Formulovaný agonista tlr7 / 8 je flexibilný, vysoko účinný a účinný adjuvant pre vakcíny proti pandemickej chrípke | vedecké správy

Formulovaný agonista tlr7 / 8 je flexibilný, vysoko účinný a účinný adjuvant pre vakcíny proti pandemickej chrípke | vedecké správy

Anonim

predmety

  • pomocné látky
  • Vírus chrípky

abstraktné

Od roku 1997 sa z vtáčích hostiteľov prenášajú na človeka vysoko patogénne vírusy vtáčej chrípky podtypu H5N1. Závažnosť infekcie H5N1 u ľudí, ako aj sporadická povaha ohnísk H5N1, geograficky aj časovo, robia z generovania účinnej vakcíny globálnu prioritu v oblasti verejného zdravia. Účinná vakcína proti H5N1 musí v konečnom dôsledku poskytovať ochranu pred vírusmi z rôznych kmeňov. Formulácie agonistov receptora podobného receptorom (TLR) majú preukázanú schopnosť rozšíriť odpovede na vakcínu H5N1 v predklinických modeloch. Ukázalo sa však, že mnohé z týchto agonistických molekúl sa ťažko klinicky vyvíjajú. Tu opisujeme komplexný vývoj adjuvantnej formulácie imidazochinolínového TLR-7/8 agonistu 3M-052 v kombinácii s H5N1 hemaglutinínovými (HA) antigénmi. Zistili sme, že 3M-052 vo viacerých formuláciách chráni myši aj fretky pred smrteľnou výzvou na homológny vírus H5N1. Ďalej sme presvedčivo demonštrovaní schopnosť adjuvantných formulácií 3M-052 rozširovať reakcie na antigény založené na H5N1 HA a ukazujeme, že toto rozšírenie je funkčné pri použití heterológneho letálneho vírusu vo fretkách. Vzhľadom na rozsiahle klinické použitie agonistov TLR imidazochinolínu na iné indikácie tieto štúdie identifikujú viac pomocných formulácií, ktoré sa môžu rýchlo rozšíriť na klinické skúšky s vakcínou H5N1.

úvod

Od roku 1997 spôsobujú vysoko patogénne vírusy vtáčej chrípky (HPAI) podtypu H5N1 na celom svete sporadické, ale ničivé ohniská. Od objavenia sa v čínskej provincii Guangdong v roku 1996 sa vírus rozšíril po celej Ázii do Európy, Stredného východu a Afriky 1, 2 . Sporadický prenos vírusov H5N1 na ľudskú populáciu z hydiny alebo iného vtáctva vyústil do 846 klinicky potvrdených prípadov a viac ako 449 úmrtí, pričom miera úmrtnosti na tento prípad bola 53% 3 . Zatiaľ čo kmene H5N1 musia ešte preukázať schopnosť účinného prenosu medzi ľuďmi, boli hlásené ojedinelé prípady prenosu v malom meradle na človeka. Okrem toho adaptácia vírusu v laboratóriu ukázala, že tieto vírusy sú schopné prenosu vo vzduchu s malým počtom identifikovaných mutácií 4, 5, 6 . Ak by sa v ľudských populáciách objavil prenosný vírus H5N1, pravdepodobne by nastala ďalšia pandémia. Ak okrem toho prenosný vírus zostáva naďalej veľmi smrteľný, celkový dopad takejto pandémie na verejné zdravie by mohol byť vážny.

Potenciál ťažkej pandémie H5N1 podnietil vývoj niekoľkých vakcín proti H5N1, z ktorých väčšina sa zameriava na vyvolanie funkčných neutralizujúcich protilátok proti vírusovému hemaglutinínu (HA) 7, 8, 9, 10 . Niektorí z týchto kandidátov sa ukázali ako bezpeční v počiatočných fázach klinických skúšok a niektorí boli zahrnutí do zásob pred pandemickou vakcínou, ktoré sa majú nasadiť v prípade objavenia sa pandémie H5N1 11 . Mnoho z týchto antigénov však pri klinickom testovaní 12, 13, 14 indukuje relatívne nízke hladiny funkčnej neutralizačnej protilátky, čo viedlo k testovaniu ďalších formulácií pandemickej vakcíny obsahujúcich pomocné látky 15 . Najbežnejšie používanými pomocnými látkami v klinických vakcínach H5N1 v klinickom štádiu sú kamenec (Alhydrogel, Adju-Phos®) a emulzie oleja vo vode obsahujúce skvalén 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,

Obrázok v plnej veľkosti

výsledok

Formulácia vývoja 3M-052

Štruktúra 3M-052 umožňuje prípravu vo viacerých rôznych platformách na báze lipidov a olejov. Aby sme identifikovali sľubné adjuvantné formulácie pre vakcíny proti pandemickej chrípke, vytvorili sme a charakterizovali množstvo rôznych formulácií 3M-052. Lipozómy na báze 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholínu (DPPC) modifikované aniónovými, katiónovými alebo PEGylovanými fosfolipidmi a neutrálne lipozómy na báze 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholínu (DOPC) boli vyrábané technikou tenkých vrstiev s následným pôsobením ultrazvuku. Lipozómy sa vyrábali pri vysokej koncentrácii 3M-052 1 mg / ml, aby sa zvýraznila akákoľvek tendencia k nekompatibilite s rôznymi lipozómovými kompozíciami. Obsah 3M-052 sa v tomto prípade považuje za „vysoký“, pretože nižšie koncentrácie (napr. 0, 04 mg / ml) sú dostatočné pre dávky 1–2 μg použité v štúdiách in vivo . Aj keď bola zrejmá podstatná variabilita medzi dvoma samostatnými šaržami pre každý lipozóm, PEGylovaný lipozóm a DOPC lipozóm preukázali priesvitný vzhľad a najmenšiu veľkosť častíc a polydisperzitu po sonikácii (tabuľka 1); pre lipozómy je pri tejto koncentrácii žiaduci priesvitný alebo polopriehľadný vzhľad, pretože podľa našich skúseností to vo všeobecnosti naznačuje malú veľkosť častíc a nízku polydisperzitu. PEGylovaný lipozóm bol vybraný na ďalšiu stabilitu a hodnotenie in vivo, hoci DOPC lipozóm zostáva vhodnou alternatívou. PEGylované lipozómy boli negatívne nabité (doplnková tabuľka Tl), najpravdepodobnejšie kvôli skupine aniónových fosfátov DPPE-PEG750. Lipozómy vykazovali malú alebo žiadnu zmenu vo veľkosti častíc počas najmenej 6 mesiacov pri 5 ° C (doplnkový obrázok S1). Vo všeobecnosti nebola zrejmá žiadna strata 3M-052 počas výroby, pretože detegované množstvo 3M-052 vo vyrobenom produkte bolo v súlade s cieľovým množstvom pridaným pred výrobou.

Tabuľka v plnej veľkosti

Formulácie emulzie typu olej vo vode na báze skvalénu (SE) 3M-052 sa vyrábali mikrofluidizáciou, pričom sa vytvorila mliečno-biela nepriehľadná homogénna emulzia obsahujúca kvapôčky s veľkosťou <100 nm s nízkou polydisperzitou (tabuľka 1) a dobrou dlhodobou veľkosťou častíc. stabilita (doplnkový obrázok S1) podobná predchádzajúcim opisom SE alebo iných emulzií skvalénu vo vode 51, 52 . Hodnoty potenciálu zeta emulzie boli mierne negatívne (doplnkový obrázok S1). Je zaujímavé, že emulzie vyrobené s vaječným PC namiesto DMPC viedli k vyššiemu výťažku 3M-052 po spracovaní (doplnková tabuľka T2). Okrem toho pridanie počiatočného kroku zmiešania kombinácie 3M-052 s vaječným PC v chloroforme ďalej zvýšilo regeneráciu 3M-052 v porovnaní so sonikáciou suchého prášku na skvalén / vaječné PC bez chloroformu (doplnková tabuľka T2). Zmeny zloženia emulzie a postupu spracovania mali teda významné účinky na začlenenie 3M-052 do konečnej formulácie (doplnková tabuľka T2). Úplné získanie 3M-052 s použitím optimalizovanej emulznej kompozície a spracovanie bolo obmedzené iba pri vysokej koncentrácii 3M-052 (napr. 0, 8 mg / ml), ale to sa nepovažuje za relevantné, pretože 0, 04 mg / ml 3M-052 bolo dostatočné na podporu 1 Používajú sa tu dávky –2 μg.

Formulovaný 3M-052 v kombinácii s H5N1 HA chráni myši pred smrteľnou výzvou H5N1 po jedinej imunizácii

Po demonštrácii stability 3M-052 adjuvantných formulácií sme skúmali schopnosť tohto agonistu TLR zosilňovať HA špecifické vakcínové reakcie. 3M-052 formulovaný buď v PEGylovaných lipozómoch alebo v emulzii skvalénového oleja vo vode (SE) bol zmiešaný s rekombinantným chrípkovým HA H5N1 proteínom (rH5, kmeň A / Vietnam / 1203/04 [VN1203], Protein Sciences Corp., Meriden CT) a používa sa na imunizáciu skupín myší C57Bl / 6 (N = 20 / skupina) intramuskulárnou cestou. Dvadsaťjeden dní po jedinej imunizácii boli všetky myši intranazálne vystavené 1000 LD50 VN1203. Desať zvierat sa sledovalo 14 dní, aby sa stanovila vírusom vyvolaná chorobnosť meraná stratou hmotnosti a úmrtnosťou. Vo formulácii lipozomálneho adjuvans zabránila 3M-052 vírusom vyvolanú chorobnosť; 100% zvierat dostávajúcich rH5 + 3M-052 / lipozómy prežilo v porovnaní s 50% zvierat dostávajúcich rH5 alebo rH5 v kombinácii s lipozómami samotnými (obr. 2A). Myši imunizované rH5 + 3M-052 / lipozómy nevykazovali žiadne chudnutie, zatiaľ čo zvieratá, ktoré dostávali rH5 s lipozómami alebo bez lipozómov, stratili na váhe 11 dní po expozícii (obr. 2B, doplnkový obrázok S2). Zvieratá, ktoré dostávali formulácie na báze emulzie, vykazovali konzistentné prežitie s 3M-052 aj bez neho (obr. 2A), čo je v súlade so známou účinnosťou emulzií ako adjuvans proti chrípkovej vakcíne. Avšak zvieratá, ktoré dostávali emulzie kombinované s TLR 7/8 agonistami, vykazovali zníženú stratu hmotnosti počas obdobia akútnej infekcie v porovnaní so zvieratami, ktoré dostávali rH5 + SE (obr. 2C, doplnkový obrázok S2). Myši imunizované rH5 a nelipidovaným resekvimodom TLR 7/8 (R848) tiež prežili bez dôkazu úbytku hmotnosti.

Image

Myši (n = 10 / skupina) boli imunizované raz proteínom rHA (A / VN / 1203/04, Protein Sciences) v kombinácii s adjuvans, ako je uvedené. Adjuvantná dávka bola 1 μg R848 alebo 2 μg 3M-052. Dvadsaťjeden dní po imunizácii sa zvieratám intranazálnym spôsobom provokovalo 106 PFU A / VN / 1203/04 (H5N1, Clade 1). Zvieratá boli denne monitorované na prežitie ( A ) a stratu hmotnosti ( B, C ). V prípade straty hmotnosti je uvedená priemerná relatívna telesná hmotnosť v skupine, pričom chybové stĺpce predstavujú 1 štandardnú odchýlku od priemeru. 3 dni ( D ) a 7 dní ( E ) po stimulácii boli myši usmrtené a titre vírusu pľúc boli stanovené plakovým testom. Okrem toho boli intaktné pľúca vážené 7. deň po stimulácii ako miera konsolidácie ( F ) a boli hodnotené na výskyt hrubej patológie ( G ). Významnosť bola stanovená pomocou Mantel-Coxovho log-Rank testu ( A ) alebo jednosmernou ANOVA, s Tukeyovou korekciou pre viacnásobné porovnania ( D - G ) (** p <0, 005, *** p <0, 0005, **** p <0, 0001).

Obrázok v plnej veľkosti

Okrem zvierat sledovaných na prežitie sa 5 zvierat / skupina usmrtilo 4 a 7 dní po stimulácii na meranie patológie vyvolanej chrípkou v pľúcach a na stanovenie titrov vírusových pľúc. 4 dni po stimulácii zvieratá imunizované rH5 + 3M-052 adjuvantnými formuláciami významne znížili titre vírusu pľúc v porovnaní s neimunizovanými kontrolami. Zvieratá imunizované rH5 + 3M-052 / lipozómy nemali v tomto časovom bode žiadny detekovateľný titer vírusu (Obr. 2D). V deň 7 mali zvieratá, ktoré dostali adjuvantné formulácie na báze 3M-052, minimálne vírusové titre relatívne k samotnému rH5. V prípade lipozómov aj formulácií na báze SE viedlo pridanie 3M-052 k významne zníženému titru v porovnaní s rovnakým prípravkom bez TLR (obr. 2E). Okrem znížených vírusových titrov vykazovali zvieratá imunizované adjuvantnými formuláciami rH5 + 3M-052 významne nižšie hmotnosti pľúc (Obr. 2F) a znížené skóre patológie pľúc (Obr. 2G). Zvieratá, ktoré dostávali rH5 a resiquimod (R848), mali v pľúcach podobné vírusové titre ako kontrolné myši, ktoré dostávali iba rH5. Celkovo tieto výsledky ukazujú schopnosť 3M-052 chrániť myši pred klinickými následkami letálnej vtáčej chrípky.

3M-052 pomocné formulácie vyvolávajú rozšírenú protilátkovú reakciu krížového podtypu na H5N1 HA

Predchádzajúce štúdie skúmali schopnosť adjuvantných agonistov TLR zvýšiť šírku protilátkových reakcií indukovaných po imunizácii myší. Výsledky ukázali, že indukcia odozvy CD4 + T-buniek ovplyvnená Thl vedie k zvýšeniu zmeny protilátok v triede a následnému zvýšeniu šírky a ochrannej kapacity 53 . V súlade s predchádzajúcim výskumom pozorujeme indukciu Th1 CD4 T buniek (IFNy + TNFa + IL-2 + ) po imunizácii formulovanými pomocnými látkami 3M-052 (doplnkový obrázok S3). Aby sme sa zamerali na schopnosť adjuvantných formulácií 3M-052 rozšíriť imunitnú reakciu na pre-pandemický antigén, skúmali sme väzbový profil 3M-052 k indukovaným protilátkam pomocou druhej generácie HA proteínového súboru druhej generácie. HA pole použité v tejto štúdii obsahuje 278 jednotlivých HA proteínov, vrátane aspoň jedného zástupcu z HA podtypov 1-18. Skúmali sme schopnosť protilátok IgG1 aj IgG2c viazať sa na pole (obr. 3, doplnkový obrázok S4). Globálne profilovanie protilátkových odpovedí ukázalo zvýšené stredné hodnoty fluorescencie pre IgG2c protilátky v adjuvantných formuláciách obsahujúcich 3M-052 (Obr. 3B). Tieto zvýšenia boli významné (hodnota FDR upravená p-hodnota 1 000 v prítomnosti adjuvantných formulácií (obrázok 3C). Pridanie 3M-052 k SE alebo lipozomálnym formuláciám viedlo k významne zvýšenej intenzite globálneho signálu (hodnota pDR upravená pomocou FDR <0, 05). ) a zvýšenie počtu pozitívnych kmeňov HA. Okrem toho sme prostredníctvom normalizácie údajov zo súboru skúmali špecifickú väzbu protilátok vyvolanú rozdielnymi adjuvantnými formuláciami na kmene H5N1 z rôznych vírusových kmeňov. 3M-052 / lipozóm a Zvieratá imunizované 3M-052 / SE vykazovali zvýšené hladiny IgG2c protilátky, ktorá sa viazala na proteíny z viacerých vírusových kmeňov H5N1 (obr. 4) v porovnaní s rovnakými formuláciami bez 3M-052. Na rozdiel od toho, hladiny väzby IgG1 neboli zvýšené o 3M-052 ( Obrázok 4) Na overenie zistení z HA polí sme stanovili titer koncových bodov protilátky v postimunizačnom myšacom sére pomocou ELISA použitím VN1203 HA ako obalového antigénu (doplnkový obrázok S5). sérová ELISA odrážala tie, ktoré sa pozorovali na HA poli, v súlade s predchádzajúcimi údajmi overujúcimi proteínovú štruktúru na poli 54 .

Image

Myši boli imunizované dvakrát rozdelenou vakcínou H5N1 (SP-H5, A / VN / 1203/04, Sanofi Pasteur) s odstupom 28 dní (D0, D28) v kombinácii s adjuvansmi, ako je uvedené. Adjuvantná dávka bola 1 alebo 2 μg 3M-052 v SE alebo lipozómoch. Séra sa odobrali od myší (n = 7 / skupina) v D63 a analyzovali sa s použitím HA súboru s vysokou hustotou. Protilátky IgG1 a IgG2 subtypu boli simultánne detegované pomocou dvojfarebného mikropolíckeho skenera ( A ). Globálne väzobné profily séra z myší imunizovaných rôznymi adjuvans boli stanovené vynesením stredných hodnôt fluorescencie odčítaných od pozadia pre všetky HA proteíny v rade. Schopnosť 3M-052 významne zvyšovať titer protilátok, indikovaný zvýšením mediánu fluorescencie, bola stanovená porovnaním hladín fluorescencie pozorovaných vo formulácii (SE, Liposomes) s alebo bez 3M-052 a výpočtom korigovaných hodnôt P pre rýchlosť falošných objavov (FDR) pomocou metódy Benjaminiho Hochenberga (hodnota BHp) ( B ). Stanovia sa tiež hodnoty BH p 1000 ( C ). Zahrnutie 3M-052 buď do SE alebo do lipozomálnych formulácií viedlo k zvýšeným úrovniam väzby IgG2c, pričom v lipozomálnych formuláciách 3M-052 sa pozorovalo významné zvýšenie strednej fluorescencie IgG2c. Zahrnutie 3M-052 navyše viedlo k významnému zvýšeniu celkovej priemernej intenzity signálu, ako aj k zvýšeniu počtu pozitívnych škvŕn a kmeňov HA.

Obrázok v plnej veľkosti

Image

Myši boli imunizované dvakrát rozdelenou vakcínou H5N1 (A / VN / 1203/04, Sanofi Pasteur) s odstupom 28 dní (D0, D28) v kombinácii s adjuvansmi, ako je uvedené. Adjuvantná dávka bola 1 alebo 2 μg 3M-052 v SE alebo lipozómoch. Séra sa odobrali od myší pri D63 (n = 7 / skupina) a analyzovali sa pomocou HA poľa s vysokou hustotou. Je ukázaná špecifická väzba protilátok IgG1 a IgG2c na proteíny H5N1 z rôznych klonov. Špecifické úrovne väzby sa určujú normalizáciou údajov zo súboru na stanovenie väzby pre kontrolu nad násobkom kontroly (FOC) pre každý proteín H5N1. Log2 transformované FOC dáta pre SE aj lipozomálne formulácie s alebo bez 3M-052 sú uvedené pre podtypy protilátok IgG1 aj IgG2c s chybovými čiarami, ktoré predstavujú štandardnú chybu týchto priemerov (SEM). Významné zvýšenia špecifickej väzby, ktoré sú výsledkom inklúzie 3M-052, sa určujú výpočtom P-hodnôt korigovaných FDR v Benjamini-Hochenbergu (Q = 5%), pričom hodnoty BH p-vales <0, 05 sa považujú za významné. Význam bol stanovený pre 3M-052-lipozómy v porovnaní s lipozómami (^) a 3M-052-SE v porovnaní s SE (#). Adjuvantné formulácie obsahujúce 3M-052 vykazovali významne vyššiu špecifickú väzbu IgG2c protilátok cez H5N1 clades, zatiaľ čo významné zvýšenie väzby IgG1 sa nezistilo.

Obrázok v plnej veľkosti

Formulované adjuvans 3M-052 zvyšujú ochranu pred výzvou H5N1 vo fretkách po jedinej imunizácii

Vzhľadom na sľubné výsledky na myšiach sme skúmali schopnosť formulovaných pomocných látok na báze 3M-052 chrániť fretky pred expozíciou H5N1. Pred začatím týchto štúdií sme overili, že imidazochinolínová časť 3M-052 by mohla stimulovať receptory TLR fretiek. Pomocou testu stimulácie celej krvi sme overili, že inkubácia s imiquimodom alebo CL057, ktorý má štruktúru podobnú ako 3M-052, by mohla stimulovať produkciu mRNA pre cytokíny a pre receptory (doplnkový obrázok S6). Potom sme skúmali schopnosť adjuvans obsahujúcich 3M-052 chrániť fretky pred smrteľnou expozíciou H5N1 po jednej imunizácii. Pre tieto štúdie sa neutrálne lipozómy a SE adjuvans s 3M-052 a bez neho kombinovali s vakcínou proti vírusu split vírusu H5N1 (Sanofi) odvodeným z VN1203 (SP-H5). Tento antigén bol vybraný, pretože je v súčasnosti zahrnutý do národnej zásoby pandémie pre USA a bol klinicky testovaný v predchádzajúcich štúdiách. Stručne, po štúdii zameranej na dávkovanie samotného antigénu H5N1 (údaje nie sú uvedené) boli skupiny 4–6 fretiek imunizované intramuskulárnou cestou 0, 5 μg SP-H5 zmiešaného s adjuvansmi, ako je uvedené (obrázok 5). Dvadsaťjeden dní po imunizácii sa fretky intranazálne infikovali 106 PFU A / VN / 1203/04 a po dobu 14 dní sa sledovala strata hmotnosti, klinické skóre a prežitie. Ďalej sa nazývalo nosné výplachy v alternatívnych dňoch začínajúcich jeden deň po stimulácii. V jednej štúdii 3M-052 / SE úplne chránili zvieratá pred napadnutím v porovnaní so zvieratami imunizovanými s SP-H5 + SE (obr. 5A). 3M-052 / SE tiež znižovali vírusom indukovanú chorobnosť v porovnaní so samotnou SE; zvieratá imunizované SP-H5 + 3M-052 / SE po stimulácii nestratili žiadnu váhu (obr. 5B, doplnkový obrázok S7) a po infekcii mali iba minimálne klinické skóre (obr. 5C). Podobné výsledky sa pozorovali v druhom experimente po imunizácii zvierat lipozomálnymi adjuvantnými formuláciami. 3M-052 / lipozómy chránili 100% zvierat pred napadnutím (obr. 5E). Podobne ako formulácie na báze SE, zvieratá imunizované SP-H5 + 3M-052 / lipozómy nestratili žiadnu hmotnosť (obr. 5F, doplnkový obrázok S7) a mali zanedbateľné klinické skóre (obr. 5G). Najdôležitejšie je, že skúmanie titrov vírusu pľúc ukazuje, že v SE aj lipozomálnych formuláciách je 3M-052 schopný znížiť vylučovanie vírusu pri výplachu z nosa; zvieratá imunizované s 3M-052 / SE (Obr. 5D) alebo 3M-052 / lipozómy (Obr. 5H), vykazovali významné zníženie hneď 3 dni po stimulácii v porovnaní s inými adjuvans alebo kontrolnými zvieratami. V obidvoch prípadoch sa vírus vymazal na nedetegovateľné hladiny do 5. dňa u všetkých zvierat, ktoré dostali adjuvans 3M-052.

Image

Mužské fretky Fitch (n = 3–4 / skupina) sa imunizovali raz štiepenou vakcínou H5N1 (H5N1, Sanofi Pasteur) v kombinácii s formulovanými adjuvantmi 3M-052 (dávka adjuvans bola 1 alebo 2 μg 3M-052 v SE alebo lipozómoch, a) a provokovali sa 21 dní po imunizácii 106 PFU A / VN / 1203. Zvieratá boli monitorované až 14 dní na stratu hmotnosti prežitia ( A, E ) ( B, F ) a klinické skóre ( C, G ). Okrem toho sa zhromaždili nosné výplachy, aby sa stanovil titer vírusu ( D, H ). Pokiaľ ide o stratu hmotnosti a titer vírusu, body predstavujú aritmetický priemer v skupine, pričom chybové stĺpce predstavujú štandardnú odchýlku priemeru. Ako formulácie 3M-052 / SE, tak 3M-052-lipozomálne adjuvans vykazujú v tomto modeli silnú ochranu pred jednorazovým šokom, ktorá sa vyznačuje rýchlejšou vírusovou clearanciou z výplachu z nosa, znížením hmotnosti a klinickým skóre a 100% prežitím.

Obrázok v plnej veľkosti

Prípravky 3M-052 ako adjuvans vyvolávajú u fretiek neutralizačnú protilátkovú reakciu krížového kladu

Na základe širokej HA-špecifickej protilátkovej odpovede, ktorú pozorujeme u myší, a robustnej ochrany, ktorú sme pozorovali proti homológnemu vírusu vo fretkách, sme priamo skúmali titre neutralizačných protilátok indukované po imunizácii rôznymi adjuvantnými formuláciami s použitím pseudotypizovaného lentivírusového vektora H5N1 HA, ktorý obsahuje Luciferázu. transgén. V stručnosti, sériovo nariedené vzorky séra sa inkubovali s lentivírusovými časticami obsahujúcimi H5N1 HA a NA proteíny na svojom povrchu. Zmes séra a vírusu sa inkubovala na konfluentných monovrstvách buniek MDCK. Po inkubácii, aby sa umožnila expresia luciferázového transgénu zabaleného do vírusu, sa kvantifikáciou génovej expresie luciferázy stanovil neutralizačný potenciál vzoriek séra. V súlade so zvýšeným prežitím pozorovaným v týchto štúdiách, adjuvanty 3M-052 / SE a 3M-052 / lipozómy zvyšovali neutralizačné titre IC90 v sére 21 dní po jednej injekcii. (Obrázok 6A, D). Okrem toho obidve formulácie významne zvýšili neutralizačné titre na vírusy Clade 2; boli pozorované zvýšené titre IC90 na A / Indo / 5/05 [Clade 2.1] a A / Whooper labuť / Mongolia / 244/05 [Clade 2.2] (Obr. 6B – F). Toto zistenie je v súlade so schopnosťou formulovaného 3M-052 indukovať rozšírený titer funkčných neutralizačných protilátok na unášané kmene chrípky.

Image

Mužské fretky Fitch (n = 3–4 / skupina) sa imunizovali raz štiepenou vakcínou H5N1 (SP-H5, Sanofi Pasteur) v kombinácii s formulovanými pomocnými látkami 3M-052. Adjuvantná dávka bola 1 alebo 2 μg 3M-052 v SE alebo lipozómoch. Dvadsaťjeden dní po imunizácii bola od všetkých zvierat odobraná krv a bola testovaná prítomnosť protilátok neutralizujúcich vírus pomocou testu neutralizácie pseudotypu retrovírusu. Zahrnutie 3M-052 do adjuvantných formulácií viedlo k významnému (jednosmernému ANOVA) zvýšeniu neutralizačného titra proti homológnemu vírusu Clade 1 ( A, D ), ako aj proti kmeňu vírusu Clade 2 ( B, E ) a kmeňu Clade 2.2. ( C, F ).

Obrázok v plnej veľkosti

3M-052 / SE vyvoláva ochrannú reakciu krížového kladenia

Vzhľadom na neutralizačné titre, ktoré pozorujeme na labute A / Whooper / Mongolia / 244/05 po imunizácii antigénmi VN1203, sme skúmali schopnosť formulovaného 3M-052 znižovať replikáciu vírusu v pľúcach po vakcinácii antigénom VN1203. Rovnako ako v predchádzajúcich štúdiách sa fretky imunizovali jedenkrát SP-H5 kombinovaným s formulovaným 3M-052 a o 21 dní neskôr sa infikovali 5 x 105 PFU vírusu. Zvieratá, ktoré dostávali 3M-052 / lipozómy, vykazovali v priebehu času mierny pokles vylučovania vírusu; Zvieratá, ktoré dostávali 3M-052 / lipozómy, nemali detegovateľný vírus 5 dní po stimulácii, zatiaľ čo iné zvieratá, ktoré dostávali lipozómy alebo samotný antigén, mali v tomto okamihu detegovateľný vírus (obr. 7B). Naopak, zvieratá, ktoré dostali 3M-052 / SE, rýchlo vyčistili vírus bez detekovateľných plakov od 3 dní po stimulácii, zatiaľ čo zvieratá, ktoré dostávali SP-H5 + SE, vykazovali detekovateľné titre vírusu do 5. dňa (obr. 7A).

Image

Mužské fretky Fitch (n = 6 / skupina) sa imunizovali raz štiepenou vakcínou H5N1 (H5N1, Sanofi Pasteur) v kombinácii s formulovanými pomocnými látkami 3M-052 (dávka adjuvans bola 1 alebo 2 μg 3M-052 v SE alebo lipozómoch) a provokovali sa 21 dní po imunizácii 106 PFU A / Whooper Swan / Mongolsko / 244/05. Na vyhodnotenie titra vírusu sa zhromaždili výplachy z nosa. Adjuvanty 3M-052 / SE indukovali rýchlejší klírens vírusu s nedetegovateľnými titrami v deň 5. Formulácie 3M-052-lipozomálnych adjuvans vykazujú titer až do dňa 3, s klírensom do 5. dňa.

Obrázok v plnej veľkosti

diskusia

Pokračujúca cirkulácia vírusov HPAI H5N1 u voľne žijúcich vtákov a domácej hydiny a ich schopnosť sporadicky sa prenášať do ľudskej populácie naznačuje, že vírusy tohto podtypu naďalej predstavujú pandemickú hrozbu. Vzhľadom na sporadický výskyt vírusu z ľudí z viacerých vtáčích rezervácií na človeka nie je pravdepodobné, že by sa v skorých štádiách objavujúcej sa pandémie vytvorila vakcína zodpovedajúca kmeňom. Väčšina plánov pripravenosti na pandémiu si vyžaduje hromadenie predpandemických vakcín proti H5N1 v nádeji, že tieto antigény poskytnú dostatočnú ochranu na obmedzenie úmrtnosti v prípade pandémie 11 . Pretože sa zvýšila rozmanitosť cirkulujúcich kmeňov H5N1, zvyšuje sa dopyt po pomocných látkach, ktoré sú kompatibilné so zásobnými vakcínami H5N1 a ktoré môžu rozširovať imunitnú odpoveď vyvolanú týmito vakcínami, aby generovali ochranné reakcie na heterológne kmene. Počet adjuvans licencovaných na použitie u ľudí je relatívne malý. Adjuvanty na báze hliníka, ktoré sa v minulosti bežne používajú, sú pri kombinovaní s vakcínami proti chrípke H5N1 neúčinné 55 . Nedávno boli adjuvans skvalénu typu olej vo vode intenzívne testované s vakcínami H5N1 a preukázali kritické šetrenie dávky, ako aj rozšírenie funkcií 33, 34, 56 .

Výsledky tu uvedené presvedčivo demonštrujú ochranu myší a fretiek po expozícii vírusom H5N1 pri vysokej dávke (1000 LD50), keď sú zvieratá imunizované raz pomocou formulovaného agonistu TLR7 / 8 3M-052. 3M-052 je inkorporovaný do lipozomálnych alebo emulzných formulácií a tieto formulácie sú stabilné po dlhú dobu. Bolo pozorované, že nová PEGylovaná lipozómová formulácia 3M-052 zvyšuje prežitie a znižuje titer vírusu pľúc, keď sa kombinuje s nízkou dávkou (100 ng) rekombinantného antigénu založeného na HA. Okrem toho sme testovali novú formuláciu na báze emulzie, ktorá inkorporuje 3M-052 do emulzie skvalénu typu olej vo vode. Naše zistenia, ktoré sú v súlade s predchádzajúcimi publikovanými prácami, ukazujú, že adjuvantné formulácie na báze SE zvyšujú ochranu proti homológnemu antigénu u myší; pozorovali sme ochranu 100% zvierat pred vírusovou mortalitou. Avšak vyšetrenie pľúcnych titrov, ako aj D7 pľúcnych hmotností a skóre patológie u týchto zvierat ukazujú, že pridanie formulácií na báze 3M-052 k SE významne znižuje titre vírusov pľúc, čo naznačuje zvýšenú kapacitu protilátok indukovaných 3M-052 na neutralizáciu vírusu. a inhibovať šírenie. Naše štúdie ďalej naznačujú, že spoločná lokalizácia agonistu TLR s emulznou formuláciou po injekcii je rozhodujúca pre indukciu protilátok, ktoré znižujú replikáciu vírusu v pľúcach. V súlade s predchádzajúcimi štúdiami, ktoré ukazujú, že agonisty malých molekúl, ako je R848, difundujú z miesta vpichu, R848 v kombinácii s adjuvantmi na báze emulzie neznížil po imunizácii vírusový titer pľúc a priemerné titre boli podobné tým, ktoré sa pozorovali iba pri SE (obr. 2). Naproti tomu zvieratá imunizované 3M-052 / SE vykazujú významné zníženie titra vírusu v porovnaní so zvieratami imunizovanými SE. a preukázali zvýšené prežitie a znížený titer pľúc pri tejto formulácii v kombinácii s rHA.

Schopnosť adjuvans stimulovať krížovú ochranu proti rôznym kmeňom H5N1 má zásadný význam pri vývoji účinných adjuvans pre pandemické vakcíny. Aby sa vyhodnotil potenciál 3M-052 na rozšírenie protilátkových reakcií, skúmali sme väzbový profil postimunizačného séra s použitím HA proteínového poľa s vysokou hustotou. V tomto teste definujeme rozšírenie ako zvýšenie počtu HA kmeňov, ktoré sú rozpoznávané protilátkami indukovanými rôznymi adjuvantnými formuláciami. Zistili sme, že 3M-052, formulovaný buď v SE alebo v lipozomálnej formulácii, vedie k štatisticky významnému zvýšeniu strednej intenzity signálu na všetkých škvrnách v poli protilátkami IgG2c (Obr. 3C). Podobné zvýšenie intenzity signálu nebolo pozorované s protilátkami IgG1. Vyšetrenie počtu kmeňov v rade, ktoré sú pozitívne v rôznych adjuvantných skupinách, je v súlade so širšou imunitnou reakciou, na rozdiel od väzby na homológny antigén na vysokej úrovni. Podrobné vyšetrenie kmeňov H5N1 na poli ukazuje, že špecifická väzba protilátok IgG2c na rôzne kmene H5N1 z rôznych vírusových kmeňov je významne zvýšená pomocou 3M-052 v SE aj v lipozomálnych formuláciách (obrázok 4).

Objavenie sa skrížene reagujúcich protilátkových reakcií u myší nás viedlo k rozšíreniu našich štúdií na model fretiek. Potvrdili sme, že imidazochinolíny môžu stimulovať fretre TLR receptory a pozorovať významné zvýšenie cytokínov a TLR7 a TLR8 mRNA po inkubácii s imidazochinolínmi. Rovnako ako u myší, imunizácia fretiek jednou dávkou antigénu H5N1 indukovala funkčnú ochranu pred homológnymi (Obr. 5) a heterológnymi vírusovými kmeňmi (Obr. 7). Ochrana proti heterológnym kmeňom je konzistentná s indukciou skrížene reaktívnych neutralizačných protilátkových reakcií vo fretách pomocou formulovaných pomocných látok 3M-052.

Schopnosť 3M-052 rozširovať protilátkové reakcie, ktoré v konečnom dôsledku umožňujú ochranu pred napadnutím heterológnym vírusom, by sa mohla pripísať globálnemu zvýšeniu hladín protilátok stimulovaným adjuvantom alebo zmenám repertoáru protilátok indukovaným v prítomnosti agonistu TLR, tak, že sú indukované protilátky s novými variabilnými oblasťami s rôznymi väzobnými špecifickosťami. Aj keď naše štúdie presvedčivo demonštrujú zvýšenú ochrannú kapacitu protilátok indukovaných 3M-052 / SE a 3M-052 / lipozómami, nie je jasné, či je to spôsobené indukciou jedinečných protilátkových sekvencií. Naša predchádzajúca práca preukázala schopnosť 3M-052 zvyšovať diverzitu génov IgG V po dodaní maláriového antigénu. V tomto prípade sa po imunizácii myší 53 pozorovalo zvýšenie počtu sekvencií variabilnej oblasti IgG. Budúce štúdie špecificky skúmajúce schopnosť týchto adjuvans zvyšovať diverzitu sekvencií protilátok v súvislosti s chrípkovými antigénmi H5N1 môžu poskytnúť potenciálny mechanizmus pre zvýšenú ochrannú kapacitu pozorovanú v našich štúdiách a mohli by zosilniť analýzu väzby, ktorá sa tu vykonáva. Toto hodnotenie môže byť obzvlášť dôležité pri riešení vhodnosti 3M-052-SE alebo 3M-052-lipozómov na použitie v široko ochranných prístupoch „univerzálnej“ vakcíny proti chrípke. Uskutočnili sme predbežné skúmanie schopnosti séra generovaného v týchto štúdiách neutralizovať HA proteíny z iných podtypov, najmä A / Kalifornia / 4/2009 (H1N1), a nepozorovali sme neutralizáciu in vitro . Naše údaje zo súboru však môžu naznačovať ďalšie kmene, ktoré môžu byť vybrané na ďalšie preskúmanie funkčnej šírky reakcií vyvolaných 3M-052.

Už skôr sa ukázalo, že pomocné formulácie obsahujúce vrodené imunitné stimulanty, vrátane agonistov TLR a zlúčenín aktivujúcich RIG-I, rozširujú protilátkové reakcie a zvyšujú ochranu heterológnych vírusových kmeňov 57, 58, 59 . Tu uvádzame vývoj ďalších formulácií, ktoré sú schopné indukovať všeobecne ochranné a funkčné protilátkové reakcie. Okrem toho sme už predtým ukázali, že agonista TLR4 GLA, formulovaný buď v stabilnej emulzii 46 alebo vo vodnej formulácii 45, preukázal, že chráni myši aj fretky pred homológnou aj heterológnou expozíciou H5N1. Tieto formulácie boli tiež klinicky testované intramuskulárnou aj intradermálnou cestou (NTC01397604, NCT02465216, NCT01991561, NCT01147068). Profil bezpečnosti formulovaných agonistov TLR4 je sľubný, čo otvára možnosť synergických agonistických formulácií obsahujúcich ako agonistické molekuly 3M-052, tak GLA. Kombinované adjuvans TLR boli testované vo vakcínach na množstvo indikácií ochorenia vrátane chrípky 57 a ukázali sa ako sľubné. Mnoho z týchto predklinických štúdií však používa formulácie agonistov TLR, ktoré sú nepraktické pre postup na kliniku kvôli nedostatku klinicky životaschopnej formulácie 60 .

Záverom je možné uviesť, že tu uvedené údaje demonštrujú užitočnosť 3M-052 ako adjuvans pre vakcíny proti pandemickej chrípke vo viacerých predklinických modeloch. Schopnosť adjuvantných formulácií obsahujúcich 3M-052 indukovať ochranu pred homológnymi aj heterológnymi vírusovými kmeňmi, ako aj predĺžená stabilita formulovaných adjuvans 3M-052 naznačuje, že tieto formulácie sú vhodné na skladovanie. Ďalej sme demonštrovali kompatibilitu týchto adjuvans s pre-pandemickými vakcínovými antigénmi, ktoré sú v súčasnosti zahrnuté v národnej zásobe, a ukázali sme, že kombinovaná vakcína je schopná chrániť fretky pred izolátmi, ktoré zodpovedajú kmeňom a driftom. Budúce štúdie budú zamerané na výrobu cGMP adjuvantných formulácií 3M-052 a na pokrok v toxikológii a klinickom testovaní fázy I.

Materiály a metódy

Formulácia materiálov a výroba

3 M-052 bol syntetizovaný interne spoločnosťou 3M Company a jej štruktúra bola predtým publikovaná 50 . R848 bol dodaný 3 M alebo bol zakúpený od Axxora Life Sciences Inc. (San Diego, CA). Syntetický 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholín (DPPC), 1, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholín (DMPC), 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholín (DOPC) ), 1, 2-dihexadekanoyl-sn-glycero-3-fosfo (1'-rac-glycerol) (DPPG), 1, 2-dipalmitoyl-3-trimetylamónium-propán (DPTAP), 1, 2-dipalmitoyl-sn -glycero-3-fosfoetanolamín-N- [metoxy (polyetylénglykol) -750] (DPPE-PEG750) a vaječný fosfatidylcholín (PC) boli zakúpené od Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL) alebo Lipoid LLC (Newark, NJ) ). Skvalén sa získal od Sigma (St. Louis, MO). Cholesterol, monohydrogenfosforečnan amónny a hydrogenfosforečnan amónny boli zakúpené od JT Baker (San Francisco, CA). Poloxamér 188 a glycerol boli zakúpené od Spectrum Chemical (Gardena, CA). Fosfátový tlmivý roztok 1 x (PBS) pri pH 7, 2 bol zakúpený od Invitrogen (Grand Island, NY).

Malé dávky (<20 ml) PEGylovaných lipozómových formulácií boli vyrobené kombináciou DPPC, cholesterolu a DPPE-PEG750 s rôznymi množstvami 3M-052 v organickom rozpúšťadle (chloroform alebo zmes chloroform / metanol / voda). Organické rozpúšťadlo sa potom odparilo pomocou zariadenia Genevac EZ-2. Lipidový film sa rehydratoval v PBS (pH 7, 2) alebo 25 mM tlmivom roztoku fosforečnanu amónneho (pH 5, 7) a sonifikoval sa v ultrazvukovom vodnom kúpeli Crest powersonic CP230D (Trenton, NJ) pri ~ 60 ° C počas približne 2 až 3 hodiny alebo do formulácia bola priesvitná bez veľkých viditeľných častíc. Rovnaký postup sa použil pre neutrálne lipozómy (DOPC, cholesterol), aniónové lipozómy (DPPC, cholesterol, DPPG) a katiónové lipozómy (DPPC, cholesterol, DPTAP). Hmotnostné pomery lipozómových zložiek boli nasledujúce: PEGylované (18: 5, 5: 3, DPPC: chol: DPPE-PEG750), neutrálne (20: 5, DOPC: chol), aniónové (18: 5: 2, DPPC: chol: DPPG) ), katiónový (18: 5: 2, DPPC: chol: DPTAP). Väčšie šarže (100 ml) PEGylovaných lipozómov sa vyrobili ako je uvedené vyššie, ale s kratšou dobou pôsobenia ultrazvuku, po ktorej nasledovala homogenizácia s vysokým strihom (Microfluidizer M110P) počas 12 kontinuálnych prechodov pri 30 000 psi.

Lipozómy obsahujúce R848 boli pripravené výrobou koncentrovaného PEGylovaného lipozómového prostriedku, ako je opísané vyššie, s výnimkou toho, že lipozómy boli pôvodne hydratované 75 mM roztokom síranu amónneho. Po sonikácii pri 60 ° C ~ 1 h sa použila kolóna PD-10 (GE Healthcare) na výmenu vonkajšieho pufra lipozómov za 0, 9% soľný roztok. Lipozómy, ktoré teraz obsahujú soľný roztok vo svojom vonkajšom pufri a síran amónny vo svojom vnútri, sa zmiešali so soľným roztokom obsahujúcim R848 a inkubovali sa 1 h pri 60 ° C. Nakoniec sa lipozómy nechali prejsť cez ďalšiu kolónu PD-10, aby sa odstránil nezapuzdrený R848.

Emulzie stabilné vo vode (SE) boli vyrobené rozpustením 3M-052 v chloroforme pomocou vaječného PC. Chloroform sa potom odstránil pomocou rotačnej odparky. K vysušenému lipidovému filmu bol potom pridaný skvalén a sklenená nádoba bola umiestnená do sonikačného vodného kúpeľa s teplotou 60 ° C na približne 1 hodinu. Táto zmes sa označuje ako olejová fáza. Alternatívne sa olejová fáza pripravila dispergovaním 3M-052 priamo do skvalénu a DMPC (bez vaječného PC alebo chloroformu). Vodná fáza sa potom pridala do olejovej fázy, aby sa získali konečné koncentrácie 25 mM tlmivého roztoku fosforečnanu amónneho, 0, 037% (hmotn./hmotn.) Poloxaméru 188 a 1, 8% (obj./obj.) Glycerol (izotonické činidlo), 4% obj./obj. skvalén, 7, 6 mg / ml vaječného PC alebo DMPC a rôzne množstvá 3M-052. Niektoré emulzie tiež obsahovali 0, 02% obj./obj. A-tokoferolu. Surová emulzia sa vytvorila sonikáciou zmesi vo vodnom kúpeli s teplotou 60 ° C počas ďalších 10 až 15 minút. Finálna emulzia bola pripravená spracovaním surovej emulzie cez homogenizátor s vysokým strihom (Microfluidizer M110P) počas asi 12 kontinuálnych prechodov pri 30 000 psi.

Emulzie sa pripravili s R848 vyrobením koncentrovanej emulzie, ako je opísané vyššie, a zmiešaním so suchým práškom R848 alebo s roztokom R848 v tlmivom roztoku fosforečnanu amónneho. Emulzie a lipozómy boli filtrované cez 0, 2 um membránu pred in vivo experimentmi opísanými nižšie.

Charakterizácia zloženia

Concentrations of 3M-052 and R848 were estimated by first diluting each formulation 20-fold into a 98% ethanol/2% HCl solution in a cuvette. The samples were analyzed on a Hitachi U-3900H spectrophotometer (Tokyo, Japan) for absorbance at ~322 nm. Particle size was evaluated using a Malvern Instruments (Worcestershire, UK) Zetasizer Nano-S, -ZS, or -APS. Formulations were diluted 100-fold into ultrapure water in a 1.5 ml polystyrene disposable cuvette. For each formulation, three separate cuvettes were prepared. All size measurements were then made three times for each cuvette. Zeta potentials were measured using the Malvern Zetasizer Nano-ZS. For each formulation, 50 μl were combined with 950 μl ultrapure water in a disposable capillary cell (Malvern Instruments, DTS1070). Nine measurements were collected from each prepared sample (one sample per formulation).

Virus Stocks and Vaccines

Vaccine antigens used in this study were all derived from the A/Vietnam/1203/04 (VN1203) influenza virus. Recombinant HA protein (rHA) used in murine immunogenicity and challenge studies was obtained from Protein Sciences Corp. For ferret immunization and challenge studies, a clinical grade split VN1203 vaccine was obtained from Sanofi Pasteur.

Virus stocks for murine and ferret challenge studies were generated by inoculation of 10-day old embryonated chicken eggs with H5N1 stocks as indicated. Clarified allantoic fluid was filtered, and stored at −80 °C until use. Viral titers were determined by plaque assay on MDCK cells (ATCC #CCL-34) using standard assays and as described.

Štúdie na zvieratách

All murine immunogenicity studies were carried out in the IDRI animal care facility (Seattle, WA) under specific pathogen-free conditions, and in accordance with previously approved techniques. All animal experiments and protocols used in this study were specifically approved by IDRI's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Murine challenge studies were carried out by contract with the National Institutes of Health at the University of Utah. Experimental protocols for this work were specifically approved by the IACUC. Ferret challenge studies were carried out in the ABSL3 facility at Colorado State University (CSU) in accordance with established experimental procedures, and were specifically approved prior to initiation by the CSU IACUC.

Murine Challenge Studies

For murine challenge studies groups of 6–8 week old female C57Bl/6 mice (n = 10/group) were immunized with recombinant H5N1 HA protein (VN1203 strain, Protein Sciences Corp.) combined with adjuvant as indicated. All immunizations were via the intra-muscular route in a total volume of 100 μL split evenly between both legs. Twenty one days following immunization, mice were challenged with 1 × 10 6 PFU of A/VN/1203/05 (H5N1 Clade 1). Beginning one day post-challenge, all animals were monitored for weight loss and observed for signs of severe infection. Animals found to have lost >25% of day 0 weight were euthanized.

Ferret Challenge Studies

Male Fitch ferrets ( Mustela putoris fero , Triple F Farms, Sayre PA) were used for all immunization and challenge studies. Immunization of ferrets was carried out by injection of 250 μL into the quadriceps muscle. All animals received 0.5 μg of a split A/Vietnam/1203/04 H5N1 vaccine (Sanofi Pasteur) sourced from the national pandemic stockpile. Serum samples were collected 21 days post-immunization to determine antibody titers.

Challenge was initiated by instillation of 1 × 10 5 –5 × 10 5 PFU of virus into the lung in a volume of 500 μL (250 μL/nare). Following infection, animals were observed and weighed daily to monitor virus induced morbidity, and nasal washes were collected under ketamine-xylazine sedation on days 1, 3, 5, 7, and 9 post-challenge. Any animal displaying severe clinical signs or losing >25% of pre-challenge weight was euthanized.

Plaque Assay

Virus titers were obtained by plaque assay in Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells. Briefly, cells were seeded 24 hours prior to assay initiation into 6-well dishes at 1 × 10 6 cells/well in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and penicillin/streptomycin. At assay initiation, confluent MDCK monolayers were washed three times with PBS to remove FBS. Serially diluted nasal wash samples were added to monolayers in a 100 μL volume and incubated at 37 °C for 60 minutes. Following incubation, monolayers were overlaid with 2 mL of 0.8% Agarose (SeaKem) in MEM(Lonza). Following 48–72 hours of incubation, plaques were quantified following crystal violet (BD) staining.

Microneutralization Assay

Neutralizing antibody titers were determined using pseudotyped lentivirus particles similar to those previously described 61, 62 . Briefly, pseudotype particles are generated by co-transfection of 293 T cells with plasmids expressing H5N1 and HA, and 3 lentivirus packaging plasmids; pDR8.74 63, pRSV-Rev, and HR'-CMV-Luc, which is packaged into the viral particles and encodes a luciferase transgene under the control of the CMV immediately early promoter. Virus stocks were titred in black flat-bottom 96 well plates (Corning) seeded 24 hour prior with 5 × 10 3 MDCK cells/well in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) + 10% fetal bovine serum (FBS). Prior to virus titration, cells were washed 3 times with 200 μL DMEM to remove DMEM, and overlaid with serially diluted virus stocks. Following 72 hour incubation to allow transgene expression, levels of luciferase in transduced cells were determined using BrightGlo luciferase (Promega), according to manufacturer's instructions.

For neutralization analysis, serially diluted post-immunization serum was mixed at a 1:1 ratio with diluted virus stocks containing 1 × 10 4 relative luciferase units (RLU). Virus serum mixtures were incubated at 37 °C for 1 hour, and added to plates containing washed MDCK cells as above. Neutralization titers were determined following assessment of luciferase expression level in all transduced cells. IC 90 antibody titer is defined as the highest dilution of serum observed to reduce luciferase levels by 10-fold relative to vector transduced control cells.

HA Arrays

HA Arrays containing influenza HA proteins have been previously described 54 . The arrays used in this study are second generation, and contain 278 recombinant HA proteins from a variety of influenza strains (Sinobiological). HA proteins from each strain are spotted in the array at 3 different concentrations (0.1, 0.03, 0.01 pg/spot) to allow dose response analysis. For post-vaccination immune analysis, arrays were initially blocked with PBS + 1% Fetal Bovine Serum + 0.1% Tween-20, washed three times with Protein Array Wash Buffer (ArrayIt), and incubated with 300 μL of a 1:100 dilution of post-immunization mouse serum for 1 hour with shaking. Following primary incubation, arrays were washed 5 times with wash buffer, and incubated with fluorophore conjugated secondary antibodies for IgG2c (Jackson Immunoresearch, Part #: 115-495-208) and IgG1 (Life Technologies, Part#: A21123) at a 1:2000 dilution. Following a 30 minute incubation at room temperature, arrays were rinsed with Rinse Buffer (Arrayit), and analyzed using a Molecular Dynamics 400B array scanner.

Statistical Analysis of Array Data

Background signals from sample specific median for negative control spots (PBS buffer) were subtracted from purified protein spot signals. The data were then normalized by dividing the background removed purified protein spot intensity by the global median for the negative control spots throughout the chip (fold over control [FOC]) and then taking the base 2 logarithm of the ratio (log 2 FOC). The normalized data provide a relative measure of specific antibody binding to nonspecific antibody binding to the purified protein controls (ie, the background). The base stats package in R was used to calculate 2-sided t test P values on log2 transformed data and to correct P values for false discovery using the Benjamini-Hochberg method 64 . Differences were considered significant with Benjamini Hochberg corrected p -values < 0.05. Antigens with average signals above 1000 within each group were considered to be reactive antigens due to low background signals from PBS buffer. To compare multiple groups, Kruskal–Wallis/Dunn multiple-comparison tests with corrected P values were calculated in R.

ELISA

HA-specific endpoint titers for IgG, IgG1 and IgG2c were determined seven days and twenty-one days post immunization. High binding polystyrene 384 well plates were coated with recombinant VN1203 HA (Protein Sciences Corp.) (2 μg/ml) in 0.1 M bicarbonate coating buffer for 2.5 hours at room temperature. Plates were washed three times with 0.1% PBS–Tween 20 pre and post a two hour blocking incubation with 0.05% PBS–Tween 20 + 1% BSA at room temperature. Mouse sera was serially diluted in 0.05% PBS–Tween 20 + 0.1% BSA using the Nanonscreen NSX-1536 and incubated overnight at 4 °C and washed five times. Plates were incubated for 1 hour on the shaker with anti-mouse IgGT, IgG1 or IgG2c-HRP (Southern Biotechnologies). Following five washes, plates were developed on the Nanoscreen robot using SureBlue tetramethylbenzidine substrate (Kirkegaard & Perry Laboratories). The enzymatic reaction was stopped with 1 NH 2 SO4 using the Multipette Sagian robot. Plates were read at 450–570 nm using the Synergy ELISA plate reader (Biotek) and Gen 5 software.

Ďalšie informácie

How to cite this article: Van Hoeven, N. et al . A Formulated TLR7/8 Agonist is a Flexible, Highly Potent and Effective Adjuvant for Pandemic Influenza Vaccines. Sci. Rep. 7, 46426; doi: 10.1038/srep46426 (2017).

Poznámka vydavateľa: Springer Nature zostáva neutrálny, pokiaľ ide o nároky na jurisdikciu v uverejnených mapách a inštitucionálne pridruženie.

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplňujúce údaje

Komentáre

Odoslaním komentára súhlasíte s tým, že budete dodržiavať naše zmluvné podmienky a pokyny pre komunitu. Ak zistíte, že je niečo urážlivé alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte ho ako nevhodné.