Oxidom grafénom zosilnená citlivosť prechodového sol-gélu a schopnosť uvoľňovania liečiva nanokompozitu na báze amfifilného kopolyméru | vedecké správy

Oxidom grafénom zosilnená citlivosť prechodového sol-gélu a schopnosť uvoľňovania liečiva nanokompozitu na báze amfifilného kopolyméru | vedecké správy

Anonim

predmety

  • Biomedicínske materiály
  • grafén

abstraktné

Uvádzame výrobu vysoko citlivého nanokompozitu na báze amfifilného kopolyméru, ktorý sa inkorporuje s oxidom grafénu (GO), ktorý vykazoval prechod sol-gélu vyvolaný ultrafialovým žiarením s nízkou intenzitou. Po inkorporácii GO bola pozorovaná necytotoxicita pre kompozitné gély. Obzvlášť zaujímavé boli mikrokanály, ktoré sa spontánne vytvorili v UV géli zabudovanom do GO, ktoré urýchľovali trvalé uvoľňovanie liečiva. Preto sa očakáva, že súčasné kompozity na báze necytotoxických amfifilných kopolymérov na báze vysoko citlivých na UV žiarenie poskytnú zlepšenú fototermálnu terapiu a chemoterapiu prostredníctvom jedinečných fototermálnych vlastností GO, ako aj prostredníctvom účinného pasívneho zacielenia vyplývajúceho z charakteristiky prechodu sol-gélu systém na báze kopolyméru so zlepšenou citlivosťou, ktorý teda sľubuje zlepšenú liečbu pacientov s rakovinou a inými chorobami.

úvod

Pri použití tepelného spracovania bolo preukázané, že mnoho druhov amfifilných blokových polymérov vykazuje správanie pri prechode na sol-gél, ako je to spôsobené agregáciou samoskladaných miciel 1, 2, 3, 4 . Takto vytvorený gél je tiež známy ako termogély, z ktorých väčšina má prechod sol-gélu 5, 6, 7 indukovaný teplotou ľudského tela, ktorý je veľmi užitočný v biomedicínskych oblastiach, napríklad na liečenie rakoviny 8 a dodanie bunkového rastového faktora 9. pre zdravie ľudí. Prostredníctvom jednoduchého intravenózneho podávania je možné východiskový sol naplnený liekmi rýchlo preniesť do gélu na postihnutej časti ľudského tela na in vivo chemoterapiu založenú na nepretržitom uvoľňovaní liečiva; to sa vo veľkej miere využívalo, čo viedlo k dileme. Je preto veľmi žiaduce vyvinúť nové mechanizmy, aby sa vyrábali lepšie materiály na poskytovanie zdokonalených terapií na liečenie pacientov s rakovinou a inými chorobami.

Tento článok prvýkrát skúma uskutočniteľnosť použitia oxidu grafénového (GO), obľúbeného uhlíkového materiálu v rôznych vedeckých disciplínach vrátane biomedicíny 7, 10, 11, 12, 13, 14 atď. Na výrobu amfifilného kopolyméru, poly (etylénu) glykol) metyléter (mPEG) -poly (ε-kaprolaktón) (PCL) -mPEG, vysoko citlivý na UV svetlo, čo vedie k vytvoreniu nového inteligentného nanokompozitného materiálu sľubným potenciálnym biomedicínskym aplikáciám. V skutočnosti sa v mnohých správach diskutovalo o tom, že GO a jeho znížené náprotivky, konkrétne redukovaný oxid grafénu (rGO), sa môžu použiť ako absorbér svetla v blízkej infračervenej oblasti (NIR) na neinvazívnu fototermálnu terapiu, ako je napríklad ablácia nádoru in vivo , na základe pozoruhodných fototermálnych vlastností GO alebo rGO 15, 16, 17, 18. GO, rGO alebo ich modifikované deriváty (ako je PEG-funkcionalizovaný grafén) sú však normálne v sol stave pred aj po intravenóznom podaní, čo s najväčšou pravdepodobnosťou vedie k nízkej účinnosti podávania a dokonca by mohlo vyvolať vedľajší účinok k normálu. bunky, najmä s ohľadom na to, že niektoré materiály vykazovali iba obmedzené pasívne vychytávanie nádoru v neprítomnosti cieľového ligandu 19 . Tu uvádzame nový koncept, o ktorom sa predpokladá, že dosiahne účinné pasívne zacielenie prostredníctvom zlepšeného prechodu sol-gélu založeného na chemii amfifilného kopolyméru a grafénu, napr . Východiskový sol sa po injekcii do cieľového miesta nádoru môže rýchlo zmeniť na imobilizovaný gél. Na základe veľkej špecifickej povrchovej plochy GO a vynikajúcej optickej absorpcie a fototermálnej konverzie 15 sa očakáva, že koncepcia dosiahne zlepšenú fototermálnu terapiu a chemoterapiu, napr. Zvýšenie kapacity naplnenia liečivom a zvýšenie tvorby tepla. Po zapuzdrení do polymérnych matríc sa preukázalo, že GO má nízku toxicitu a vysokú biokompatibilitu 10 .

Obzvlášť zaujímavé je, že začlenenie GO by mohlo prepožičať zvýšenú citlivosť prechodového sol-gélu na amfifilický kopolymér mPEG-PCL-mPEG, v tomto prípade citlivosť na UV svetlo s nízkou intenzitou (takto vytvorený gél je označený ako UV-gél, a tie s nižším a vyšším obsahom GO sa ďalej označujú ako 0, 2 GO a 2, 0 GO), zatiaľ čo pri našom čistom kopolymérovom systéme sa za rovnakých UV podmienok nemohol pozorovať prechod sol-gélu. Mnoho štúdií sa zameralo na použitie svetla NIR na fototermálnu terapiu tým, že na väčšine objektov (najmä na grafénových materiáloch vykazujúcich silnú absorpciu svetla NIR) môže byť výsledkom vlnovej rezonancie 10, 20, 21 značný tepelný účinok svetla NIR. Naproti tomu UV svetlo má obmedzený tepelný účinok napriek svojim jedinečným chemickým účinkom, ako je fluorescencia a dezinfekcia. Preto je významným nálezom, že GO je schopný vybaviť amfifilný kopolymér prechodom sol-gél pod UV svetlom (365 nm) pri nízkej intenzite (0, 8 mW / cm2). To tiež znamená, že GO poskytuje významne vysokú citlivosť na amfifilný kopolymér, pokiaľ ide o získanie prechodu na sol-gél.

Bolo publikované, že technológie na dodávanie liečiv založené na nanokanáloch alebo mikrokanáloch predstavujú bezprecedentnú príležitosť regulovať kinetiku uvoľňovania liečiva v dodávacích zariadeniach 22 . Mikrokanály boli tiež vytvorené úmyselne a používajú sa na dodávanie liečiv 22, 23, 24 . Mikrokanály sa tu vytvárali spontánne v UV-géli, čo bolo indukované usmerňujúcim účinkom GO, čo by mohlo UV žiareniu prepožičať zníženú difúznu bariéru, a teda zvýšenú rýchlosť uvoľňovania liečiva; to je výhoda oproti tradičnému nosiču liečiva (vo väčšine prípadov rGO) s biokompatibilnými spojovacími polymérmi, napr. PEG 25 a glukóza 26, ktoré sú difúznymi bariérami 27 . Výsledkom je, že tu uvedená práca otvára cestu na výrobu novo štruktúrovaných kompozitných materiálov na báze blokových kopolymérov s mikrokanálami pomocou grafénovej chémie. Táto štúdia tiež objasní výrobu nanokompozitov na báze kopolyméru, ktoré sa začleňujú do uhlíkových nanomateriálov citlivých na svetlo alebo kovových nanočastíc na zvýšenie fototermálnej terapie a chemoterapie.

výsledok

Obrázok 1 ilustruje výrobu kompozitov na báze amfifilných kopolymérov citlivých na UV žiarenie s GO ako senzibilizátorom UV svetla. Z fotografií a schematických diagramov je možné pozorovať jasný priechod sol-gélu pre kompozitné systémy po súčasnom ožiarení UV žiarením 365 nm pri nízkej intenzite (0, 8 mW / cm2) iba 10 minút, zatiaľ čo takéto UV-poháňané Sol-gélový prechod nemôže pre čistý kopolymérny systém prebehnúť z dôvodu obmedzeného tepelného účinku UV svetla na čistý kopolymér bez GO, čo dokazuje fototermálna vykurovacia krivka čistého kopolymérneho vodného roztoku (35% hmotn.) pod súčasným podmienky ožarovania UV s nízkou intenzitou (365 nm) (obrázok S1 doplnkových informácií (SI)). Tiež sme zistili, že je ľahké použiť tak tepelné ošetrenie okolo telesnej teploty, ako aj ožiarenie NIR svetlom, aby sa sol-gélový prechod pre čistý kopolymér a jeho nanokompozity s GO pripisoval tepelnej citlivosti amfifilného kopolyméru ( s prechodom sol-gél pri telesnej teplote, tj okolo 37 ° C 7, ako je ukázané vo fázovom diagrame kopolyméru mPEG-PCL-mPEG; pozri obrázok S2 SI) a so značným tepelným účinkom svetla NIR 28 napr . aj na čistej vode, ako je znázornené na obr. S3 SI. Aj keď štúdie preukázali, že rGO má lepší fototermálny účinok v porovnaní s GO, rGO sa môže ťažko dispergovať vo vodnom roztoku kvôli nedostatku hydrofilných kyslíkových skupín 15, 29, 30 . Bez účinnej úpravy povrchu je rGO pripravený agregovať 31, 32, čím výrazne znižuje jeho výkonnosť v biomedicínskych aplikáciách. V dôsledku toho táto štúdia využíva GO s fascinujúcimi vlastnosťami roztoku na funkcionalizáciu mPEG-PCL-mPEG, ktorý sa môže ľahko dispergovať v polymérnej matrici. Aby sa vylúčila možnosť priameho gélovatenia GO bez zahrnutia kopolyméru, vodná disperzia GO v koncentrácii 2, 0% hmotn. Sa tiež upravovala za rovnakých podmienok UV a pre čistú disperziu GO sa nezaznamenalo žiadne želatínovanie. ako je znázornené na obr. S4 SI. Avšak aj pri takomto ožiarení UV s nízkou intenzitou sa štruktúra GO mierne mení, pokiaľ ide o obnovenie konjugácie π, čo sa overuje miernym červeným posunom typického absorpčného pásma UV / vis pre GO (okolo 231 nm), ako je indexované na π → π * prechod aromatickej uhlíkovej siete (obr. S5, SI) 33 . V skutočnosti bolo hlásené, že intenzívne ožarovanie UV svetlom (~ 1 W / cm2, ktoré je približne o tri magnitúdy vyššie ako v našom prípade) prevádza GO na rGO, o ktorom sa predpokladá, že je vyvolané fotoindukovaným zahrievaním listov GO, a teda vytvorenie vysokoteplotného a reaktívneho prostredia lokalizovaného v listoch a ich bezprostrednom vodnom médiu 34 . Na sondovanie takého reaktívneho prostredia, ktoré by v našom prípade mohlo existovať aj napriek nízkej intenzite UV žiarenia, sa uskutočnila fotodegradácia metylénového (MB) farbiva pomocou GO (obr. S6, SI). Zistili sme, že existujú silné adsorpčné interakcie medzi MB molekulami a GO fóliami, ako je demonštrované na inom mieste 35 a naše výsledky dokazujú, že iba pri adsorpčných interakciách počas 23 hodín s UV vypnutým ( tj za tmy) je typická absorpcia UV / vis pás MB (približne 660 nm) sa do značnej miery rozpadol a posunul sa na približne 670 nm. Naopak, v neprítomnosti GO MB vykazuje dobrú stabilitu proti UV žiareniu. Je zaujímavé, že GO má skutočne fotodegradačný účinok na MB, čo sa dá potvrdiť paralelnými testami (obr. S6, SI); ten, ktorý je vystavený ožiareniu UV svetlom, zodpovedá výslednému MB roztoku s nižšou intenzitou charakteristického UV / vis absorpčného pásma MB. Preto sa domnievame, že súčasné UV žiarenie s nízkou intenzitou tiež umožňuje fotoindukované zahrievanie listov GO (ako je uvedené na obrázku S1 SI), ktoré je výsledkom silnej absorpcie UV žiarenia GO a výnimočnej tepelnej vodivosti a špecifickej tepelnej kapacity 15, ktorý s najväčšou pravdepodobnosťou vytvorí tepelný účinok, ktorý uľahčuje nasledujúci sol-gélový prechod amfifilického kopolyméru mPEG-PCL-mPEG indukovaný UV svetlom.

Image

Zdroj UV svetla: 365 nm, 0, 8 mW / cm2.

Obrázok v plnej veľkosti

Účinná syntéza amfifilného mPEG-PCL-mPEG je potvrdená pomocou ATR-FTIR a1H NMR spektier, ako je znázornené na obr. 2 a 3. Polymerizácia E-CL s otvorením kruhu sa najprv uskutočnila na syntézu medziproduktu mPEG-PCL-OH, ktorý sa potom spojil s HMDI, čím sa vytvoril finálny amfifilný kopolymér. Molekulové štruktúry použité na preukázanie syntézy sú uvedené na obrázku S7 (SI). Pokiaľ ide o e-CL, typická absorpcia FTIR pri ~ 1729 cm1 môže byť indexovaná na laktónovú skupinu. Po polymerizácii s mPEG je možné koncovú skupinu OH mPEG-PCL-OH overiť pomocou absorpcie FTIR okolo 3547, 1100 a 740 cm- 1 priradených vibráciám naťahovanie OH, naťahovanie CO a OH, 32, 36, 37, 38 . Po kondenzácii mPEG-PCL-OH s HMDI NCO skupina (zodpovedajúca absorpcii IR pri 2251 cm- 1 ) HMDI zmizne, sprevádzaná vznikom amidovej skupiny, ako je znázornené na obrázku 2, čo naznačuje efektívnu kopulačnú reakciu a úspešná syntéza mPEG-PCL-mPEG 6, 7 . Aby sa ďalej zistila syntéza, je1H NMR spektrum mPEG-PCL-mPEG uvedené na obrázku 3 spolu s molekulárnou štruktúrou zobrazenou vo vložke. NMR absorpčné línie môžu byť dobre indexované na miesta vyznačené v molekulovej štruktúre.

Image

ATR-FTIR spektrá asyntetizovaného čistého kopolyméru, medziproduktu a surovín zapojených do syntézy.

Obrázok v plnej veľkosti

Image

' H NMR spektrá asyntetizovaného čistého kopolyméru mPEG-PCL-mPEG.

Obrázok v plnej veľkosti

Po potvrdení účinnej syntézy kopolyméru mPEG-PCL-mPEG sme potom vykonali SEM štúdiu mikroštruktúry lyofilizovaného UV-gélu (obr. 4). Na porovnanie bol čistý kopolymérny gél pripravený tiež pomocou gélového prechodu indukovaného telesnou teplotou. Všetky vzorky hydrogélu vykazujú mikroporézne štruktúry. Ukázalo sa, že mikropóry čistého kopolymérového gélu sú rovnomernejšie a majú menšiu veľkosť v porovnaní s mikroporézami kompozitných gélov 0, 2 GO a 2, 0 GO. Je to tak preto, že pripravený GO s veľkou bočnou veľkosťou (v mikroskopickej mierke) silne narušuje agregáciu polymérnych miciel usporiadaným spôsobom. Štrukturálne detaily GO sú prezentované v SI pomocou rôznych charakterizácií vrátane SEM (obr. S8), AFM (obr. S9), XRD (obr. S10) a FTIR (obr. S11), čo je dobrá línia s Štruktúra GO, ako sa uvádza inde, 13, 39, 40 . Kyslíkové skupiny GO listov (obrázky S10 a S11, SI) tiež pravdepodobne interagujú s hydrofilnými blokmi mPEG-PCL-mPEG, čo môže mať narušujúci vplyv na hydrofilnú a hydrofóbnu rovnováhu medzi blokmi mPEG a PCL., napriek skutočnosti, že spektrá FTIR všetkých týchto vzoriek ( tj čistý polymér, 0, 2 GO a 2, 0 GO) sú blízko seba, iba s malým rozdielom ( napr. absorpcia IR pochádzajúca z úsekov NH), ako je znázornené na obr. S12 (SI). Je zvlášť zaujímavé pozorovať mikrokanály v kompozitnom géli s vyššou koncentráciou GO, v tomto prípade 2, 0 GO (obr. 4d, f). Veľká veľkosť listov GO, ako aj existencia hydrofilných aj hydrofóbnych domén na ich povrchu, s najväčšou pravdepodobnosťou umožňuje pripraviť tieto mikrokanály, ako je tiež znázornené štrukturálnym modelom na obrázku 4 (na označenie sa používajú svetlo zelené tieňovanie zvýraznite niektoré mikrokanály). Takéto mikrokanály sú považované za užitočné pre aplikácie s riadeným uvoľňovaním liečiva, pretože ich prítomnosť môže urýchliť trvalé uvoľňovanie liečiva znížením bariéry difúzie liečiva v dôsledku mikrokanálového vodivého účinku 22, 23, 24, 41 .

Image

SEM pozorovanie mikroštruktúr lyofilizovaných vzoriek gélu vrátane čistého termogélu na báze kopolyméru ( a ) a UV-gélov 0, 2 GO ( b, c ) a 2, 0 GO ( d - f ). Zodpovedajúce schematické znázornenie mikroštruktúr lyofilizovaných vzoriek gélu je tiež uvedené na pravej strane so svetlozelenými odtieňmi na zvýraznenie mikrokanálov v nanokompozitnom 2, 0 GO.

Obrázok v plnej veľkosti

DSC sa tiež používa na ďalšiu demonštráciu molekulárnej štruktúry nanokompozitov na báze kopolyméru (obr. 5 a obr. S13 – S15, SI). Všetky vzorky vykazujú dva vrcholy topenia, ktoré možno nájsť na 2. vyhrievacích krivkách DSC druhej (obr. S13 – S15, SI), zatiaľ čo na dvoch termogramoch chladenia 2. druhej DSC (obr. 5) je možné vidieť iba jeden pík kryštalizácie. ). Vzhľad píkov s dvojitou teplotou topenia súvisí s rekryštalizáciou blokov PCL počas procesu zahrievania 42, 43 . Vrcholová teplota kryštalizácie sa postupne zvyšuje z čistého kopolyméru 0, 2 GO na 2, 0 GO (obr. 5 (b)), zatiaľ čo FWHM (obr. 5 (c)) a relatívna kryštalizácia (obr. 5 (d)) ukazujú opak trend. Začlenenie GO môže mať nukleačný účinok na kryštalizáciu časti polymérnych reťazcov okolo listov GO, čo vedie k rýchlejšej kryštalizácii počas chladiaceho procesu DSC. Prítomnosť GO má však tiež rušivý vplyv na celkové pravidelné balenie kopolymérnych reťazcov, čím sa znižuje relatívna kryštalizácia a FWHM výsledných kompozitov. Je rozumné pozorovať, že vyšší obsah GO môže spôsobiť výraznejšie nukleačné a rušivé účinky (obr. 5).

Image

a ) Druhý termostat chladenia pre rôzne vzorky. ( b, c, d ) Porovnanie polohy píku kryštalizácie ( b ) relatívnej kryštalizácie ( c ) a FWHM ( d ) medzi rôznymi vzorkami. Všimnite si, že relatívna kryštalizácia bola vypočítaná ako plocha píku kryštalizácie (jednotka: J / g).

Obrázok v plnej veľkosti

Výkonnosť kontinuálneho uvoľňovania liečiva vo vzorkách hydrogélu bola hodnotená in vitro štúdiou. Ako hydrofilné a hydrofóbne modelové lieky sme použili aloín a kurkumín s výsledkami uvedenými na obrázku 6 (a – d). Na napodobnenie fyziologického pH krvi a kyslého vnútrobunkového prostredia v nádorových bunkách (prisudzovaných metabolickým konečným produktom hromadiacim sa v mikroprostredí nádoru 44 ) sa použili 45, 46 tlmivé roztoky s hodnotou pH 7, 4 a pH 5. Ako aloín, tak kurkumín v troch vzorkách hydrogélu vykazujú typické profily uvoľňovania liečiva, tj počiatočné rýchle uvoľňovanie a potom trvalé uvoľňovanie (ako stopa paraboly počas celej doby uvoľňovania). Za podmienok pH 7, 4 sa vypočítal konečný obsah uvoľňovania aloínu a kurkumínu po 120 hodinách 70 až 85%, respektíve 40 až 65%, ako je to znázornené na obrázku 6 (a, c). V porovnaní s podmienkami pH 7, 4 je možné poznamenať, že rýchlosť uvoľňovania liečiva toho istého nosiča liečiva je vyššia v pufri pH 5 pre obidve liečivá, v tomto prípade aloín (obr. 6 (b)) a kurkumín (obr. 6). 6 (d)). Stĺpce porovnávajúce obsah kumulatívneho uvoľňovania po 24 hodinách uvoľňovania sú tiež znázornené na obr. S16 SI. Predpokladáme, že vyššiu rýchlosť uvoľňovania v kyslom tlmivom roztoku možno podľa literatúry 45, 47, 48, 49 pripísať nasledujúcim bodom: (i) amidové a esterové skupiny kopolyméru mPEG-PCL-mPEG sa stávajú hydrolyzovateľnejšie za kyslých podmienok, čo naznačuje, že micely na báze kopolyméru budú pravdepodobne trochu narušené 47 ; (ii) vyššiu rozpustnosť liečiv v kyslom roztoku 49 ; iii) protonizácia molekúl liečiva v kyslom roztoku by mohla do určitej miery oslabiť ich interakcie s vehikulom liečiva 45 . V dôsledku toho bude taká charakteristika uvoľňovania nášho nosiča liečiva, konkrétne zvýšená rýchlosť uvoľňovania v kyslom prostredí nádorového mikroprostredia, mať veľkú nádej pri zlepšenej liečbe pacientov s malígnym nádorom, rakovinou a inými chorobami.

Image

Výsledky testu kontrolovaného uvoľňovania liečiva pre aloín pri pH 7, 4 ( a ) a pH 5, 0 ( b ) a pre kurkumín pri pH 7, 4 ( c ) a pH 5, 0 ( d ). e ) Schematické znázornenie súčasného prechodu sol-gélu vyvolaného ultrafialovým žiarením a tvorby mikrokanálov v UV géli na báze amfifilného kopolyméru vyplnenom s listami GO, ako aj účinku vodivosti mikrokanálov na urýchlené uvoľňovanie liečiva. Vložka na ľavej strane každého panelu je selektívne zväčšená, aby ukazovala počiatočné správanie pri uvoľňovaní liečiva 10 hodín; na pravej strane je kalibračná krivka zodpovedajúceho liečiva.

Obrázok v plnej veľkosti

Ako sa očakávalo, začlenenie GO vedie k uvoľňovaniu oboch liekov. Čím vyššia je koncentrácia GO, tým vyššia je rýchlosť uvoľňovania liečiva. Toto možno dobre vysvetliť tvorbou mikrokanálov indukovaných GO (potvrdené SEM) 41 . Výsledkom väčšieho množstva GO je generovanie viacerých mikrokanálov, ktoré by mohli hrať vodivú úlohu pri uvoľňovaní liečiva z obmedzujúcej siete hydrogélu, a teda znižovať difúznu bariéru proti molekulám liečiva. Takýto mikrokanálový vodivý účinok na trvalé uvoľňovanie liečiva je tiež schematicky znázornený na obr. 6 (e), spolu so znázornením citlivého prechodu sol-gélu za súčasných UV podmienok s nízkou intenzitou. Tiež sme si všimli, že hydrofóbne liečivo (kurkumín) má najpravdepodobnejšie vyššiu stabilitu v sieťovej štruktúre hydrogélu, čo vedie k nižšej koncentrácii uvoľňovania v porovnaní s prípadom hydrofilného liečiva (aloín) v rovnakom časovom intervale., Aby sme ďalej vysvetlili rozdiel, obraciame sa na diskusiu o štruktúre miciel na báze kopolyméru. Štruktúra jadra a obalu micely vytvorenej vo vodnom roztoku pozostáva z hydrofilných blokov mPEG ako obalu a hydrofóbnych blokov PCL ako jadra. V dôsledku toho by sa hydrofilné liečivo malo lokalizovať okolo obalu, zatiaľ čo hydrofóbne liečivo sa ľahko vtiahne do jadra 50 . Hydrofóbne liečivo sa preto môže lepšie stabilizovať za podmienok vodného pufra.

Cytotoxicita je jednou z najdôležitejších vlastností biomateriálov, ďalej skúmame cytotoxicitu našich pripravených biomateriálov založených na kopolyméroch obsahujúcich GO, napriek tomu, že naše predchádzajúce skúmanie ukázalo, že čistý kopolymér mPEG-PCL-mPEG v podstate ukazuje necytotoxicita 7 . Je tiež uspokojivé zistenie, že inkorporácia GO do kopolyméru môže iba zanedbateľne zmeniť cytotoxicitu kopolyméru na základe kolorimetrických testov na báze tetrazólia (MTT) a laktátdehydrogenázy (LDH). Konkrétne, ako je uvedené na obrázku S17 (a) SI, pozitívna kontrola vykazuje najnižšie percento životaschopnosti buniek, zatiaľ čo negatívna kontrola vykazuje najvyššiu. Tiež si všimnite, že vzorky na báze kopolyméru majú veľmi nízku toxicitu pre bunky, skôr sa podobajú negatívnej kontrole, hoci väčšie množstvo GO môže zvýšiť cytotoxicitu v obmedzenej miere v porovnaní s čistým kopolymérom. Pokiaľ ide o test LDH (obr. S17 (b) SI), vysoké uvoľňovanie LDH je dôsledkom poškodenia bunkovej membrány. Ako sa očakávalo, pozitívna kontrola vykazuje najvyššie uvoľňovanie LDH, vo veľkej zhode s výsledkami testu MTT. Ostatné vzorky, vrátane negatívnej kontroly, čistého kopolyméru, 0, 2 GO a 2, 0 GO, vykazujú veľmi obmedzený účinok na uvoľňovanie LDH napriek skutočnosti, že inkorporácia GO môže poskytnúť kopolyméru iba malé zvýšenie cytotoxicity. Výsledky kombinovaných testov MTT a LDH teda ukazujú, že náš pripravený kopolymér a jeho kompozity s GO sú v podstate necytotoxické.

diskusia

Vysoká citlivosť fyzikálneho gélu na báze kopolyméru naplneného GO, ktorý reaguje na nízkointenzívne UV žiarenie pri 365 nm, možno predpokladať ako nasledujúce aspekty: (1) výnimočné fototermálne vlastnosti GO, ako napríklad silné 365 nm UV absorpčné vlastnosti, prinášajú kopolyméru citlivosť voči UV žiareniu; (2) silné interakcie medzi micelami na báze kopolyméru a listami GO umožňujú efektívne prenos fototermálneho účinku generovaného GO na termosenzitívny kopolymér; (3) Listy GO majú najpravdepodobnejšie premosťujúci účinok na micely, čím urýchľujú agregáciu miciel, a tým aj následnú geláciu, a (4) zavedenie novej sieťovej štruktúry vyrobenej z listov GO do sieťovej štruktúry vytvorenej sieťou GO. micely na báze kopolymérov vysoko senzitizujú želatináciu založenú na agregácii miciel.

Mechanizmus tvorby mikrokanálov indukovaných GO je diskutovaný ako nasledujúce úvahy: (i) veľká povrchová plocha GO je základom mikrokanálov; ii) bohaté funkčné skupiny na povrchoch GO spôsobujú, že listy GO majú silné interakcie s micelami na báze kopolyméru mPEG-PCL-mPEG, čo narúša pravidelné balenie miciel (pravidelné balenie miciel poskytuje jednotné mikropóry takto získaného čistého kopolyméru) Vzorka gélu na báze gélu; pozri obrázok 4); iii) micely na báze kopolyméru sa balia pozdĺž listov GO, čo vedie k tvorbe mikrokanálov. Vzhľadom na zrýchlenie uvoľňovania liečiva, ktoré umožňuje GO, možno vodivý účinok mikrokanálov považovať za hlavný dôvod, ktorý je tiež uvedený v literatúre 22, 23, 24, 41 .

O jedinečných vlastnostiach a výhodách súčasných nanokompozitov na báze amfifilných kopolymérov, ktoré sa pridávajú s GO, sa diskutuje takto: (i) príprava nanokompozitov sa dá ľahko uskutočniť pomocou jednoduchého spôsobu vodného roztoku na základe fascinujúcich vlastností GO; (ii) nízky stupeň inkorporácie GO (v tomto prípade 0, 2% hmotn.) môže vysoko senzitizovať amfifilný kopolymér vzhľadom na dosiahnutie prechodu sol-gélu poháňaného ultrafialovým svetlom s nízkou intenzitou, ktorý sa nedá zrealizovať, ak GO chýba; (iii) zahrnutie GO, dokonca aj pri vysokom obsahu (v tomto prípade 2, 0% hmotn.), má zanedbateľný vplyv na necytotoxicitu kopolyméru (pripravený čistý kopolymér a jeho nanokompozity s GO pri vyššom a nižšie obsahy, v zásade vykazujú necytotoxicitu); (iv) GO môže indukovať tvorbu významných mikrokanálov v kompozitných géloch na báze amfifilného kopolyméru, čo znižuje difúznu bariéru molekúl liečiva, a teda urýchľuje trvalé uvoľňovanie liečiva v dôsledku mikrokanálového vodivého účinku, a (v ) amfifilný kopolymérový systém začlenený do GO vykazuje vysoký potenciál na dosiahnutie zlepšenej fototermálnej terapie a chemoterapie na liečenie pacientov s rakovinou a inými chorobami na základe chémie grafénu (ako sú pozoruhodné fototermálne vlastnosti) a sol-gélu na báze amfifilného kopolyméru. prechod so zvýšenou citlivosťou.

V súhrne sa pripravili vysoko citlivé, necytotoxické nanokompozity na báze mPEG-PCL-mPEG s GO, ktoré vykazujú vysokú citlivosť prechodového sol-gélu na UV svetlo s nízkou intenzitou. Vo vnútri UV-gélu sa tvoria významné mikrokanály, ktoré umožňujú zvýšenie rýchlosti trvalého uvoľňovania liečiva znížením difúznej bariéry pre molekuly liečiva. Táto štúdia pripravuje cestu na výrobu rôznych kompozitov / nanokompozitov na báze amfifilných kopolymérov obsahujúcich rôzne materiály citlivé na svetlo, čo ukazuje potenciál pre zvýšenú fototermálnu terapiu a chemoterapiu v biomedicínskych odboroch.

metódy

materiály

Oxid cínatý (Sn (Oct) 2 ), mPEG (číselná priemerná molárna hmotnosť (Mn) 550), e-kaprolaktón (E-CL), hexametyléndiizokyanát (HMDI), kurkumín a aloín sa kúpili od Sigma-Aldrich a použili sa bez ďalšieho čistenia. Všetky ostatné činidlá boli použité tak, ako boli získané, pokiaľ nie je uvedené inak.

Syntéza čistého kopolyméru mPEG-PCL-mPEG

Typicky sa do reakčnej nádoby v atmosfére suchého dusíka, ktorá sa udržiavala na 130 ° C, pridalo 0, 1 mol e-kaprolaktónu (e-CL), 0, 01 mol mPEG a 0, 3% hmotn. Oktanu cínatého (Sn (Oct) 2 ). ° C počas 12 hodín a potom sa ochladil na 80 ° C. Potom sa pridá 0, 01 mol hexametyléndiizokyanátu (HMDI) a výsledná zmes sa mieša pri teplote 80 ° C počas 3 hodín a potom sa odplyní vo vákuu počas 1 hodiny. Nakoniec sa výsledný kopolymér získal po ochladení na teplotu miestnosti (25 ° C). Vypočítaná priemerná molekulová hmotnosť syntetizovaného kopolyméru mPEG-PCL-mPEG je uvedená v tabuľke SI.

Príprava čistého hydrosolu a termogelu na báze kopolyméru

Asyntetizovaný kopolymér sa pridal do deionizovanej (DI) vody, čím sa vytvoril roztok kopolyméru s koncentráciou 20% hmotnostných. Zmes sa potom mechanicky intenzívne miešala pri 60 - 70 ° C, čo viedlo k vytvoreniu bielej mliečnej viskóznej kvapaliny. Potom bola reakčná nádoba umiestnená do ľadového kúpeľa na ochladenie roztoku polyméru, čím bol získaný konečný priehľadný polymérny sol. Na výrobu termogélu na báze čistého kopolyméru sa pripravený sol tepelne spracoval pri telesnej teplote, aby sa vyvolal prechod sol-gél.

Príprava kompozitných sólov GO-kopolyméru

GO bol pripravený modifikovanou verziou Hummersovej metódy, ako je uvedené inde 32, 39 . Najskôr sa pripravili dve vodné disperzie s koncentráciami GO 0, 2 a 2, 0% hmotn. 1-hodinovým pôsobením ultrazvuku (150 W). Potom bol asyntetizovaný kopolymér pridaný do GO disperzií (hmotnostné pomery GO a kopolyméru boli udržiavané na 0, 2 / 20 a 2, 0 / 20, s koncentráciou kopolyméru fixovanou na 20% hmotn.). Zmes sa potom prudko premiešavala pri 60 - 70 ° C. Potom sa reakčná nádoba vložila do ľadového kúpeľa, aby sa disperzia ochladila, a nakoniec sa získali sóly s rôznou hmotnosťou GO.

Prechod sol-gélu sol-gél pomocou UV žiarenia kompozitných sólov GO-kopolyméru

Takto pripravený kompozitný sol v danom množstve sa umiestnil do sklenenej skúmavky, ktorá sa potom umiestnila do škatule s UV lampou (použitá lampa má ožarovaciu vlnovú dĺžku 365 nm). Intenzita UV svetla dosahujúca povrch solu v sklenenej skúmavke bola detekovaná detektorom intenzity svetla UVA 0, 8 mW / cm2. Po 10 minútach ožarovania sa svetlo vypne a tvorba gélu sa zaznamená metódou invertovania skúmavky. Pripravené kompozitné hydrogély sa označili ako 0, 2 GO (GO / kopolymér: 0, 2 / 20) a 2, 0 GO (GO / kopolymér: 2, 0 / 20). Zodpovedajúce vzorky sušeného gélu sa pripravili lyofilizáciou počas 24 hodín, ktoré sa použili na nasledujúce rôzne merania charakterizácie. Na porovnanie, čistý kopolymérny sol bol tiež ožiarený pod UV svetlom za rovnakých vyššie opísaných podmienok.

charakterizácia

FT-IR spektrá boli zaznamenané na infračervenom spektroskope Perkin Elmer paragon 1000 pomocou režimu zoslabeného úplného odrazu (ATR) so skenovacím rozsahom 4000 - 650 cm -1 . Spektrum 'H NMR bolo zachytené na spektrometri Varian Unity Inova 500 NB NMR použitím CDC13 ako rozpúšťadla. DSC sa uskutočňoval s diferenčným skenovacím kalorimetrom PerkinElmer DSC 8000. Na pozorovanie mikroskopických morfológií hydrogélu čistého blokového kopolyméru a kompozitných hydrogélov 0, 2 GO a 2, 0 GO sa použila skenovacia elektrónová mikroskopia (SEM, TM3000 Tabletop Microscope, Hitachi). Vzorky použité na pozorovanie SEM boli pripravené predbežným zmrazením vlhkých hydrogélov v tekutom dusíku a potom lyofilizáciou počas 24 hodín. Pred pozorovaním SEM bol na lyofilizovaný povrch vzorky nanesený tenký zlatý film. UV / vis spektrá boli zaznamenané na Lambda 18 UV / vis spektrometri. Gelová permeačná chromatografia Waters 1515 (GPC, Waters Co., Milford, USA) sa použila na stanovenie makromolekulovej a makromolekulárnej distribúcie pripraveného kopolyméru mPEG-PCL-mPEG.

Test toxicity na koži in vitro

Toxické účinky vzorky hydrogélu na kožu boli stanovené pomocou testov MTT a LDH, s 5% (hm./obj.) Dodecylsulfonátom sodným ako pozitívnou kontrolou a nespracovanou kožnou vložkou ako negatívnou kontrolou.

Kultúra Epiderm

Na napodobnenie normálnej ľudskej epidermy sa použil komerčne dostupný ľudský epidermálny ekvivalent, ktorým je epiderma (EPI-200, MatTek Corporation, Ashland, MA, USA). Tieto epidermálne kultúry boli zložené z ľudských epidermálnych keratinocytov, ktoré boli kultivované na inzertoch stojacich na bunkových kultúrach (Millipore, Billerica, MA, USA) na rozhraní vzduch-kvapalina, aby vytvorili viacvrstvový a diferencovaný model ľudskej epidermy. Epidermické kultúry sa umiestnili do 6-jamkových doštičiek a potom sa vopred kondicionovali cez noc pri 37 ° C pod 5% CO2. Testované vzorky sa pridali na kožné vložky nasledujúci deň a nechali sa inkubovať 1 hodinu. Potom sa všetky kožné vložky preniesli do čerstvého média na uvoľnenie cytokínov do média na 24 hodín. Médium sa získalo a skladovalo sa pri -80 ° C na stanovenie LDH. Všetky kožné vložky sa potom preniesli na čerstvé doštičky na stanovenie MTT.

Test integrity LDH na bunkovej membráne

Integrita bunkovej membrány (alebo poškodenia buniek) epidermálnych kultúr sa merala kolorimetrickým testom LDH (súprava na detekciu cytotoxicity LDH, Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Japonsko). Tento test meria integritu membrány ako funkciu množstva cytoplazmatického LDH uvoľňovaného do média. Stručne, testovacia zmes bola pripravená zmiešaním jednej časti testovacieho katalyzátora LDH so 45 dávkami roztokov farbiva. For all cultures, the assay mixture was added to the medium in equal proportions. After incubation for 30 min at room temperature under dark conditions, the coloration reaction was stopped with HCl (1.0 M). A plain medium was used as a control in this assay. Absorbance and background correction were performed at 490 nm. The cell membrane integrity was expressed as the ratio of the amount of LDH released (per treatment) to the maximum amount of LDH released from the positive control.

The MTT assay–cell viability test

Skin inserts were transferred to fresh plates with a pre-filled MTT solution (MTT was dissolved in phosphate buffered saline (PBS) at 5 mg/mL and filtered to sterilize and remove a small amount of insoluble residue being present in some batches of MTT) and were allowed to incubate at 37 °C under 5% CO 2 for 3 h. Upon completion of incubation, all MTT solutions were removed. Skin inserts were transferred to fresh plates, and isopropanol was added to each insert for 2 h for extraction of formazan, before transferring to 96 wells plates for the spectrophotometric analysis at 550 nm. Cytotoxicity was expressed as the ratio of cell viability (per treatment) to the maximum cell viability, as calculated from the negative control.

In vitro drug release behavior study

Aloin and curcumin were selected as hydrophilic and hydrophobic model drugs respectively for the controlled drug release study. In the case of hydrophilic drug (aloin), the hydrogels, loaded with aloin (0.1% w/w%), were immersed in a 20 mL PBS (pH 7.4 or pH 5) solution and incubated at 35 ± 2 °C in a shaking water bath at 50 rpm for specific time intervals (1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120 h). The drug release buffer solution was carefully withdrawn and filtered through a filter paper, and the filtrate was analyzed with a UV–vis spectrophotometer. The characteristic UV/vis absorption at λ max = 291 nm was used to monitor the release behavior of the aloin. The accumulated drug release was then calculated. The experiment was performed in triplicate, with the standard deviation calculated as the error bar in the drug release profile. Following a test at a time interval, the obtained filtrate and residue were put back into the sustained drug release solution, so as to keep the drug release system at a steady state. The calculation of the accumulated release is given as the following equation.

Image

where M t is the amount of the drug being released from the hydrogel at the time t, and M 0 is the initial amount of the drug being loaded in the hydrogel.

As for the hydrophobic model drug, namely curcumin, the procedures of the sustained drug release test was described as follows: a given amount of curcumin (0.1% w/w%)-loaded hydrogel was coated onto a glass sheet after the sol-gel transition. Subsequently, the coated glass sheet was immersed into a 20 mL PBS (pH 7.4) solution which was then mechanically stirred at 50 rpm and 35 ± 2 °C. At specific time intervals, namely 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 and 120 h, aliquots were withdrawn with a pipette, followed by filtering through a filter paper. The obtained filtrate was then analyzed by the UV–vis spectrophotometer, and the characteristic UV/vis absorption at λ max = 426 nm was used to monitor the curcumin release behavior. The accumulated drug release was then calculated. The results were presented as the cumulative release as a function of release time, and the experiment was performed in triplicate.

Ďalšie informácie

How to cite this article : Hu, H. et al . Graphene oxide-enhanced sol-gel transition sensitivity and drug release performance of an amphiphilic copolymer-based nanocomposite. Sci. Rep. 6, 31815; doi: 10.1038/srep31815 (2016).

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplnková informácia

Komentáre

Odoslaním komentára súhlasíte s tým, že budete dodržiavať naše zmluvné podmienky a pokyny pre komunitu. Ak zistíte, že je niečo urážlivé alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte ho ako nevhodné.