Proteín f-box afb4 hrá rozhodujúcu úlohu pri raste, vývoji a vrodenej imunite rastlín bunkový výskum

Proteín f-box afb4 hrá rozhodujúcu úlohu pri raste, vývoji a vrodenej imunite rastlín bunkový výskum

Anonim

predmety

  • Bunková biológia
  • Vývoj rastlín
  • Imunita rastlín

Drahý editor,

Proteín F-boxu 4 signalizujúci Auxín (AFB4) kódovaný At4g24390 zdieľa významnú sekvenčnú podobnosť s auxínovým receptorom TIR1. V tejto štúdii sme použili kombináciu fyziologických, molekulárnych a genetických prístupov na charakterizáciu inzertnej línie T-DNA (GABI-KAT prístupové číslo: 068E01; odtiaľ označená afb4-1 ) ako knockoutovej alely. Úplná strata funkcie génu AFB4 spôsobuje defekty v mnohých aspektoch životného cyklu rastlín vrátane vývoja laterálnych koreňov, predĺženia hypokotylov, organogenézy listov, času kvetenia, tvorby semien a rezistencie voči špecifickým fytopatogénom. Tu prezentované výsledky argumentujú proti skôr navrhovanému mechanizmu účinku AFB4 pri negatívnom riadení citlivosti na auxín 1 .

mutanty afb4-1 vykazovali pleiotropný fenotyp. Jednou z najvýraznejších vlastností je, že afb4-1 vykazuje extrémne malé, ale zdeformované listy ružice s krátkym stopkou (obrázok 1A a 1B). Bližšie skúmanie úplne expandovaných listov pod svetelným mikroskopom odhalilo podobné epidermálne bunky bez zmeny veľkosti v afb4-1 v porovnaní s rastlinami divokého typu (WT), zatiaľ čo hrúbka listu sa zvýšila (doplnkové informácie, obrázok S1). V súlade s týmto posledným pozorovaním bol konečný objem buniek listov listov v afb4-1 významne väčší ako objem vo WT, čo pravdepodobne do istej miery kompenzuje defekt konečnej veľkosti listov listov, ako bolo pozorované v mnohých mutáciách listov 2, Naproti tomu drastické zníženie dĺžky buniek stopky (obrázok 1C) určite zodpovedá za výrazne znížené predĺženie stopky afb4-1 (obrázok 1B). Na rozdiel od afb4-2 a afb4-3 1, kontrola rastu WT a mutantného primárneho koreňa nedokázala odhaliť žiadny štatistický rozdiel (obrázok 1D). Sadenice afb4-1 však mali menšie bočné korene vyčnievajúce z primárnych koreňov (obrázok 1D), čo naznačuje, že AFB4 by sa mohol podieľať na aktivácii programu vývoja laterálnych koreňov. Okrem toho, požiadavka AFB4 na predĺženie hypocotylu je zrejmá z pozorovania, že sadenice vykazovali podstatne kratšie hypokotyly (obrázok 1D). Okrem zrejmých zmien v laterálnom raste koreňov a organogenéze listov sa afb4-1 ľahko odlíšil od WT, pokiaľ ide o zreteľné morfologické znaky, vrátane veľkého zníženia výšky rastlín (obrázok 1E) a viditeľného oneskorenia pri prechode z vegetatívneho na vegetatívne na reprodukčná fáza (obrázok 1F). Napriek výraznému zníženiu veľkosti, hmotnosti a výnosu semien (obrázok 1G a 1H), životaschopnosť nebola ovplyvnená, čo naznačuje normálny vývoj embrya v afb4-1 . V skutočnosti sa nezistil žiadny defekt v rôznych vývojových štádiách embryogenézy afb4-1 (doplnková informácia, obrázok S2).

Image

Funkčná analýza génu AFB4 v Arabidopsis thaliana . (A) Morfológia 12 dní starých sadeníc afb4-1 pestovaných v kvapalnom médiu ½MS. (B) Listová organogenéza v homozygotoch afb4-1 . Fotografovali sa piate listy 28-dňových rastlín pestovaných v pôde. (C) Porovnanie buniek stopky v rastlinách WT a afb4-1 pod svetelnou mikroskopiou. (D) Korene a hypokotyly afb4-1 . Dĺžka primárnych koreňov a hypokotylov sa merala pomocou 7-dňových sadeníc, zatiaľ čo 14-dňové sadenice sa použili na počítanie laterálnych koreňov. Stredné hodnoty a štandardné odchýlky sa vypočítali od 30 jedincov. Test rastu sadenice sa nezávisle opakoval trikrát s podobnými výsledkami. (E) Výška 56 dní starých pôdnych rastlín. Priemerné a štandardné odchýlky sa vypočítali z 28 jednotlivých rastlín. Pokusy boli uskutočňované nezávisle dvakrát s podobnými výsledkami. (F) Doba kvitnutia rôznych genotypov. Chybové stĺpce označujú štandardnú odchýlku 28 rastlín. Podobné výsledky sa získali z dvoch nezávislých experimentov. (G) Porovnanie hmotnosti semien. Chybové stĺpce pre hmotnosť semien naznačujú štandardnú odchýlku troch náhodných meraní s 1 000 semenami na genotyp. (H) Výťažok osiva. Rastliny boli oplodnené trikrát počas celého životného cyklu. Semená pochádzajúce z 10 jednotlivých rastlín sa spojili ako jedna vzorka. Chybové stĺpce predstavujú štandardnú odchýlku troch vzoriek. Uskutočnili sa dva nezávislé experimenty s podobnými výsledkami. (I) Auxínová indukcia génu IAA5 v rôznych genotypoch. Pre každú vzorku bolo použitých ~ 100 sadeníc v štádiu 9 dní. Údaje sú uvedené ako stredné hodnoty ± štandardné chyby z troch nezávislých biologických replikátov s použitím simulovaného ošetrenia (H20) ako kontroly 2 μM IAA v uvedených časových bodoch. (J) Reakcia na rast elongácie hypokotylu vyvolaná teplotou. mutanty tir-1 sa použili ako negatívna kontrola. Hypokotyly sa merali z deväťdňových sadeníc transgénnych línií WT, afb4-1 a afb4-1 nesúcich cDNA s plnou dĺžkou AFB4 pod kontrolou promótora 35S. Údaje predstavujú priemerné meranie 30 jednotlivých sadeníc. Chybové stĺpce označujú smerodajnú odchýlku. Podobné výsledky sa získali z dvoch nezávislých experimentov. (K) Patogénna infekcia. Očkovanie sa uskutočnilo virulentným kmeňom SCC1 z Pectobacterium carotovorium subsp. karotovorium pri 1 x 105 cfu / ml. Každá vzorka pozostávala z ôsmich jednotlivých rastlín. Údaje sú uvedené ako stredné hodnoty ± štandardné chyby z troch biologických replikátov. (L) Morfológia nezávislých alely antisense- umlčaných afb4 v štádiu 21 dní. (M) Relatívne úrovne expresie AFB4 transkriptov v zodpovedajúcich riadkoch (L) pomocou RT-qPCR analýz. Údaje sú uvedené ako stredné hodnoty ± štandardné chyby. ND: nedetegovateľné. (N) AFB4 nadmerné expresie na pozadí afb4-1 . Obrázky ukazujú 28-dňových zástupcov z dvoch nezávislých línií nadmernej expresie v porovnaní s WT. (O) Genetická komplementácia. 28-dňové transgénne rastliny, ktoré mali AFB4 cDNA pod kontrolou promótora 35S v pozadí afb4-1 , vykazovali úplné obnovenie rastovej morfológie. (P) Relatívne hladiny expresie AFB4 mRNA v nezávislých transgénnych líniách nesúcich cDNA AFB4 pod kontrolou promótora 35S. Údaje sú uvedené ako stredné hodnoty ± štandardné chyby z troch nezávislých biologických replikátov. (Q) Dĺžka stopiek deväťdňových sadeníc afb4-2 a afb4-3 ( AFB4-afb4-2 alebo AFB4-afb4-3 ) v porovnaní s transgénnymi líniami nesúcimi intaktný lokus AFB4 ( AFB4-AFB4 ) alebo jeho cDNA s plnou dĺžkou riadená promótorom 35S ( H3 alebo H15 zodpovedajúci dvom líniám opísaným v N. na pozadí afb4-1 . Každá vzorka pozostávala z 30 sadeníc. Údaje sú uvedené ako stredné hodnoty ± štandardné chyby z troch nezávislých biologických replikátov.

Obrázok v plnej veľkosti

Pretože rast a vývoj rastlinných orgánov sa vo veľkej miere riadia fytohormónmi 3, opýtali sme sa, či sú hormonálne sprostredkované odpovede modifikované v afb4-1 . Reakcia na rôzne hormóny v širokom rozmedzí koncentrácií bola kvantifikovaná fyziologickými testami na inhibíciu rastu primárnych koreňov alebo na stimuláciu elongácie hypokotylov (doplnková informácia, obrázok S3). Afb4-1 zjavne vykazoval zmenenú citlivosť na exogénnu aplikáciu kyseliny 1-aminocyklopropán-1-karboxylovej (prírodný prekurzor etylénu), 24-epibrassinolidu, gibberelínov A3 a kyseliny abscisovej. Tieto výsledky naznačujú, že AFB4 proteíny sú dôležitými účastníkmi mnohých hormonálnych signálnych dráh. Na druhej strane sa afb4-1 podstatne nelíšil od WT pri liečbe kyselinou indoloctovou (IAA), kinetínom a transzeatínom, čo naznačuje afinnú signalizáciu auxínu alebo cytokinínu v afb4-1 .

Objavujú sa dôkazy, že procesy závislé od auxínu sú regulované tkanivovo špecifickým spôsobom, 4, 5 a krátky hypocotyl je charakteristický pre auxínové / iaa mutanty 6, čo nás vedie k tomu, aby sme špekulovali, že by mohol byť kód auxínového typu špecifický pre hypokotyly. zmenené v afb4-1 . Na podporu tejto hypotézy bola indukcia IAA auxínového signalizačného markera IAA5 čiastočne znížená (obrázok 11). Ďalej sa zdá, že indukcia predĺženia hypokotylu pri vysokej teplote 7 závislá od auxínu je narušená (obrázok 1J). Aj keď ešte nie je známe, či narušenie T-DNA spôsobuje inhibičný účinok na produkciu auxínu pri vysokej teplote alebo poruchu prenosu signálu reagujúcu na auxín v afb4-1 , naše údaje zdôrazňujú požiadavku funkčného AFB4 na auxínmi sprostredkovanú rastovú odpoveď. predĺženia hypocotylu.

Vzhľadom na rôzne poruchy rastu a vývoja sme sa pýtali, či prerušenie AFB4 T-DNA môže mať nepriaznivé účinky na imunitu rastlín. Je zaujímavé, že afb4-1 vykazoval zvýšenú rezistenciu po stimulácii virulentným kmeňom SCC1 z Pectobacterium carotovorium subsp. karotovorum 8 . Na rozdiel od masívne sa šíriacej macerácie pri WT bol príznak choroby v afb4-1 silne oslabený s obmedzenou maceráciou sprevádzanou nekrotickou léziou v naočkovaných listoch (obrázok 1K). V súlade s týmto pozorovaním sa bakteriálny rast v planéte dramaticky znížil (obrázok 1K). Tieto výsledky ukazujú, že eliminácia génu AFB4 priamo prispieva k zníženej citlivosti afb4-1 na SCC1.

Na pevné stanovenie príčinnej súvislosti medzi AFB4 a pozorovanými fenotypmi sme vykonali molekulárno-genetické analýzy. Po potvrdení inzercie prístupom založeným na PCR nasledovalo sekvenovanie DNA (doplňujúce informácie, obrázky S4A a S4B). Ako sa predpokladalo, v homozygotnej afb4-1 nebol detegovaný žiadny úplný transkript (obrázok S4C). Vkladanie T-DNA však viedlo k abnormálnemu prepisu heterozygotov aj homozygotov (doplňujúce informácie, obrázok S4D). CDNA odvodená z aberantných mRNA predpovedala skrátený proteín (doplnková informácia, obrázok S4E). Ďalej, analýzy segregácie (doplnkové informácie, obrázok S4F) naznačujú, že defekty rastu sú úzko spojené s definovanou T-DNA. Najmä semidominantný rastový fenotyp v heterozygotoch zvýšil možnosť, že skrátené proteíny v heterozygotoch súťažia s normálnym AFB4, a tak udeľujú dominantnú negatívnu vlastnosť. Aby sme to vylúčili, generovali sme nadmerné expresné línie v pozadí WT, ktoré presne obsahovali ten istý umelý gén, aký je prítomný v afb4-1, ale poháňaný CaMV-35S. Všetky línie vykazovali fenotyp WT, aj keď s robustnou nadmernou expresiou (doplnková informácia, obrázok S5), čo naznačuje nefunkčný skrátený proteín afb4-1 . Aby sa ďalej objasnilo, že medziproduktový fenotyp v heterozygotoch je výsledkom znížených hladín v transkriptoch AFB4 , modulovali sme endogénny obsah mRNAs AFB4 prostredníctvom antisense sprostredkovaného umlčania génov. Zástupcovia boli ukázaní s veľkou variabilitou Ti rastu (obrázok 1L). Kvantifikácia AFB4 mRNA neuzatvorila dobrú koreláciu medzi úrovňami expresie a stupňom defektov v tvare listu a veľkosti ružice (obrázok 1M). Je zrejmé, že dĺžka stopiek sa v priamom pomere k zníženým hladinám transkriptov AFB4 v protismerných stratách funkcie afb4 čoraz kratšie (obrázok 1L a 1M).

Paralelne sme uskutočnili komplementačné experimenty zavedením cDNA AFB4 do afb4-1 pod kontrolou CaMV-35S. Z 84 rastlín s nadmernou expresiou Ti sme ich mohli umiestniť do troch skupín na základe morfológie listov. Väčšinu možno klasifikovať ako 35S-AFB4-H s malým, ale rozpoznateľným rozdielom v tvare listu listu (obrázok 1N). 35S-AFB4-M a 35S-AFB4-L pozostávali z deviatich a siedmich línií, ktoré sa správajú ako rastliny WT (obrázok 10) alebo antisense-umlčané rastliny (obrázok 11). Dve línie z každej skupiny sa náhodne vybrali na následné analýzy mRNA AFB4 . V 35S-AFB4-H bola expresia AFB4 oveľa vyššia (> 10-násobná) ako expresia WT, zatiaľ čo množstvo transkriptov AFB4 sa akumulovalo na 1, 7 až 2, 5-násobku v 35S-AFB4-M a oveľa nižšiu úroveň v 35S -AFB4-L (obrázok 1P). Ďalej sme skúmali počet laterálnych koreňov, rast listových stopiek a predĺženie hypokotylov s použitím sadeníc in vitro získaných z 35S-AFB4-H a 35S-AFB4-M. Okrem ostria podobného lyžičke sa pozorovali mierne dlhšie čapíky u 35S-AFB4-H (obrázok 1Q). Ako sa očakávalo, defekty rastu a vývoja sa úplne obnovili na WT v rastlinách 35S-AFB4-M (obrázok 1D-1J). Okrem toho bola pozorovaná úplná obnova aj u rastlín pestovaných v pôde, čo sa týka náchylnosti afb4-1 na SCC1 na choroby (obrázok 1K).

Je zaujímavé, že sme si všimli, že porovnateľná úroveň expresie s WT v niekoľkých 35S líniách mala podobný fenotyp ako antisense línie. Usúdili sme, že 35S-riadená expresia AFB4 maskuje špecifickosť bunkového typu v transgénnych líniách. Skutočná hladina expresie AFB4 v zodpovedajúcich bunkách zodpovedných za fenotyp WT môže byť nižšia ako meranie získané z listov ružíc . Intaktný AFB4 lokus bol preto skonštruovaný v afb4-1 na genetickú komplementáciu. Z 38 nezávislých riadkov obsahovalo 23 (označovaných ako AFB4-AFB4-M) ≥ 2 funkčné vložky a 15 (pomenované AFB4-AFB4-S) s jednou funkčnou vložkou (doplnkové informácie, tabuľka S1). Prekvapivo takmer všetky sadenice T2 v AFB4-AFB4-M vyvinuli fenotyp WT a občas niektorí jednotlivci z každej línie vykazovali syndróm podobný heterozygotom. Naopak, všetky semenáčiky odolné voči antibiotikám T2 v AFB4-AFB4-S mali mierne, ale významne dlhšie stopky (obrázok 1Q), pričom symetricky znížené listy pripomínali rastliny 35S-AFB4-H. Aby sme korelovali tento neočakávaný jav s expresiou transgénu, kvantifikovali sme početnosť AFB4 mRNA v náhodne vybraných rastlinách (doplnková informácia, obrázok S6). Je zaujímavé, že hladiny transkriptov AFB4 v AFB4-AFB4-M boli asi 30 až 60-násobne vyššie ako hladiny WT. U potomkov AFB4-AFB4-S sme zistili 10 až 20-násobné zvýšenie. Na základe tohto zistenia máme podozrenie, že v transgéne chýbajú buď cis- alebo transregulačné prvky na potlačenie expresie AFB4 . Je pravdepodobné, že rastliny nadexprimujúce mierne hladiny AFB4 mRNA pravdepodobne obsahujú zvýšené hladiny AFB4, ale extrémne vysoká koncentrácia by mohla spustiť agregáciu proteínov AFB4, aby sa dosiahla normálna bunková hladina.

Pretože v TILLINGových líniách 9, 10 sa často vyskytuje vysoká frekvencia mutácií, afb4-1 preto poskytol alternatívny nástroj na vylúčenie akýchkoľvek možných účinkov spôsobených komplikovaným genetickým pozadím afb4-2 alebo afb4-3 . Za týmto účelom sme vychovali> 100 nezávislých transgénnych línií nesúcich AFB4: AFB4-GUS, ako bolo opísané skôr 1 . Na naše prekvapenie sa nepozoroval žiadny účinok v týchto transgénnych líniách, aj keď existencia fúznych mRNA AFB4-GUS bola overená sekvenovaním cDNA a aktivitou GUS (doplnkové informácie, obrázok S7). Ďalej sme zaviedli bodové mutácie do afb4-1 rovnakým spôsobom ako pre konštrukt AFB4: AFB4 . Celkom 46 a 32 nezávislých línií bolo zvýšených pre afb4-2 , respektíve afb4-3 . Podrobná analýza inzerčného čísla, expresie afb4 a rastového fenotypu jasne ukázala, že obidva transgény sa správali ako AFB4 transgén (Obrázok 1Q, Doplňujúce informácie, Obrázok S8 a Tabuľka S1). Tieto výsledky naznačujú, že mutácie aminokyselinových zvyškov v alelách TILLING nemajú žiadny vplyv na funkciu AFB4. Nemôžeme však úplne vylúčiť možnosť, že mutácie v afb4-2 a afb4-3 vedú k zníženej alebo zvýšenej aktivite AFB4. V tomto scenári je výsledok v transgénnych líniách pravdepodobne určený samotnou mutáciou aminokyselinových zvyškov a nadprodukciou transkriptov afb4-2 alebo afb4-3 . Bez ohľadu na to, ktorá hypotéza je pravdivá, údaje z predchádzajúceho testu komplementácie AFB4-GUS v afb4-2 1 by sa mali interpretovať opatrne.

Keď vezmeme všetky údaje dohromady, usúdime, že afb4-1 je nulová alela, čím poskytuje vynikajúci nástroj na ďalšie skúmanie bunkových procesov kontrolovaných AFB4. Modulácia endogénnych hladín transkriptov AFB4 naznačuje, že transkripčná regulácia expresie AFB4 by mohla byť jedným z ústredných mechanizmov kontrolujúcich signalizáciu sprostredkovanú AFB4. Naše výsledky ďalej naznačujú kľúčovú úlohu AFB4 pri koordinácii dynamických signálnych dráh sprostredkovaných hormónmi a pri vyrovnávaní rastu a obranných reakcií. Aj keď aktivácia obrannej signalizácie v afb4-1 sa ešte musí geneticky a biochemicky vymedziť, toto zistenie je obzvlášť dôležité, pretože Pectobacterium carotovorium je pôvodcom choroby mäkkej hniloby so závažným poškodením mnohých ekonomicky významných plodín a že neexistuje žiadny priamy dôkaz o R - doteraz bola dosiahnutá sprostredkovaná rezistencia na tento fytopatogén. Experimentálne materiály a metódy sú znázornené v doplnkových informáciách, Data S1.

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplňujúce informácie, obrázok S1

    Morfológia listov pod svetelnou mikroskopiou.

  2. 2.

    Doplňujúce informácie, obrázok S2

    Embryogenéza afb4-1 .

  3. 3.

    Doplňujúce informácie, obrázok S3

    Hormonálna špecifickosť fenotypov afb4-1 .

  4. 4.

    Doplňujúce informácie, obrázok S4

    Molekulová charakterizácia afb4-1 mutantov.

  5. 5.

    Doplňujúce informácie, obrázok S5

    Analýza RNA-gélu ukazujúca nadmernú akumuláciu afb4-1 transkriptov v nezávislých transgénnych líniách.

  6. 6.

    Doplňujúce informácie, obrázok S6

    Expresia AFB4 v náhodne vybraných transgénnych rastlinách odvodených od nezávislých línií buď s jedným samostatným inzertom AFB4-AFB4 ( AFB4-AFB4-S ) alebo s viacerými inzertmi AFB4-AFB4 ( AFB4-AFB4-M ).

  7. 7.

    Doplňujúce informácie, obrázok S7

    Test komplementácie fúznych proteínov AFB4-GUS.

  8. 8.

    Doplňujúce informácie, obrázok S8

    Primárny rast koreňov a predĺženie hypokotylov v nezávislých transgénnych líniách nesúcich transgény intaktného AFB4 alebo bodových mutácií afb4-2 a afb4-3 v pozadí afb4-1 .

  9. 9.

    Doplňujúce informácie, Údaj S1

    Materiály a metódy

Excel súbory

  1. 1.

    Doplňujúce informácie, tabuľka S1

    Segregačná analýza potomstva T1 podrobeného selekcii hygromycínu

    ( Doplňujúce informácie sú spojené s online verziou článku na webovej stránke Cell Research .)