachoval bronchovaskulárny zväzok aj alveolárna sieť [Obr. 3 (e, f)].

Image

Obrázky ukazujú priečne rezy vzorkami [( a, c, e )] a trojrozmerné pohľady [( b, d, f )]. Všetky stĺpce stupnice predstavujú 500 um .

Obrázok v plnej veľkosti

pečeň

Predchádzajúca štúdia (predložená Maghsoudlou a kol. ) Bola zameraná na stanovenie účinnosti protokolov DET a EDTA-DET na generovanie ACM z pečene potkana. Výsledkom bolo, že DET poskytuje mikroarchitektúru, ktorá je lepšie zachovaná v porovnaní s EDTA-DET. Toto pozorovanie je potvrdené synchrotrónovými PC-CT snímkami vzoriek pečene [Obr. 4]. Vzorka čerstvej pečene sa skladá z pevnej štruktúry tkaniva, odhaľujúcej šesťuholníkové laloky a niekoľko vetiev centrálnej a portálnej žily [Obr. 4 (a, b)]. Je vidieť, že hlavné cievy sú podobne konzervované v tkanivách decellularizovaných pomocou oboch EDTA-DET [Obr. 4 (c, d)] a DET [Obr. 4 (e, f)]. Zvýšená intenzita lešenia EDTA-DET [Obr. 4 (c)] v porovnaní so skeletom DET [Obr. 4 (e)] naznačuje, že protokol EDTA-DET vytvára hustejšie tkanivo, ako to bolo hlavné zistenie v publikovanej štúdii. Okrem toho skelet EDTA-DET vykazoval oblasti tak hyper-, ako aj hypo-intenzity, zatiaľ čo skelet DET mal homogénne vlastnosti. Toto zistenie nebolo možné oceniť analýzou SEM.

Image

Obrázky ukazujú priečne rezy vzorkami [( a, c, e )] a trojrozmerné pohľady [( b, d, f )]. Všetky stĺpce stupnice predstavujú 500 um .

Obrázok v plnej veľkosti

Tenké črevo

Obrázky acelulárnej matrice tenkého čreva potkana získanej pomocou PC-CT na báze synchrotrónu sú znázornené na obr. 5: priečny rez valcovou vzorkou a trojrozmerné vykreslenie zobrazenej časti orgánu je možné vidieť na obr. 5 (a, b). Aby sa demonštrovala flexibilita prístupu PC-CT k zobrazovaniu decelulárnych lešení, obrazy sa získali s odlišnou implementáciou PC-CT („na báze analyzátora“ namiesto „na báze šírenia“ PC-CT 9 ). Okrem toho „hranový kontrast“, ktorý je spôsobený lomom vo vzorke, nebol prevedený na fázový kontrast oblasti, čo vysvetľuje, prečo je kontrast na obrázku 5 (a) najsilnejší na rozhraniach, kde sa prejavuje ako svetlý a tmavý strapce. Pretože farebná schéma bola vybraná na vytvorenie dojmu kontrastu oblasti, nie je to pri vykreslení objemu zrejmé. Okrem toho sa pre tento experiment mierne upravila príprava vzorky: vzorka sa hydratovala namiesto sušenia kritického bodu.

Image

Všetky stĺpce stupnice predstavujú 500 um .

Obrázok v plnej veľkosti

Predchádzajúce zobrazenie SEM ukázalo, že DET zachováva mikroštruktúru klkov / krypt v vzorkách tenkého čreva 6 . Obrázky PC-CT zobrazené na obrázku 5 potvrdzujú toto pozorovanie v tom zmysle, že prítomnosť klkov v skafolde môže byť jasne ocenená. Krypty, tj malé dutiny medzi klky, však nie sú viditeľné. Je to kvôli nedostatočnému priestorovému rozlíšeniu použitého detektora: zatiaľ čo villi v tenkom čreve myši sú zvyčajne veľkosti desiatok mikrometrov, krypty sú malé ako niekoľko mikrometrov, tj príliš malé na to, aby sa dali rozlíšiť použitým detektorovým pixelom. v tomto prípade. Aby sa preskúmala schopnosť PC-CT riešiť krypty čreva, zobrazovanie ACM v tenkom čreve sa bude opakovať s detektorom s vyšším rozlíšením ako súčasť budúcej práce.

diskusia

Rad čerstvých a decelulárnych orgánov (pažerák, pľúca, pečeň, tenké črevo) pochádzajúcich z králikov a potkanov bol zobrazený pomocou synchrotrónovej a laboratórnej implementácie PC-CT. Všetky obrázky boli veľmi kvalitné, najmä čo sa týka kontrastu a viditeľnosti detailov, do tej miery, že zistenia získané histologicky a SEM mohli byť potvrdené 6, 16 . Bolo možné identifikovať anatomické znaky, ako je napríklad mukozálne-submukózne oddelenie v ezofageálnom skafoldu a heterogenita EDTA-DET pečeňového skafoldu. Mikroarchitektúra domorodého lešenia bola jasne viditeľná na všetkých obrázkoch, čo umožnilo validáciu použitých metód decellularizácie. Skutočnosť, že sa to preukázalo pre celý rad typov tkanív a pre rôzne implementácie PC-CT, demonštruje univerzálnosť metódy a jej spoľahlivosť v rôznych oblastiach TE. Najdôležitejšie je, že skutočnosť, že kvalita obrazu porovnateľná s kvalitou synchrotrónového PC-CT sa získala v štandardnom laboratóriu s použitím výlučne konvenčného röntgenového zariadenia, naznačuje, že PC-CT má nielen schopnosť nahradiť histológiu a SEM za to rozsah aplikácií, ale aj to, že zobrazovanie by sa mohlo vykonávať vo výskumných laboratóriách TE, čo umožňuje vysokú priepustnosť a široké využitie.

Kľúčový rozdiel medzi PC-CT a metódami štandardov zlata, ktoré sa v súčasnosti používajú v komunite TE pri posudzovaní uchovania mikroštruktúry v lešeniach (SEM a histológia), spočíva v tom, že PC-CT je nedeštruktívne, čo z neho robí dlhodobo hľadané riešenie pre zobrazovanie. lešenia pred transplantáciou. To znamená, že PC-CT by sa v konečnom dôsledku mohlo stať nástrojom na rutinnú kontrolu kvality v regeneratívnej medicíne a potenciálne by sa mohlo použiť na monitorovanie správania a funkčnosti lešenia in vivo po transplantácii do živých organizmov, napr. Myší. Pre túto aplikáciu je dôležité, aby bola dodaná dávka žiarenia starostlivo monitorovaná a udržiavaná pod prijateľnými limitmi. V tejto súvislosti je potrebné poznamenať, že v niekoľkých prípadoch sa ukázalo, že zobrazovanie pomocou počítača má nízku dávku schopnosti, ktorá je kompatibilná s predklinickými a klinickými normami 38, 46, 47 .

Nakoniec vnútorná volumetrická povaha PC-CT poskytuje presné pochopenie mikroarchitektúry lešenia v troch rozmeroch. Vyžaduje sa to na rozvoj vedomostí potrebných na výrobu syntetických skafoldov, ktoré by nakoniec mohli nahradiť ACM zložitých orgánov, ako sú orgány skúmané v tejto štúdii. Syntetické lešenia majú tú výhodu, že sú vyrobené človekom, môžu sa vyrábať v polopriemyselnom meradle, a preto sú široko dostupné pre obyvateľstvo.

Ďalšie informácie

Ako citovať tento článok : Hagen, CK et al. Vysoko kontrastná mikroštruktúrna vizualizácia prírodných acelulárnych matíc pomocou fázovej röntgenovej tomografie. Sci. Rep. 5, 18156; doi: 10, 1038 / srep18156 (2015).

Komentáre

Odoslaním komentára súhlasíte s tým, že budete dodržiavať naše zmluvné podmienky a pokyny pre komunitu. Ak zistíte, že je niečo urážlivé alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte ho ako nevhodné.