Epigenetické umlčanie mirna-9 je spojené s onkogénnou aktivitou hes1 a zlou prognózou meduloblastómu | britský časopis o rakovine

Epigenetické umlčanie mirna-9 je spojené s onkogénnou aktivitou hes1 a zlou prognózou meduloblastómu | britský časopis o rakovine

Anonim

predmety

  • Epigenetika rakoviny
  • Rakovina CNS
  • miRNA
  • prognóza

Tento článok bol aktualizovaný

abstraktné

Pozadie:

microRNA-9 je kľúčovým regulátorom neuronálneho vývoja aberantne exprimovaným v mozgových malignitách, vrátane meduloblastómu. Mechanizmy, ktorými mikroRNA-9 prispieva k patogenéze meduloblastómu, zostávajú nejasné a faktory, ktoré tento proces regulujú, nie sú vymedzené.

metódy:

Analyzoval sa stav expresie a metylácie microRNA-9 v bunkových líniách meduloblastómu a primárnych vzorkách. Bola vyhodnotená asociácia expresie mikroRNA-9 s klinickým výsledkom pacientov s meduloblastómom a vplyv obnovenia microRNA-9 bol funkčne potvrdený v bunkách meduloblastómu.

výsledky:

Expresia mikroRNA-9 je potlačená vo veľkej podskupine vzoriek MB v porovnaní s normálnym fetálnym mozočkom. Nízka expresia mikroRNA-9 významne koreluje s diagnózou nepriaznivých histopatologických variantov a so zlým klinickým výsledkom. k utlmeniu mikroRNA-9 dochádza prostredníctvom hypermetylácie CpG ostrova špecifickej pre rakovinu. HES1 bol identifikovaný ako priamy cieľ mikroRNA-9 pri meduloblastóme a ukázalo sa, že obnovenie mikroRNA-9 spúšťa zastavenie bunkového cyklu, inhibuje rast klonov a podporuje diferenciáciu buniek meduloblastómu.

záver:

microRNA-9 je metylačne utlmený nádorový supresor, ktorý by mohol byť potenciálnym kandidátom prediktívneho markera pre zlú prognózu meduloblastómu. Strata mikroRNA-9 môže poskytnúť proliferatívnu výhodu nádorovým bunkám a mohla by prispieť k patogenéze choroby. Reexpresia mikroRNA-9 môže teda predstavovať novú stratégiu epigenetickej regulácie proti meduloblastómu.

Hlavné

Medulloblastóm (MB) je najbežnejším malígnym nádorom mozgu u detí. Napriek nedávnemu pokroku v liečbe zomrie na chorobu približne 30% detí s MB (Northcott et al, 2012a). Tí, ktorí prežili, majú často výrazne zníženú kvalitu života v dôsledku následkov liečby (Mulhern et al, 2005). Na zníženie úmrtnosti a chorobnosti sú preto potrebné nové a cielené terapeutické stratégie. Štúdie molekulárneho profilovania nedávno identifikovali štyri hlavné podskupiny nádorov MB s potenciálnymi cieľmi pre špecifické terapie založené na variabilnej génovej expresii (Kool a kol., 2008; Northcott a kol., 2011). Nádory WNT sa vyznačujú aktivovanou dráhou bez krídla a vykazujú priaznivú prognózu pri súčasných liečebných režimoch. Nádory SHH majú aktívnu signalizáciu ježkom a majú strednú prognózu. Skupina 3, vyznačujúca sa vysokými hladinami MYC, a nádory skupiny 4, ktoré sú menej molekulárne charakterizované, sú zvyčajne spojené so zlou prognózou (Taylor et al, 2012). Napriek veľkému pokroku v boji proti MB, ktorý je výsledkom podskupín založených na molekulách, je potrebné vyvinúť ďalšie úsilie na identifikáciu kľúčových biologických zmien, na ktoré by sa mohli zamerať cielené terapie.

MikroRNA (miRNA) sú malé molekuly RNA, ktoré sa objavili ako kľúčové regulátory pri vývoji normálnych ľudských mozgových a mozgových nádorov vrátane MB (Hummel a kol., 2011; Dubuc a kol., 2012). Po väzbe na 3'UTR miRNAs regulujú expresiu cieľových génov blokovaním translácie a / alebo indukciou degradácie mRNA. Nedávne špecifické expresné podpisy miRNA pomohli zlepšiť molekulárnu klasifikáciu nádorov mozgu a uľahčili diagnostiku a predikciu terapeutickej odpovede a prognózy (Fernandez et al, 2009). Predpokladá sa, že miRNA majú rozhodujúcu úlohu v patogenéze tumoru MB kvôli ich zmenenej expresii pozorovanej vo veľkom počte primárnych vzoriek MB (Pang a kol., 2009; Turner a kol., 2010). Vysoký výkonný profil expresie miRNA exprimovaný buď v neuronálnych tkanivách alebo spojený s vývojom nádoru odhalil nádorovo špecifický vzorec expresie mikroRNA vo vzorkách ľudských ľudských MB (Ferretti et al, 2009). Najmä sa zistilo, že miR-9 je jednou z kľúčových miRNA exprimovaných pri nízkych hladinách v MB nádoroch v porovnaní s normálnym fetálnym mozkom.

MiR-9 je regulátorom osudu neuronálnych progenitorových buniek počas neurogenézy (Wienholds a kol., 2005; Shibata a kol., 2011), ktorý sa nedávno podieľa na rakovine (Delaloy a kol., 2010). Aj keď väčšina štúdií naznačuje tumor-supresorovú aktivitu miR-9 v rakovinových bunkách (Laios et al, 2008), existujú rozporné údaje a zdá sa, že výsledok funkcie miR-9 je špecifický pre nádor (Khew-Goodall a Goodall, 2010)., miR-9 je znížená u rakoviny prsníka, karcinómu obličkových buniek a rakoviny žalúdka v dôsledku metylácie promótora (Lehmann a kol., 2008; Hildebrandt a kol., 2010; Tsai a kol., 2011). Naopak sa zistilo, že miR-9 je upregulovaný u gliómov a pri kolorektálnom karcinóme (Malzkorn a kol., 2010; Zhu a kol., 2012). Posledné štúdie tiež uvádzajú, že miR-9 je heterogénne exprimovaný v danom tkanive (Bonev et al, 2011). K dnešnému dňu zostáva nejasné, ako aberantná expresia miR-9 prispieva k patogenéze MB. Preto sme skúmali expresiu miR-9 v MB, jeho funkčnú úlohu a súvislosť s klinickým výsledkom pacientov s MB.

Materiály a metódy

Ľudské primárne vzorky a bunkové línie

Nádorový materiál použitý v tejto štúdii pochádza z dvoch súborov archívnych MB vzoriek od pacientov liečených v Univerzitnej detskej nemocnici v Zürichu, v Zürichu, vo Švajčiarsku ( n = 78; 63 vo formalíne fixovanom parafíne a 15 čerstvých mrazených). DNA zo 64 MB vzoriek (49 formalínom fixovaných parafínom zabudovaných + 15 čerstvých zmrazených) bola k dispozícii pre metylačnú štúdiu. mRNA bola dostupná zo 14 zo 63 vzoriek vložených do parafínu fixovaných vo formalíne a z 15 ďalších čerstvých zmrazených MB vzoriek. Všetky tkanivové vzorky použité v tejto štúdii boli získané z banky nádorov Swiss Pediatric Oncology Group (SPOG). Nemocnica, ktorá poskytla vzorky tkanív, získala od každého pacienta písomný informovaný súhlas. Použitie vzoriek tkaniva SPOG Tumor Bank na výskumné účely rakoviny schválila Rada pre etické preskúmanie v Zürichu (č. StV-18/02). Profil génovej expresie 88 vzoriek primárnych MB nádorov sa uskutočnil v laboratóriu Dr. Taylor's (Nemocnica pre choré deti, oddelenie neurochirurgie, Toronto, ON, Kanada) a použil sa na génovú expresiu a analýzu prežitia. Normálna fetálna mozočka sa použila ako kontrola pre štúdie expresie mRNA ( n = 5; gestačný vek: 16 - 26 týždňov). Na stanovenie korelácie medzi expresiou vybraných génov sa použili verejne dostupné údaje z mikročipov z 285 primárnych MB vzoriek (Northcott et al, 2012b). Profily expresie MB sa vytvorili na Affymetrix Human Gene 1.1 ST Array (Santa Clara, CA, USA). Dáta sú prístupné prostredníctvom otvorenej prístupovej databázy R2 na vizualizáciu a analýzu údajov z mikročipov (//r2.amc.nl).

Bunkové línie MB sa kultivovali, ako už bolo publikované (von Bueren a kol., 2007) a udržiavali sa pri 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére s 5% CO2. Ľudské MB bunky DAOY boli zakúpené od American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Ľudské MB bunky D341, D425, UW-228-2 a Med-1 boli láskavým darom Dr. Henryho Friedmana (Duke University, Durham, UK). Bunky PFSK boli láskavým darom Dr. Petra Phillipsa (Detská nemocnica vo Philadelphii, Philadelphia, PA, USA).

Analýza mikroRNA a RNA a profilovanie expresie ľudských primárnych MB

Celková RNA na analýzu mikroRNA sa izolovala pomocou súpravy na izoláciu miRNA mirVana miRNA (Ambion, Life Technology, NY, USA) podľa pokynov výrobcu. Po syntéze zrelých mikroRNA v prvom reťazci nasledovala qRT-PCR s použitím mikroRNA-špecifických TaqMan MGB sond pre miR-9 (ID 000583) a pre kontrolnú RNA U6 malý nukleárny 2 (RNU6B) (ID 001093) (Applied Biosystems, Life Technology, Carlsbad, CA, USA). Celková RNA na analýzu mRNA bola extrahovaná pomocou súpravy RNeasy Mini Kit (Qiagen, Basel, Švajčiarsko) podľa pokynov výrobcu. Pre reakciu qRT-PCR sa použil génový expresný hlavný mix a protokol sa optimalizoval pre čítačku ABI7900HT (Applied Biosystems, Life Technology). Boli použité roztoky sond a primerov, ktoré sú špecifické pre nasledujúce gény: HES1 (Hs00172878_m1), p21 (Hs00355782_m1), MASH1 / ASCL1 ( Hs00269932_m1), NEUROD1 (Hs00159598_m1), MAP2 (Hs00258900_m1) H60H6 , H60H60 , H60H60 , H60H60 , H60 , H60 , H60 , H60 , H60 , H60 , H60 , H60, H60, H60 (Hs00707120_s1) a TUBB3 (Hs00964962_g1). Ako referencia sa použilo normálne ľudské mozoček (Clontech-Takara Bio Europe, Saint-Germain-en-Laye, Francúzsko). Relatívna génová expresia sa vypočítala pre každý gén, ktorý nás zaujíma, pomocou metódy ACT, pri ktorej sa hodnoty prahových hodnôt cyklu ( CT ) normalizovali na gény RNA pre domácnosť, malú jadrovú U6 U6 ( RNU6B ), podjednotku A sukcinát dehydrogenázy A ( SDHA ). (Hs00188166_m1) a 18S (Hs99999901_s1) (Applied Biosystems, Life Technology).

Promótorová metylačná analýza génov miR-9

Stav metylácie promótorov génov miR-9-1 , -2 a -3 bol analyzovaný metylačne špecifickou PCR (MSP) v MB bunkových líniách a 64 primárnych vzorkách MB tkanív. Bisulfitová konverzia DNA sa uskutočňovala pomocou EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research Co., Irvine, CA, USA) podľa pokynov výrobcu. Priméry a protokol použité na MS-PCR boli už skôr opísané (Lujambio a kol., 2008; Bandres a kol., 2009). Pre každú reakciu MS-PCR bola ako pozitívna kontrola zahrnutá univerzálna metylovaná DNA (Chemicon International, Temecula, CA, USA) a ako negatívna kontrola bola použitá normálna lymfocytová DNA. Vzorky normálneho tkaniva na parafínových rezoch sa použili ako negatívne kontroly. Produkty PCR boli spracované na 3% agarózovom géli a boli vizualizované pomocou UV trans-osvetlenia (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Metylované pásy boli detegovateľné, ak bolo> 25% DNA metylovaných. Podobne, metylované pásy neboli detegovateľné, keď bola všetka DNA nemetylovaná a naopak, čo potvrdilo citlivosť a špecifickosť metódy.

In silico hľadajte cieľové gény miR-9

Predpovede o interakciách miR-9-HES1 boli extrahované buď z databáz, ktoré predpovedajú cieľové sekvencie miRNA, napríklad TargetScan (Lewis a kol., 2003), Pictar (Krek a kol., 2005), algoritmus DIANA-microT 3.0 (Maragkakis a kol., 2009) a microRNA.org (Betel a kol., 2008) alebo z databáz, ktoré dokážu predpovedať väzbové miesta miRNA na potenciálnych cieľových génoch, ako napríklad StarBase v2.0 (Yang a kol., 2011), microPIR (Piriyapongsa a kol., 2012), a miRWalk (Dweep a kol., 2011).

Analýza westernovým prenosom a imunofluorescencia

Analýzy Western blotting boli uskutočňované tak, ako boli publikované skôr (Fiaschetti et al, 2011). Membrány sa inkubovali s nasledujúcimi prvými protilátkami: HES1 (H-140) (sc-25392, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), p- tubulín triedy III (TUBB3) (2G10) (Ab78078, Abcam, Cambridge), UK), homológ MASH1 / Achaete-scute 1 (ab38557, Abcam) a Cip1 / WAF-1 / p21 (CP74) (P1484, Sigma-Aldrich, Buchs, Švajčiarsko). Detekcia proteínov sa uskutočňovala pomocou Supersignal Western Bio Chemoluminiscenčného substrátu (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA). Ako kontrola plnenia sa použil p- aktín (AC-74) (A5316, Sigma-Aldrich). Na imunofluorescenčné farbenie boli bunky fixované v 4% PFA a blokované v médiu obsahujúcom 10% FCS a 0, 5% Triton. Bunky sa farbili cez noc pri 4 ° C na NES (196908) (MAB1259, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) a TUBB3 (Ab78078, Abcam). Ako sekundárne protilátky sa použili protilátky Alexa Fluor 488 alebo 594 (1/200) (Invitrogen, Life Technology). Všetky zafarbenia sa analyzovali Axioskop2 mot plus fluorescenčným mikroskopom (Zeiss, Jena, Nemecko).

Analýza bunkového cyklu a apoptózy

MB bunky boli pozbierané, premyté PBS a okamžite fixované v 5 ml ľadom chladeného 70% etanolu. Pred analýzou prietokovou cytometriou boli bunky resuspendované v 300 ul roztoku propidiumjodidu, boli pridané 2 ul RNázy (100 mg ml- 1 ) a bunky boli inkubované pri 37 ° C počas 45 minút. Analýza prietokovou cytometriou bola uskutočnená na prístroji BD FACS Canto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) podľa protokolu odporúčaného výrobcom. Dáta sa zbierali pomocou softvéru DIVA (BD Biosciences) a analyzovali sa pomocou softvéru FlowJo (TreeStar Inc., Ashland, OR, USA) s použitím vhodných kontrol a brán.

Aktivácia kaspáz 3 a 7 sa detegovala pomocou testu Caspase-Glo 3/7 (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Zafarbenie annexinu V – APC (550475, BD Biosciences) sa meralo prietokovou cytometriou. Indukcia apoptózy bola potvrdená kvantifikáciou fragmentov DNA asociovaných s kameňmi pomocou testu ELISA PLUS na detekciu smrti (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Švajčiarsko).

Transfekcia buniek a ošetrenie 5-Aza-2'-deoxycytidínom (5-Aza)

Bunky boli vysiate na šesťjamkové doštičky pri hustote buniek 4 x 104 (DAOY, PFSK) a 2 x 105 (D341, D425). Transfekcia pre- miR-9 (PM10022, Ambion) alebo negatívnej kontroly oligonukleotidu označovaného ako skramblovaný (AM17110, Ambion) v konečnej koncentrácii 30 nmol 1 −1 sa vykonala s použitím transfekčného činidla siPORT NeoFX (Ambion) podľa odporúčaní výrobcu., Účinnosť transfekcie sa hodnotila s FAM-značenou pre -miR-9 negatívnou kontrolou (AM17121, Ambion) 24 hodín po transfekcii. FAM-pozitívne bunky boli počítané pod fluorescenčným mikroskopom a vyjadrené ako percento z celkového počtu buniek. Pre každú vzorku bolo spočítaných šesť náhodných polí. Bunky DAOY a PFSK (70 - 80% konfluentné) boli transfekované s použitím HES1 siRNA (ID 6922, Ambion, Silencer select vopred navrhnutá siRNA) pri 20 nM konečnej koncentrácii. Ako kontrola sa použije siRNA č. 1 (AM4611, Ambion) sa použil za rovnakých podmienok. Bunky sa odobrali 48 a 72 hodín po transfekcii na následnú kvantitatívnu analýzu qRT-PCR a analýzu westernovým prenosom. Bunky sa umiestnili na šesťjamkové doštičky a pred ďalšou analýzou sa na ne počas 24 až 48 hodín pôsobilo 0, 1 m M 5-Aza (A3656; Sigma-Aldrich) alebo kontrola (DMSO).

Konštrukcia 3'UTR reportérových plazmidov a luciferázových testov

459-bp fragment 3'UTR HES1 obsahujúci predpokladané miR-9 väzobné miesto bol PCR-amplifikovaný z genómovej DNA buniek PFSK (FW: 5'-AAAACTCGAGAACGCAGTGTCACCTTCC-3 ', RE: 5'-AAAACTCGAGCAGTTCGAAGACATA'AAGCC). 459-bázový párový segment bol navrhnutý tak, aby obsahoval miesta Xhol a NotI a bol klonovaný do vektora psiCHECK-2 (Promega Corporation), medzi miestom Xhol a NotI, bezprostredne 3 'po prúde od génu luciferázy renilla. Všetky konštrukty boli overené sekvenovaním DNA. Desať nanogramov konštrukcie psiCHECK-2 sa ko-transfekovalo s 10 nM miR-9 duplexom alebo skramblovaným duplexom do buniek HEK-293T v 96-jamkovej doštičke s použitím lipofektamínu-2000 (Invitrogen). Po 48 hodinách sa získal bunkový extrakt; Aktivity luciferázy svetlušiek a renily sa merali pomocou reportérového systému Dual-Luciferase (Promega Corporation) podľa pokynov výrobcu.

Štatistická analýza

Všetky experimenty sa uskutočňovali najmenej trojmo. Údaje sú vyjadrené ako priemer ± sd. Pre experimenty in vitro bol použitý Studentov t-test. Hodnoty P <0, 05 sa považovali za významné. Pearsonov korelačný test sa použil na génovú koreláciu vo vzorkách pacienta.

výsledok

Hypermetylácia CpG ostrova špecifická pre nádor znižuje expresiu miR-9 v MB bunkách

Aby sme získali prehľad o expresii miR-9 v MB, analyzovali sme kohortu primárnych vzoriek MB ( n = 29) a šesť bunkových línií odvodených od MB. V porovnaní s normálnym ľudským fetálnym mozočkom bola pozorovaná znížená hladina expresie miR-9 vo väčšine nádorových tkanív MB (obrázok 1A a doplnkový obrázok S1A) a vo všetkých šiestich testovaných bunkových líniách (obrázok 1B, horný panel). Aby sme potvrdili, že down - regulácia miR-9 je bežným znakom v MB, validovali sme naše zistenia v nezávislej, neprekrývajúcej sa kohorte primárnych MB ( n = 88) s informáciami o molekulárnych podskupinách. Zistilo sa, že expresia miR-9 je nižšia vo veľkej podskupine vzoriek nádorov MB (91%, 80/88) ako v normálnom fetálnom mozočku, bez ohľadu na ich genetické pozadie (obrázok 1C). Spomedzi štyroch molekulárnych podtypov MB bola miR-9 downregulácia najvýraznejšia v podskupinách WNT a skupiny 3, ktoré sa vyznačujú vysokou expresiou proto-onkogénu MYC (obrázok 1C a doplnkové obrázky S1B a C). Naopak, nádory skupiny 4, ktoré sa vyznačujú expresiou vysokých hladín génov zapojených do neuronálnej diferenciácie, vykazujú vyššie hladiny miR-9 ako iné podskupiny, ktoré sú porovnateľné s normálnymi vzorkami mozgu.

Image

Expresia miR-9 je epigeneticky potlačená v MB bunkách. Relatívna expresia miR-9 stanovená pomocou qRT – PCR ( A ) v 15 čerstvých, zmrazených primárnych vzorkách MB a ( B ) v uvedených MB bunkových líniách. Hodnoty predstavujú násobné zníženie miR-9-2 mRNA expresie relatívne k normálnemu mozočku. Bodkovaná čiara označuje úroveň mozočku pri ľubovoľnej hodnote = 1. ( A a B, dolné panely) Stav metylácie troch miR-9 génov v zodpovedajúcich MB vzorkách a bunkových líniách. ( C ) Boxové grafy ukazujúce relatívnu expresiu miR-9-2 naprieč MB podskupinami v porovnaní s fetálnym mozgom. Relatívna expresia je miera svietivosti signálu génovej sondy, korigovaná na svietivosť pozadia každého poľa a normalizovaná pomocou kontrolných sond naprieč rôznymi poliami. ( D ) qRT-PCR analýza miR-9 v uvedených ľudských MB bunkových líniách ošetrených 5-Aza alebo kontrolou (DMSO). (* P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 podľa Studentovho t- testu.) ( E ) Agarózový gél ukazujúci produkty MS-PCR troch CGG ostrovných oblastí troch miR-9 v 49 FFPE MB primárnych vzoriek. Dolný panel predstavuje metylačný stav troch miR-9 génov v zodpovedajúcich MB vzorkách. Skratky: M = metylovaný; NC = negatívna kontrola; NS = nevýznamné; PC = pozitívna kontrola; U = nemethylovaný.

Obrázok v plnej veľkosti

Tumor-supresorové gény sa môžu inaktivovať rôznymi spôsobmi, vrátane hypermetylácie promótora CpG (Esteller, 2002). Naše predbežné vyšetrenie neodhalilo žiadne delécie v génoch miR-9 v MB bunkách (doplnkový obrázok S1D). Aby sme určili, či hypermetylácia spôsobila zníženú expresiu miR-9 v MB bunkách, skúmali sme metyláciu promótorových oblastí hsa -miR-9 pomocou MSP. Hsa -miR-9 je predstavovaný tromi genomickými lokusmi hsa -miR-9-1 (1q22), hsa -miR-9-2 (5q14.3) a hsa -miR-9-3 (15q26.1) (Bandres) a kol., 2009). Všetky tri lokusy mohli nezávisle prispieť k expresii miR-9 . Na rozdiel od normálneho mozočka boli tri miR-9 lokusy nezávisle metylované v podskupine primárnych vzoriek s nízkou expresiou miR-9 a vo všetkých testovaných MB bunkových líniách (obrázok 1A a B, dolné panely).

Na stanovenie kauzálneho vzťahu medzi metyláciou a nízkou úrovňou expresie miR-9 sme ošetrili MB bunky demetylačným činidlom 5-Aza. Po ošetrení 5-Aza sa expresia miR-9 výrazne zvýšila vo všetkých bunkových líniách MB s výnimkou buniek D341, kde sa pozoroval iba malý nárast (obrázok 1D), čo potvrdzuje úlohu metylácie promótora pri umlčaní miR-9 . Aby sa určila úloha epigenetickej regulácie hsa -miR-9 v klinicky relevantnejšom modeli, analyzoval sa stav metylácie promótora troch génov has -miR-9 v paneli 64 MB vzoriek pomocou analýzy MSP. U 78% (50/64) MB pacientov vykazoval aspoň jeden z troch lokusov miR-9 metyláciu promótora (obrázok 1A, spodný panel a 1E). Konkrétne boli promótorové oblasti miR-9-1 metylované v 64% (41/64) a miR-9-2 boli metylované v 73% (47/64), zatiaľ čo promótor miR-9-3 bol metylovaný v 34 % (23/64) prípadov MB. Tieto výsledky naznačujú, že znížená expresia miR-9 nájdená vo vzorkách tkanív a bunkových líniách MB je pravdepodobne spôsobená aberantnou metyláciou jedného alebo viacerých z troch pre -miR-9 paralogických lokusov.

MYC sa podieľa na regulácii hladín miR-9 v MB

Vzhľadom na významnú úlohu aberantného MYC v patogenéze MB (Northcott a kol., 2012b) a jeho schopnosť priamo sa viazať na promótorovú oblasť miR-9 (Ma a kol., 2010) sme skúmali, či sa MYC podieľa na regulácii miR. -9 expresia v MB bunkách. Analýza profilov génovej expresie 285 MB odhalila štatisticky významnú negatívnu koreláciu medzi úrovňou miR-9 a expresiou MYC vo vzorkách primárnych nádorov (obrázok 2A). Podobná inverzná korelácia bola pozorovaná, keď boli úrovne expresie MYC a miR-9 analyzované v reprezentatívnom paneli MB bunkových línií. Hladiny miR-9 boli vyššie v bunkových líniách nesúcich nízku hladinu MYC (DAOY a PFSK), zatiaľ čo bunky vysokej MYC (D341 a D425) vykazovali relatívne nízku expresiu miR-9 (obrázok 2B). Na overenie tohto zistenia sme skúmali hladinu miR-9 v MB bunkách ektopicky nadmerne exprimujúcich MYC (DAOY-MYC) a porovnali sme ju s bunkami transfekovanými prázdnymi vektormi (bunky s nízkym obsahom MYC-DAOY) (Stearns et al, 2006). Nadmerná expresia MYC viedla k 30% zníženiu expresie miR-9 (obrázok 2C), čo naznačuje zapojenie MYC do regulácie expresie miR-9 v MB bunkách.

Image

Onkogén MYC sa podieľa na regulácii expresie miR-9. ( A ) Korelácia medzi expresiou miR-9 a MYC mRNA v súboroch vzoriek pacientov s 285 MB, ako sa určilo pomocou profilov expresných profilov založených na mikročipoch (Northcott et al, 2012b; r = Pearsonov korelačný koeficient). ( B ) Relatívna mRNA expresia MYC (ľavá os y) a expresia miR-9 (pravá os y) v uvedených bunkových líniách, ako sa stanoví pomocou qRT – PCR. ( C ) Relatívna mRNA expresia MYC (ľavá os y) a expresia miR-9 (pravá os y) v bunkách DAOY transfekovaných prázdnym vektorom (nízka MYC) a v bunkách DAOY transfekovaných MYC (vysoká MYC), ako sa stanoví pomocou QRT-PCR. ( D ) Relatívna expresia miR-9 v MYC-transfekovaných DAOY bunkách po 24 h ošetrenia 5-Aza, ako sa stanovilo pomocou qRT-PCR. (* P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 podľa Studentovho t-testu.)

Obrázok v plnej veľkosti

Bola hlásená represia niekoľkých miRNA sprostredkovaná MYC (Chang a kol., 2008; Bui a Mendell, 2010), hoci základné mechanizmy nie sú úplne objasnené (Frenzel a kol., 2010). S cieľom potvrdiť schopnosť MYC sprostredkovať down - reguláciu miR-9 v MB a objasniť mechanizmy, ktoré sú za ňou, sme skúmali, či je potrebná metylácia DNA na potlačenie miR-9 sprostredkované MYC. Skutočne, potlačenie miR-9 vyvolané MYC bolo pôsobené pôsobením 5-Aza, čo naznačuje, že onkogénový MYC sa podieľa na znižovaní hladiny miR-9 pravdepodobne reguláciou stavu metylácie DNA promótora miR-9 .

miR-9 reguluje expresiu ľudského génu HES1 v MB

Aby sme identifikovali predpokladané ciele pre miR-9 s možnými implikáciami v biológii nádorov MB, uskutočnili sme vyhľadávanie pomocou silikónu pomocou niekoľkých nezávislých databáz. Medzi potenciálnymi cieľmi miR-9 , založenými na ochrane cieľového miesta u ľudí, rôzne programy identifikovali gén HES1 (chlpatý a zosilňovač split 1) ako potenciálny cieľ pre miR-9 (obrázok 3A a doplnkový obrázok S2A). Pretože HES1 má ústrednú úlohu pri normálnom vývoji mozgu a pri patogenéze MB (Hallahan a kol., 2004; Dakubo a kol., 2006; de Bont a kol., 2008; Ingram a kol., 2008), rozhodli sme sa zamerať naše ďalšie skúmanie na miR -9 - sprostredkovaná regulácia HES1.

Image

miR-9 reguluje expresiu HES1 v MB bunkách. ( A ) Sekvenčné zoradenie predpokladaného miR-9 väzbového miesta v 3'UTR HES1 promótora (oblasť komplementárna so semenami). ( B - D ) Korelačná štúdia expresie miR-9 a HES1 v troch nezávislých súboroch vzoriek pacientov s MB, ako sa stanovilo pomocou qRT – PCR a expresných profilov založených na mikročipoch. ( r = Pearsonov korelačný koeficient). ( E ) Korelačná štúdia hladín HES1 a miR-9 podľa MB podskupín (WNT, SHH, skupina 3, skupina 4) ( n = 88). ( F ) Luciferázová reportérová aktivita v bunkách 293T transfektovaných s pre -miR-9 alebo negatívnou kontrolou a kotransfektovaných s vektorom pisCheck2 obsahujúcim 3'UTR génu HES1 po prúde luciferázového reportérového génu svetlušky. ( G ) Relatívna expresia miR-9 stanovená pomocou qRT – PCR 48 hodín po transfekcii buď pre -miR-9 alebo kontrolou v uvedených MB bunkových líniách. Hodnoty predstavujú násobné zvýšenie miR-9 mRNA v porovnaní s kontrolou. (* P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 podľa Studentovho t-testu.) ( H ) Pre -miR-9 sprostredkovala down - reguláciu expresie HES1 proteínu v reprezentatívnom imunoblotingovom experimente.

Obrázok v plnej veľkosti

Aby sme získali prehľad o interakcii miR-9 / HES1 v MB, porovnali sme expresiu transkriptov HES1 a miR-9 v primárnych vzorkách MB. Pilotná analýza 15 MB odhalila miernu inverznú koreláciu medzi expresiou hladín HES1 a miR-9 (obrázok 3B). Na ďalšie potvrdenie týchto zistení sme analyzovali vzťah medzi transkriptmi HES1 a miR-9 v dvoch nezávislých súboroch 285 a 88 primárnych MB nádorov (Northcott et al, 2012b). Analýza potvrdila, že úrovne expresie miR-9 a HES1 sú nepriamo korelované v oboch súboroch údajov (obrázok 3C a D; doplnkový obrázok S2B a C). Analýza MB sugroupov odhalila negatívnu koreláciu medzi miR-9 a HES1 naprieč SHH, skupinou 3 a skupinou 4 MB v oboch sériách vzoriek MB pacientov (obrázok 3E a doplnkový obrázok S2D). Na rozdiel od iných podskupín nádory WNT preukázali pozitívnu koreláciu medzi expresiou miR-9 a HES1 . Aj keď počet vzoriek WNT v analyzovanej kohorte nie je dostatočne veľký na potvrdenie tohto pozorovania, neočakávané výsledky získané pri analýze prípadov WNT môžu odrážať charakteristický podpis mikroRNA existujúci v podskupine WNT (Gokhale et al, 2010).

Aby sme funkčne potvrdili reguláciu expresie HES1 miR-9 , navrhli sme luciferázový reportér fúzovaný buď so sekvenciou HES1 3'UTR divokého typu alebo so sekvenciou, ktorá nesie mutáciu v komplementárnom regióne semien miR-9 . Expresia luciferázového reportéra divokého typu v bunkách 293T bola významne potlačená mimikmi prekurzorov miR-9 (pre -miR-9 ) v porovnaní s kódovanými prekurzormi, zatiaľ čo expresia mutovaného luciferázového reportéra nebola významne ovplyvnená, čo potvrdzuje priamu represiu HES1 miR-9 (obrázok 3F). Potom sme skúmali účinok nadmernej expresie miR-9 na hladinu proteínu HES1 v MB bunkových líniách. Ektopická obnova nízkej endogénnej expresie miR-9 (obrázok 3G) účinne spustila 30% zníženie hladiny proteínu HES1 (obrázok 3H a doplnkový obrázok S2E). Tento výsledok bol potvrdený v dvoch ďalších MB bunkových líniách (doplnkový obrázok S2E). Celkovo tieto zistenia ukazujú, že miR-9 reguluje expresiu HES1 a naznačuje HES1 ako funkčný cieľ miR-9 v MB bunkách.

Obnovenie miR-9 v MB bunkách indukuje zastavenie bunkového cyklu a zhoršuje klonálny rast

HES1 riadi rast nádorových buniek prostredníctvom transkripčnej represie inhibítorov bunkového cyklu, ako je napríklad p21 (waf1 / Cip1), ktorý je ústredným prvkom regulácie bunkového cyklu a je zmenený vo veľkej väčšine ľudských rakovín vrátane MB (obrázok 4A; Kabos et al.), 2002; Murata a kol., 2005; Monahan a kol., 2009). Predpokladali sme, že potlačením obnovenia HES1 miR-9 by sa mohla obmedziť onkogénna indukcia progresie bunkového cyklu v MB bunkách zvýšením regulácie p21. Na testovanie tejto možnosti sme zmerali distribúciu bunkového cyklu, zmeny v expresii p21 a schopnosť MB buniek rásť klonálne po obnovení miR-9 . MB bunky transfekované s pre -miR-9 vykazovali konzistentné zmeny v distribúcii bunkového cyklu v porovnaní s kontrolne transfekovanými bunkami. Pozorovali sme pokles počtu buniek v S-fáze a zvýšenie buniek v G1 fáze, čo svedčí o zastavení bunkového cyklu. Analogicky siRNA sprostredkované umlčanie HES1 znížilo počet buniek v S-fáze, čím sa fenoskopicky ovplyvnili účinky nadmernej expresie miR-9 (obrázok 4B a C). Obnovenie miR-9 malo za následok zvýšenie p21, a to tak na úrovni mRNA, ako aj na proteínoch, v porovnaní s MB bunkami, ktoré boli transfekované kontrolou (obrázok 4D). Transfekcia dvoch ďalších MB bunkových línií s pre -miR-9 potvrdila tento výsledok (doplnkový obrázok S3A). Aj keď obnovenie miR-9 neovplyvnilo životaschopnosť buniek, starnutie buniek (údaje nie sú uvedené) alebo bunková smrť (doplnkový obrázok S3B a C), znížilo bunkovú schopnosť tvoriť kolónie (obrázok 4E) a znížilo veľkosť a počet neuronálnych sfér (obrázok 4F). Celkovo tieto výsledky poukazujú na potenciálny prínos obnovy miR-9 oproti rastu MB buniek.

Image

Obnovenie miR-9 reguluje HES1 responzívny gén P21 Cip1 a zhoršuje klonálny rast MB buniek. ( A ) Karikatúra znázorňujúca prehľad downstream responzívnych génov miR-9 a ich funkcií. ( B, C ) Prietoková cytometrická analýza distribúcie bunkového cyklu pre uvedené MB bunkové línie 72 hodín po transfekcii buď s pre -miR-9 alebo kontrolou a s HES1 siRNA alebo siRNA skramblovanou kontrolou. ( D ) Pre-miR9 sprostredkovala upreguláciu expresie mRNA p21 (horný panel) a proteínu (dolné panely) v uvedených MB bunkových líniách. ( E ) Tvorba kolónií a ( F ) analýza tvorby guľôčok ľudských MB DAOY buniek ošetrených s pre -miR-9 alebo kontrolou počas 6 dní. Spodné panely: reprezentatívne obrázky. (* P <0, 05, ** P <0, 01 podľa Studentovho t-testu.)

Obrázok v plnej veľkosti

Obnovenie miR-9 v MB bunkách podporuje nervovú diferenciáciu

Indukcia endogénnej HES1 inhibuje neuronálnu diferenciáciu (Kageyama a Ohtsuka, 1999; Ohtsuka a kol., 1999), zatiaľ čo knockout alebo mutácia HES1 vedie k diferenciácii neurónov in vivo (obrázok 5A) (Ishibashi a kol., 1995; Tomita a kol., 1996), Vzhľadom na dôležitú regulačnú funkciu HES1 v neuronálnej diferenciácii (Kabos a kol., 2002; Sang a kol., 2008) sme predpokladali, že represia HES1 sprostredkovaná miR-9 by mohla spustiť diferenciáciu MB buniek. Na otestovanie tejto možnosti sme vyhodnotili účinok obnovenia miR-9 na diferenciáciu MB buniek. Úroveň expresie mRNA panela kanonických neurálnych diferenciačných markerov bola analyzovaná pomocou qRT-PCR: neurogénna diferenciácia 1 (NEUROD1) (Lee a kol., 1995), neurofilament H (NEFH) (Lee a Cleveland, 1996), neurón-špecifická mikrotubula- asociovaný proteín (MAP2) (Dinsmore a Solomon, 1991), nestín (NES) (Wiese a kol., 2004), β- tubulín 3 triedy III (TUBB3) (Katsetos a kol., 2003) a gliový fibrilárny kyslý proteín (GFAP). (Eng a kol., 2000). Transfekcia MB buniek pomocou pre-miR-9 viedla k upregulácii mRNA expresie podskupiny neurálnych diferenciačných markerov v MB bunkách v porovnaní s kontrolami (obrázok 5B). Spomedzi DAOY buniek ošetrených pre-miR-9, niektoré boli vo vzájomnom kontakte prostredníctvom svojich vetviacich výčnelkov, čo naznačuje primárne štádium diferenciácie (obrázok 5C, horný panel), zatiaľ čo bunky ošetrené kontrolou si udržali plochú morfológiu. Imunoflorescenčná analýza potvrdila na proteínovej úrovni, že po reexpresii miR-9 obe bunkové línie vykazovali upreguláciu TUBB3 a nestínu (obrázok 5C a doplnkový obrázok S4A) (Bhoopathi et al, 2011). Aby sme určili príspevok represie HES1 na účinky sprostredkované miR-9 na neuronálnu diferenciáciu, skúmali sme účinky tlmenia HES1 na expresiu markerov neuronálnej diferenciácie mRNA. Ako bolo pozorované v MB bunkách ošetrených s pre -miR-9 , siRNA-sprostredkované knockdown HES1 malo za následok upreguláciu podskupiny neurónových diferenciačných génov (doplnkový obrázok S4B). Podobne ako účinky spôsobené obnovením miR-9 , expresia génov NeuroD1 , Nestin a GFAP bola upregulovaná umlčaním HES1. Zdá sa teda, že regulácia HES1 sprostredkovaná miR-9 je základným aspektom funkcie miR-9 pri diferenciácii MB buniek.

Image

Obnova miR-9 sprostredkuje zvýšenie expresie panelu pro-neurálnych diferenciačných génov v MB bunkách. ( A ) Karikatúra znázorňujúca prehľad miR-9 / HES1 génov reagujúcich na neuronálnu diferenciáciu. ( B ) Relatívna mRNA expresia indikovaných pro-nervových diferenciačných génov stanovená pomocou qRT – PCR 72 h po transfekcii buď pre -miR-9 alebo kontrolou. Hodnoty predstavujú násobnú zmenu vzhľadom na kontrolu (* P <0, 1, ** P <0, 01 podľa Studentovho t- testu). ( C ) Morfologické zmeny MB buniek po obnovení miR-9 a imunofluorescenčnej analýze β- tubulínu triedy III (TUBB3) a nestínu (NES) 72 hodín po transfekcii buď pre -miR-9 alebo kontrolou. ( D ) Korelačná štúdia expresie miR-9 / HES1 a vybraných pro-nervových diferenciačných génov vo vzorkách 285 MB pacientov, ako sa určilo pomocou profilov expresných profilov založených na mikročipoch ( r = Pearsonov korelačný koeficient).

Obrázok v plnej veľkosti

Na overenie našich výsledkov v klinicky relevantnom modeli sa analyzovali údaje o profilovaní expresie založené na mikročipoch získané zo súboru 285 MB nádorov (Northcott et al, 2012b), pričom sa hľadali korelácie medzi hladinami miRNA miR-9 , HES1 a predtým vybranými neurónmi. diferenciačné značky. Bol nájdený trend pozitívnej korelácie medzi mRNA expresiou MAP2 , TUBB3 a NEUROD1 a miR-9-2 (obrázok 5D, horné panely), paralelne s inverznou koreláciou s expresiou mRNA HES1 (obrázok 5D, dolné panely). Analýza expresie miR-9-1 a miR-9-3 v rovnakých MB vzorkách tiež ukázala podobné výsledky, aj keď menej štatisticky významné (doplnkový obrázok S4C a D).

HES1 regulačná funkcia v stave diferenciácie buniek bola predtým preukázaná ako sprostredkovaná génom pro-neurálnej diferenciácie MASH1 (Kageyama a kol., 1997). Preto sme určili, či obnovenie miR-9 ovplyvnilo expresiu MASH1. Okrem downregulácie HES1 sme skutočne pozorovali mierne, ale merateľné zvýšenie hladiny proteínu MASH1 v porovnaní s kontrolne transfektovanými bunkami (doplnkový obrázok S4E). Tieto výsledky naznačujú, že miR-9 má rozhodujúcu úlohu v MB bunkách znížením diferenciácie MB buniek a zdôrazňujú potenciálne využitie obnovy miR-9 na reaktiváciu diferenciačného programu v rakovinových bunkách.

Expresia miR-9 a HES1 sa spája s klinicko-patologickými charakteristikami detskej MB

Nakoniec sme skúmali spojenie expresie miR-9 a HES1 s klinicko-patologickými charakteristikami detskej MB. Do súčasnej klasifikácie WHO sú zahrnuté tri hlavné histologické podtypy MB (Sarkar a kol., 2006), z ktorých veľké anaplastické (LC / A) MB predstavujú výraznejší a agresívnejší variant v porovnaní s klasickými a desmoplastickými podtypmi (Leonard a kol., 2001; von Hoff a kol., 2010). Na stanovenie vzťahu expresie miR-9 s histopatologickými subtypmi MB sme analyzovali sadu primárnych vzoriek MB s dostupnými informáciami o histologických znakoch. Vzorky LC / A MB majú prekvapivo nižšiu expresiu miR-9-2 v porovnaní s ostatnými variantmi. Predovšetkým sa pozorovala štatisticky významná diferenciálna expresia pri porovnaní LC / A MB s nádormi klasického podtypu (obrázok 6A). Analýza miR-9-1 a miR-9-3 expresného vzoru v rovnakých MB vzorkách ukázala podobný trend nepriamo korelovať s anaplastickými MB subtypmi (doplnkový obrázok S5A a B), čo potvrdzuje hypotézu, že MB tkanivá so zníženou expresiou miR -9 majú tendenciu mať závažnejší patologický stupeň. Najmä LC / A MB tiež vykazovali mierne vyššiu expresiu HES1 (obrázok 6B). Ďalej, aby sa určil potenciálny vplyv miR-9 na klinický výsledok, úroveň expresie miR-9 korelovala s prežitím. Informácie o prežití pacienta boli k dispozícii pre 34 MB vzoriek. Nižšia celková pravdepodobnosť prežitia pacientov s nízkou expresiou miR-9-2 odhalená Kaplanovou-Meierovou analýzou naznačuje silný trend smerom k prognostickej významnosti (obrázok 6C). Aj keď nedosiahla štatistickú významnosť, analýzy expresného vzorca miR-9-1 a miR-9-3 v rovnakých vzorkách MB ukázali podobnú inverznú koreláciu medzi expresiou miR-9 a prežitím pacienta (doplnkový obrázok S5C a D). Okrem toho, v súlade s predchádzajúcimi správami (Cho a kol., 2011), vysoká expresia HES1 významne korelovala s nižším celkovým prežitím v zreteľnej kohorte 129 MB vzoriek (obrázok 6D). Skúmali sme tiež vzťah medzi expresiou miR-9 a metastatickým štádiom, vekom a pohlavím v tej istej skupine vzoriek MB, ale nezistili sme žiadnu významnú koreláciu (údaje nie sú uvedené). Tieto dáta spolu naznačujú, že nízka expresia miR-9 (najmä miR-9-2 ) a následne zvýšená expresia HES1 by mohla byť spojená s horším MB klinickým výsledkom. Preto sa miR-9 môže považovať za kandidáta na marker predpovedajúci nepriaznivú prognózu pre pacientov s pediatrickými MB, ktorí si zaslúžia ďalšie validačné štúdie.

Image

Expresia miR-9 a HES1 je spojená s klinicko-patologickými charakteristikami detskej MB. Rámcové grafy znázorňujúce ( A ) miR-9-2 a ( B ) HES1 expresiu podľa MB histologických variantov: klasické ( n = 200), (desmo) desmoplastické ( n = 21) a (Lca) veľké bunky / anaplastické ( n = 30); stredová čiara = stredná. (* P <0, 05, *** P <0, 001 podľa Studentovho t-testu.) ( C ) Kaplan-Meierove krivky prežitia pre expresiu miR-9-2 v detských MB. Pacienti boli rozdelení do skupín s vysokou ( n = 17) a nízkou ( n = 17) miR-9 expresiou na základe strednej hodnoty expresie v každej populácii. ( D ) Kaplan-Meierove krivky prežitia pre expresiu HES1 v detských MB. Pacienti boli rozdelení do skupín s vysokou ( n = 13) a nízkou ( n = 116) HES1 expresiou na základe strednej hodnoty expresie v každej populácii. Optimálny výber medzných hodnôt bol kombinovaný s Bonferroniho korekciou kvôli nízkemu počtu nádorov exprimujúcich HES1 .

Obrázok v plnej veľkosti

diskusia

Súčasná štúdia poskytuje dôkaz, že v detskej MBR miR-9 je významne znížená v porovnaní s normálnym fetálnym mozgom a že miR-9 má tumor-supresorovú úlohu v nádoroch MB. Hodnotili sme prognostický význam týchto zistení, pretože funkčná úloha ani diagnostické implikácie miR-9 v MB neboli predtým definované. Naše skúmanie odhalilo, že znížená expresia miR-9 v MB bunkách je do značnej miery spôsobená hypermetyláciou promótora CpG promótora špecifického pre nádor, čo bol nález predtým potvrdený v iných typoch rakoviny (Lehmann a kol., 2008; 2009). Epigenetická deregulácia génov miRNA zdôrazňuje potenciálny mechanizmus implikovaný vo vývoji rôznych malignít. Vzhľadom na vysokú frekvenciu metylácie v miR-9 promótore u detských MB sme v tejto štúdii odhalili, že stupeň metylácie promótorov miR-9 génov by sa mohol považovať za možný užitočný nádorový marker. Okrem toho by použitie demetylačných činidiel DNA mohlo mať významné dôsledky pre pacientov s rakovinou, čím by sa vybraným pacientom s MB otvorilo nové terapeutické stratégie.

U MB, ako u niektorých ľudských rakovín, je deregulácia onkogénu MYC spojená s patogenézou nádoru. Aj keď sa pri rakovine prsníka pozorovala indukcia miR-9 sprostredkovaná MYC (Khew-Goodall a Goodall, 2010), naše údaje skôr naznačujú potenciálnu patologickú funkciu MYC v MB, ktorá zahŕňa potlačenie expresie miR-9 . Táto represia miR-9 pravdepodobne zahŕňa epigenetické umlčanie, čo zdôrazňuje osobitnú, kontextovo závislú reguláciu miRNA sietí v rôznych nádorových prostrediach. Toto pozorovanie okrem toho zdôrazňuje názor, že MYC sprostredkovaná represia miRNA, ktorá potláča nádory, ako je miR-9 , môže byť základnou zložkou MURC nádorových programov v MB, najmä v MB podskupinách exprimujúcich vysoké hladiny MYC. V skutočnosti bola miR-9 regulácia najvýraznejšia u nádorov WNT a skupiny 3, ktoré vysoko exprimujú onkogén MYC. Naopak, prípady skupiny 4 zriedka exprimujú vysoké hladiny MYC (Northcott a kol., 2011) a vyznačujú sa nadmerným zastúpením génov zapojených do neuronálnej diferenciácie (Cho a kol., 2011; Taylor a kol., 2012). To je v súlade s našimi zisteniami, ktoré korelujú vysoké hladiny miR-9 s indukciou bunkovej diferenciácie. Je zaujímavé, že nádory skupiny 4 sú charakterizované vysokými hladinami NMYC, čo naznačuje odlišné funkčné významy MYC a NMYC pre expresiu miR-9 v MB.

Náš experimentálny dôkaz ukazuje, že HES1 je priamym cieľom translačnej inhibície sprostredkovanej miR-9 v MB bunkách, čo potvrdzuje nedávnu správu o účinkoch sprostredkovaných miR-9 na homológ cicavčej HES1 (Hairy1) u stavovcov (Bonev a kol., 2012). To je veľmi významné, pretože HES1, jeden z hlavných cieľových génov NOTCH, riadi rozhodnutia o osudoch buniek nervových progenitorových buniek cicavcov, z ktorých pochádzajú MB (Solecki a kol., 2001; Pomeroy a kol., 2002). Okrem toho je klinicky relevantná inverzná korelácia medzi expresiou miR-9 a HES1 v rôznych nezávislých súboroch vzoriek pacientov s MB. Analýza špecifickej pre miR-9 a HES1 špecifická pre podskupinu odhalila negatívnu koreláciu v MB-non-WNT. Na druhej strane MB typu WNT vykazovali skôr nárast expresie miR-9 . To by mohlo naznačovať, že miR-9 má podskupinový špecifický účinok na translačnú inhibíciu a reguluje rôzne ciele v WNT MB, analogické s výraznými podpismi mikroRNA navrhovanými v podskupine WNT (Gokhale et al, 2010). Na potvrdenie tejto predpovede je však potrebná analýza väčšej skupiny nádorov WNT.

Naše výskumy ukázali, že obnovenie expresie miR-9 viedlo k zastaveniu fázy G1 / S bunkového cyklu v MB bunkách a že nádorová supresívna úloha miR-9 je sprostredkovaná predovšetkým reguláciou HES1. Obnovenie miR-9 teda môže znížiť rast MB buniek zastavením buniek vo fáze G1 / S a zabrániť inhibícii progresie bunkového cyklu prostredníctvom inhibície HES1 a indukcie p21. Inhibícia HES1 sprostredkovaná miR-9 tiež podporovala expresiu odlišných neuronálnych diferenciačných markerov, vrátane markera skorej neurálnej diferenciácie TUBB3, neuronového progenitorového nestínu a astrocytového diferenciačného markera GFAP, ktorý je spojený s menej agresívnymi MB a vyššou citlivosťou na protirakovinové lieky. drogy (Sadatomo a kol., 1996; Son a kol., 2003). Naše výsledky skutočne ukazujú, že miR-9 je downregulovaný v zle diferencovaných MB bunkách, zatiaľ čo je normálne exprimovaný v normálnom fetálnom mozočku, z ktorého pochádzajú MB nádory. Obnovenie miR-9 môže preto obnoviť program neurogénnej diferenciácie a znížiť represiu HES1 tumoru na fenotyp MB.

Úloha miR-9 ako prognostického faktora bola nedávno opísaná v rôznych nádoroch, ako je napríklad akútna lymfocytárna leukémia (Agirre a kol., 2009), akútna myeloidná leukémia (Marcucci a kol., 2008) a rakovina hrubého čreva (Schetter a kol., 2008). Na základe analýzy súborov údajov o primárnych nádoroch táto štúdia naznačuje, že miR-9 môže byť tiež užitočný ako prediktor výsledku pacientov s MB. MB pacienti s nádormi exprimujúcimi nízke hladiny miR-9 (a súčasne s vysokou HES1 ) skutočne vykazujú horšiu mieru prežitia. To je v súlade s nedávno uverejnenými správami, ktoré preukazujú, že vysoké úrovne expresie HES1 sú spojené so zlou prognózou MB (Hallahan a kol., 2004; Ingram a kol., 2008). Významné spojenie medzi vysokými HES1 / nízkymi miR-9 expresiami so zavedenými vysokorizikovými indikátormi pre MB naznačuje diagnostický význam expresie miR-9 v histológii MB.

Záverom sme identifikovali hypermetyláciu miR-9 na CpG ostrove špecifickú pre MB, kritický regulátor diferenciácie MB buniek a progresie bunkového cyklu. Vzhľadom na dynamickú a dôležitú reverzibilnú povahu metylácie DNA naše výsledky naznačujú, že miR-9 môže slúžiť ako dôležitý prognostický molekulárny marker. Obnovenie expresie miR-9 môže ďalej predstavovať novú terapeutickú stratégiu, ktorá prispieva k zlepšeniu liečby pacientov s MB, a na vyhodnotenie regulácie rastu nádoru MB in vivo sprostredkovanej miR-9 sú potrebné budúce štúdie na zvieracích modeloch.

História zmien

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplnkový obrázok 1

  2. 2.

    Doplnkový obrázok 3

  3. 3.

    Doplnkový obrázok 5

Obrázkové súbory

  1. 1.

    Doplnkový obrázok 2

  2. 2.

    Doplnkový obrázok 4

Word dokumenty

  1. 1.

    Doplnkové obrázkové legendy

    Táto práca je publikovaná na základe štandardnej licencie na publikovanie zmluvy. Po 12 mesiacoch sa dielo stane voľne dostupným a licenčné podmienky sa prepnú na neverejnú licenciu Creative Commons typu Uvedenie autora - Neobchodné - Zdieľať 3.0.

    Doplňujúce informácie sú priložené k tomuto dokumentu na webovej stránke British Journal of Cancer (//www.nature.com/bjc).