Zvýšenie radiačnej odpovede v p53-deficientných rakovinových bunkách inhibítorom aurora-b kinázy azd1152 | onkogén

Zvýšenie radiačnej odpovede v p53-deficientných rakovinových bunkách inhibítorom aurora-b kinázy azd1152 | onkogén

Anonim

abstraktné

Nadmerná expresia Aurora-B kinázy koreluje s onkogénnou transformáciou a zlou prognózou. Hodnotili sme účinky inhibítora bona fide Aurora-B kinázy AZD1152 na odpovede nádorov na ionizujúce žiarenie (IR). Keď boli bunky p53 wt HCT116 a A549 vopred ošetrené AZD1152-HQPA pred IR, boli pozorované aditívne účinky. Je zaujímavé, že výraznejšie tumoricídne účinky boli pozorované v bunkách HCT116 a HT29 s deficitom p53, ako aj v bunkách A549 ošetrených cyklickým pifitrinom-a inhibítorom p53. Štúdie in vivo na xenoštepených myšiach potvrdili zvýšené oneskorenie rastu nádoru po kombinácii IR plus AZD1152-IR v porovnaní so samotným IR. Tento účinok bol opäť výraznejší u xenoimplantátov p53 - / - HCT116 a p53. Rádiosenzibilizácia sprostredkovaná AZD1152 bola napodobnená knockdownovaním Aurora-B krátkou interferenčnou RNA alebo inhibíciou Aurora-B transfekciou indukovateľnou Aurora-B, ktorá bola indukovaná kinázou. Rádiosenzitizujúci účinok AZD1152 sa stratil v bunkách CHK2 - / - a 14-3-3 - / - HCT116. Celkovo tieto údaje naznačujú, že AZD1152 môže rádiosenzibilizovať nádorové bunkové línie in vitro a in vivo , skutočnosť, že tieto účinky sa zhoršujú v rakovinových bunkách s nedostatkom p53, je potenciálne zaujímavá pre ďalší klinický vývoj.

úvod

Aurora kinázy tvoria rodinu serín / treonínkináz, ktoré sú nevyhnutné pre mitotickú progresiu a sú maximálne exprimované počas G2 a M fázy bunkového cyklu (Nigg, 2001; Carmena a Earnshaw, 2003). Existujú tri typy génov cicavčích aurora kináz: Aurora-A, -B a -C.

Aurora-A sa lokalizuje do centrosómov a vyžaduje sa na oddelenie a dozrievanie centrosómov prostredníctvom náboru kľúčových komponentov zostavy vretena. Vyčerpanie Aurora-A RNA interferenciou blokuje prechod G2-M (Hirota a kol., 2003). Aurora-A fosforyluje rad prominentných substrátov, vrátane BRCA1 (Ouchi a kol., 2004), CDC25B a p53 (Katayama a kol., 2004) a bunky, ktoré nadmerne exprimujú Aurora-A, sú rezistentné na paklitaxel a obchádzajú rádioaktívne indukované Zaťaženie G2 –M (Anand a kol., 2003) a vykazujú zníženú apoptózu indukovanú cisplatinou (Katayama a kol., 2004).

Aurora-B kináza je jedným z chromozomálnych proteínov pre cestujúcich, ktoré sú nevyhnutné pre mitotickú progresiu. Expresia a aktivita Aurora-B je regulovaná bunkovým cyklom: jej expresné píky pri prechode G2-M a jej kinázová aktivita je maximálna počas mitózy. Chromozomálne cestujúce proteíny sa lokalizujú do kinetochorov / centromér od profázy do metafázy, v centrálnom vretene v anafáze a telopáze a nakoniec k midbody na konci cytokinézy. INCENP, tiež substrát Aurora-B, je potrebný na lokalizáciu Aurora-B do kinetochorov. Aktivácia Aurora-B sa aktivuje autofosforyláciou po asociácii s jej substrátom INCENP. V cicavčích bunkách Aurora-B tvorí veľký chromozómový osobný komplex s INCENP, Survivin a Borealin (Adams a kol., 2001; Carmena a Earnshaw, 2003; Meraldi a kol., 2004; Andrews, 2005).

Okrem svojho základného príspevku k cytokinéze (Giet et al., 2005), Aurora-B plní najmenej dve ďalšie, zreteľné, ale príbuzné funkcie: Aurora-B fosforyluje histón H3 na Ser 10 (je potrebný na kondenzáciu chromozómov) a sa vyžaduje pre kontrolný bod zostavy vretenového snímača napätia a korekciu chýb v pripojení mikrotubulov k kinetochorom. Strata funkcie Aurora-B má za následok zlyhanie zadržania proteínov kontrolného bodu na kinetochore a potlačenie kontrolného bodu vretena senzitívneho na Taxol (Ditchfield a kol., 2003; Hauf a kol., 2003).

Identifikácia inhibítorov Aurora-B je hlavným cieľom farmaceutických spoločností od objavu, že zodpovedajúci génový lokus je pri ľudských rakovinách často amplifikovaný a že Aurora-B je nadmerne exprimovaná na úrovni mRNA a proteínov v niekoľkých líniách ľudských rakovinových buniek (Bischoff) a kol., 1998), vrátane rakoviny hrubého čreva, rakoviny prsníka a prostaty. Malé molekuly môžu selektívne zacieľovať na enzymatickú aktivitu kináz obsadením katalytického väzbového miesta ATP (a niekedy aj substrátu). Nedávno bolo opísaných niekoľko inhibítorov Aurora kinázy, vrátane ZM447439 (Ditchfield a kol., 2003; Gadea a Ruderman, 2005), Hesperadin (Hauf a kol., 2003) VX-680 (Harrington a kol., 2004) a AZD1152 (Wilkinson) a kol., 2007).

AZD1152 je acetanilidom substituované pyrazol-aminochinazolín dihydrogenfosfátové proliečivo s dobrou rozpustnosťou, čo ho robí vhodným na parentálne podávanie. AZD1152 je špecifický inhibítor Aurora kinázy so selektivitou pre Aurora-B kinázu (Ki 0, 4 nM) a vykazuje silnú špecifickosť na paneli ďalších 50 testovaných serín-treonínových a tyrozínkináz. Ošetrenie ľudských nádorových bunkových línií s AZD1152-HQPA (aktívnym liečivom v ľudskej plazme) in vitro vedie k supresii fosforylácie histónu H3 na seríne 10. AZD1152-HQPA vykazuje nový mechanizmus účinku ovplyvňovaním chromozómového usporiadania a segregácie, spôsobí, že sa bunky nebudú deliť, stanú sa polyploidnými a nakoniec podstúpia apoptózu. AZD1152-HQPA je aktívny v rôznych nádorových bunkových líniách, vrátane MCF7, Colo205, HCT116, SW620, HeLa a A549, s inhibíciou tvorby kolónií (IC50) 20 - 30 nM na inhibíciu fosforylácie histónu H3 ( Wilkinson a kol., 2007).

Kombinácia liekov s ožarovaním je bežnou praxou pri liečbe rakoviny a je zameraná na dosiahnutie väčších terapeutických účinkov ako pri jednodomodálnej terapii. Doteraz sa ukázalo, že taxány, ktoré blokujú bunky v mitóze zvýšením stabilizácie mikrotubulov, modifikujú rádiosenzitivitu spôsobom závislým od času a bunkového cyklu (Milas et al., 1999). Toto zistenie nás viedlo k vyhodnoteniu vplyvu inhibície Aurora-B kinázy indukovanej AZD1152 na rádiosenzitivitu nádorových buniek in vitro a in vivo .

výsledok

Znížené klonogénne prežitie v nádorových bunkách vopred ošetrených AZD1152-HQPA

Najprv sme analyzovali fyziologické dôsledky inhibície aktivity Aurora-B kinázy AZD1152 analýzou stavu fosforylácie kvintesenciálneho substrátu Aurora-B, histónu H3. Inkubácia nádorových buniek hrubého čreva HCT116 s AZD1152-HQPA počas 24 hodín viedla k úplnej inhibícii fosforylácie histónu H3 a v bunkách ošetrených AZD1152-HQPA sme pozorovali odlišnú morfológiu vretena v porovnaní s kontrolnými bunkami (obrázok la). V súlade s predchádzajúcimi správami a v súlade s predchádzajúcimi správami odhalilo analýzy bunkového cyklu, že bunky ošetrené AZD1152-HQPA postupne akumulovali obsah DNA väčší ako 4 N, čo naznačuje polyploidizáciu v dôsledku mitotického zlyhania (obrázok 1a). Okrem toho bolo v bunkách exponovaných AZD1152-HQPA v bunkových líniách HCT116 detegované veľké množstvo mikrojadier a viacjadrových buniek (obrázok la). To naznačuje, že pri bunkovej smrti súvisiacej s AZD1152 prevažuje skôr mitotická katastrofa než apoptóza (približne 10% sub-G1 ako na obrázku la). Klonogénne testy prežitia ďalej odhalili, že AZD1152-HQPA účinne inhibovala tvorbu kolónií v rozsahu 10 nM až 1 μM, s IC50 pre bunkové línie p53 - / - HCT116, HT29 a A549: 20, 12, 150 a 20, 16 nM, (Obrázok 1c) a zvýšená bunková smrť, keď sa podáva 24 hodín pred ošetrením ionizujúcim žiarením (IR) v rôznych bunkových líniách (obrázky 3a, c a 5). Ďalej sme skúmali vplyv Aurora-B inhibície prostredníctvom AZD1152-HQPA na lokalizáciu BubR1 na kinetochores a pozorovali sme zníženie lokalizácie BubR1 na kinetochores (anti-kinetochore CREST protilátka sa použila na označenie kinetochorov, ktoré sa nezmenili inhibíciou) Aurora-B pomocou AZD1152) v bunkách p53 - / - HCT116 s 24-hodinovou expozíciou 100 nM AZD1152-HQPA (obrázok 1d).

Image

Klonogénne prežitie bunkových línií vystavených rozsahu koncentrácií AZD1152-HQPA. a ) Hore: chemická štruktúra AZD1152 a jeho aktívneho metabolitu AZD1152-HQPA (vpravo). Spodok: obrázky imunofluorescencie mitotických buniek pCT wt HCT116 vystavených pôsobeniu 100 nM AZD1152-HQPA počas 24 hodín. Ošetrené bunky boli farbené na DNA (modrá), tubulín (zelená) a fosfohistón-H3 (červená). Farbenie ukazuje, že po dlhodobej expozícii AZD1152-HQPA bunky vstupujúce do následných mitóz s viacnásobnými pólmi vretien, centrosómami a neprítomnosťou fosforylácie histónu H3 ser-10, čo je charakteristický fenotyp buniek inhibovaných Aurora-B. Mikrojadrá a multinukleácia sú uvedené v bunkách HCT116 po 24-hodinovej expozícii 100 nM AZD1152-HQPA (vpravo dole) v porovnaní s kontrolou (dole vľavo). ( b ) histogram obsahu DNA buniek p53 wt HCT116 vystavených 100 nM AZD1152-HQPA počas 24 hodín. ( c ) klonogénne prežitie rôznych bunkových línií vystavených rozsahu koncentrácií AZD1152-HQPA. Je zobrazený jeden zástupca z troch nezávislých experimentov (uskutočňovaných trojmo), X ± sd ( d ) Lokalizácia BubR1 v kinetochéroch je ukázaná v bunkách p53 - / - HCT116 s (hornou) alebo bez (spodnou) 24-hodinovou expozíciou 100 nM AZD1152-HQPA. Kinetochory boli označené sérom CREST.

Obrázok v plnej veľkosti

Reakcia bunkového cyklu na ošetrenie IR a AZD1152-HQPA

Analýza bunkového cyklu odhalila, že ošetrenie AZD1152-HQPA počas 24 hodín malo hlavný vplyv na bunkový cyklus niekoľkých rakovinových bunkových línií, ktoré sa líšia svojím statusom p53 (p53 - / - HCT116, p53 wt HCT116 (obrázky 2a a b) a HT29 bunkové línie ; údaje nie sú zobrazené). Najvýznamnejšou zmenou vyvolanou monoterapiou s AZD1152-HQPA bola akumulácia buniek s> 4 N DNA. Dvadsaťštyri hodín po ošetrení IR sa pozoroval výraznejší blok G2-M v bunkách p53 - / - HCT116 ako v bunkách divokého typu (wt) HCT116 (59 ± 7 oproti 27 ± 5%), a AZD1152-HQPA boli pri indukcii polyploidizácie v p53 - / - HCT116 bunkách účinnejšie ako v p53 wt HCT116 náprotivkoch (63 ± 12 oproti 51 ± 15%). Je pozoruhodné, že keď boli bunky exponované ako IR, tak AZD1152-HQPA, akumulácia> 4 N buniek obsahujúcich DNA bola znížená v porovnaní s ošetrením samotným AZD1152-HQPA v oboch bunkových líniách wt HCT116: 18 ± 1 oproti 51 ± 15%; p53 - / - HCT116: 25 ± 12 oproti 63 ± 12%; Obrázky 2a a b). Keď sa však bunky predtým inkubované s AZD1152-HQPA počas 24 hodín vystavili IR a analyzovali fluorescenčne aktivovaným triedením buniek (FACS) o 24 hodín neskôr, akumulácia buniek s bunkami s obsahom> 4 N DNA sa nezmenila v porovnaní s bunky vystavené samotnému AZD1152-HQPA. Tento jav sa pozoroval v p53 - / - HCT116, ako aj v ich náprotivkoch pCT wt HCT116 (údaje nie sú uvedené).

Image

Kombinovaný účinok AZD1152-HQPA s ionizujúcim žiarením (IR) na bunkový cyklus. ( a ) p53 wt HCT116: bunky inkubované s AZD1152-HQPA počas 24 hodín indukujú akumuláciu> 4 N buniek obsahujúcich DNA. IR (6 Gy) indukuje mierny blok G2-M 24 hodín po liečbe. 24 hodinová expozícia AZD1152-HQPA nasledovaná bezprostredne po 6 Gy IR viedla k dramatickému poklesu> 4 N buniek (18%) v porovnaní so samotnou AZD1152-HQPA (58%). ( b ) bunky p53 - / - HCT116: bunky inkubované s AZD1152-HQPA počas 24 hodín indukovali väčšiu akumuláciu> 4 N buniek obsahujúcich DNA ako v bunkovej línii pCT wt HCT116 (52 oproti 31%). Ošetrenie buniek pomocou IR (6 Gy) spôsobilo výraznejší blok G2-M ako v p53 wt HCT116. Ošetrenie buniek s AZD1152-HQPA počas 24 hodín nasledované okamžite s 6 Gy IR viedlo k dramatickému poklesu> 4 N buniek v porovnaní so samotným AZD1152-HQPA (75% pre neožiarené bunky oproti 37% pre 6 Gy). ( c ) Western blotting ukazuje expresiu p21 Cip / WAF1 za 24 hodín po 100 nM expozícii AZD1152-HQPA (DMSO ako kontrola) v bunkách p53 wt a p53 - / - HCT116. Je znázornený jeden reprezentatívny aspekt troch nezávislých experimentov.

Obrázok v plnej veľkosti

Potom sme porovnali expresiu p21 Cip / WAF1 v p53 wt a p53 - / - HCT116 (24 hodín po 100 nM AZD1152 HQPA). Na obrázku 2c je znázornené zvýšenie expresie p21 Cip / WAF1 v bunkách p53 wt HCT116 exponovaných AZD1152 v porovnaní s kontrolnými bunkami vystavenými dimetylsulfoxidu (DMSO); v bunkách p53 - / - HCT116 však zostáva expresia p21 Cip / WAF1 takmer nedetegovateľná. To naznačuje, že p21 Cip / WAF1 hrá dôležitú úlohu v reakcii buniek na inhibíciu Aurora-B pomocou AZD1152.

p53 - Závislý účinok kombinácie AZD1152-HQPA a IR

Klonogénne testy prežitia odhalili výraznejšie zvýšenie usmrtenia nádorových buniek po vystavení AZD1152-HQPA počas 24 hodín, po ktorom nasledovalo IR v bunkovej línii p53 - / - HCT116 (obrázok 3a), ako aj v mutantnej bunkovej línii HT53 (obrázok 53) (obrázok 3). 7a). Za podobných podmienok bolo v bunkách p53 wt HCT116 detegované iba mierne zosilnenie usmrcovania buniek pomocou IR a AZD1152-HQPA (obrázok 3b). Tieto výsledky naznačujú, že protinádorový účinok kombinovanej terapie (IR plus AZD1152-HQPA) závisí od funkčného stavu p53. Aby sa táto možnosť podrobnejšie preskúmala, ošetrili sme bunky A549 (ktoré majú funkčný p53) cyklickým pifitrinom-a, chemickým inhibítorom p53, a pozorovali sme, že v podmienkach inhibície p53 sa bunková smrť zvýšila po expozícii IR plus AZD1152-HQPA, čo naznačuje kritickú úlohu p53 pri sprostredkovaní tohto účinku (obrázky 3c a d).

Image

Krivky klonogénneho prežitia. Krivky klonogénneho prežitia pre bunky p53 - / - HCT116 ( a ) a p53 wt HCT116 ( b ) boli vopred ošetrené 24 h 20 nM AZD1152-HQPA (PE AZD / PE DMSO : 22, 5, respektíve 26, 3%). Údaje predstavujú priemer z troch nezávislých experimentov v troch vyhotoveniach, X ± sd Krivka „AZD norm ctrl“ je frakcia prežitia buniek ošetrených AZD1152 normalizovaná frakciou prežívajúcich buniek bez ožarovania; krivka „AZD1152“ je frakcia prežitia buniek ošetrených AZD1152 normalizovaná frakciou prežitia buniek ošetrených AZD1152 bez ožarovania. Klonogénne krivky prežitia pre bunky A549 boli vopred ošetrené 8 hodín s 20 uM pifitrin-a ( c ) alebo dimetylsulfoxidom (DMSO) ( d ) a potom exponované 40 nM AZD1152-HQPA počas 24 h (PE AZD / PE DMSO : 34, 4 a 73, 3) %). Je znázornený jeden reprezentatívny aspekt dvoch nezávislých experimentov (uskutočňovaných trojmo), X ± sd

Obrázok v plnej veľkosti

Liečba xenoštepu ľudskej rakoviny in vivo kombináciou AZD1152 plus IR

Ošetrenie myší nesúcich subkutánne xenoimplantáty buniek HCT116 buniek p53 wt odhalilo zvýšenie oneskorenia rastu nádoru (TGD) indukovaného AZD1152 plus IR v porovnaní so samotným IR (16 dní na dosiahnutie priemerného objemu nádoru 800 mm3 v kontrolách v porovnaní so samotným IR) (26 dní), samotný AZD1152 (22 dní) a IR a AZD1152 (30 dní); Obrázok 4b). Nádory p53 - / - HCT116 liečené AZD1152 plus IR tiež vykazovali výraznejší TGD (40 dní) ako tumory ošetrené samotným IR (29 dní; obrázok 4c). Obrázok 4a sumarizuje in vivo TGD získané pre p53 wt oproti p53 - / - HCT116 po expozícii samotnému IR (10 respektíve 8 dní) a v kombinácii s AZD1152 (15 respektíve 19 dní). AZD1152 má teda zvlášť výrazný účinok na radiačnú odpoveď nádorov s deficitom p53 in vivo , čo je v súlade so závislosťou p53 pozorovanou in vitro . Bunková línia HT29 s mutáciou p53 poskytla podobné výsledky in vivo (obrázok 4d). Samotný AZD1152 mal obmedzený účinok na rast nádorov HT29 (27 dní na dosiahnutie priemerného objemu nádoru 800 mm3 pre bunky ošetrené AZD1152 v porovnaní s 25 dňami na kontrolu), zatiaľ čo AZD1152 v kombinácii s IR viedli k významnému TGD (52 dní pre IR plus AZD1152 v porovnaní so 43 dňami pre IR samotné), ako je znázornené na obrázku 4d.

Image

Modely subkutánneho xenoštepu s liečbou kombinovanou s AZD1152 a ionizujúcim žiarením (IR). ( a ) TGD u myší injikovaných bunkami p53 wt alebo p53 - / - HCT116, ošetrené samotným IR alebo kombináciou IR s AZD1152. Pokusy in vivo na subkutánnom xenoimplantáte ( b ) p53 wt HCT116, ( c ) p53 - / - HCT116 a ( d ) HT29 bunkách ošetrených vehikulom (kontrola) alebo samotným AZD1152 alebo v kombinácii s IR. n = 6 na skupinu, sú uvedené priemerné objemy nádoru ± sem.

Obrázok v plnej veľkosti

Vplyv vyčerpania Aurora-B na radiačnú odpoveď

Aby sme mohli vyhodnotiť príspevok Aurora-B k rádiosenzibilizujúcemu účinku pozorovanému pri liečbe AZD1152, zničili sme Aurora-B pomocou dvoch odlišných heteroduplexov s krátkou interferenciou RNA (siRNA) (obrázok 5a). Ako sa očakávalo, deplécia Aurora-B by mohla zvýšiť IR reakciu buniek p53 wt (obrázok 5b) a p53 - / - (obrázok 5c).

Image

Reakcia ionizujúceho žiarenia (IR) v knockdown bunkách Aurora-B s krátkou interferenciou RNA (siRNA). ( a ) Western blot potvrdzujúci úspešnú depléciu Aurora-B pomocou siRNA. p53 wt ( b ) a p53 - / - HCT116 ( c ) boli ožiarené (2 Gy) 48 hodín po transfekcii siRNA Aurora-B (siRNA B) alebo siRNA kontroly (siRNA ctrl) a bola stanovená PE. Je znázornený jeden reprezentatívny aspekt troch nezávislých experimentov (uskutočňovaných trojmo), X ± sd

Obrázok v plnej veľkosti

Na ďalšie objasnenie fyziologického prínosu a potenciálneho mechanizmu Aurora-B sme použili mŕtvu kinázu indukovateľnú tetracyklínom; Aurora-B (DN) mutant stabilne transfekovaný do buniek HEK293 (Girdler et al., 2006). Expresia DN Aurora-B redukovala fosforyláciu histónu H3 (Girdler a kol., 2006), indukovala polyploidiu (obrázok 6a) a zhoršila klonogénne prežitie (Girdler a kol., 2006). Podobne ako výsledky získané s bunkami transfekovanými Aurora-B siRNA sme pozorovali zvýšenie radiačnej reakcie v bunkách HEK293 po indukcii DN Aurora-B tetracyklínom (obrázok 6b) v porovnaní s bunkami kultivovanými v neprítomnosti tetracyklínu alebo wt Bunky HEK293 (obrázok 6c). Expozícia pifitíínu neovplyvnila ožarovaciu odpoveď ani pri expresii Aurora-B, ani pri zániku kinázy. Vyčerpanie alebo inhibícia Aurora-B môže zvýšiť radiačnú odpoveď, AZD1152 však sprostredkuje ďalší rádiosenzitizačný potenciál.

Image

Reakcia ionizujúceho žiarenia (IR) v mutantných bunkových líniách indukovateľných Aurora-B ( a ) Charakterizácia buniek HEK293 stabilne transfekovaných konštruktom Aurora-B odumretým tetracyklínom (Hek DN) alebo divokého typu (wt) Aurora-B ( Hek wt) prostredníctvom Western blotu. Expresia proteínu Aurora-B sa stanovila po 1 μg ml -1 tetracyklínu (Tet +) 24 hodín alebo po neprítomnosti tetracyklínu (Tet-). Reprezentatívna analýza bunkového cyklu po indukcii 1 μg ml -1 tetracyklínu (40 h) je uvedená na dne. Kvantitatívne porovnanie percentuálneho obsahu> 4 N DNA po 1 μg ml -1 tetracyklínu (Tet) 40 hodín alebo bez tetracyklínu v týchto dvoch bunkových líniách je uvedené vpravo. Hek DN ( b ) a Hek wt ( c ) boli buď indukované alebo indukované (1 μg ml -1 tetracyklínu), ošetrené ožiarením 2 Gy o 24 hodín neskôr a bola stanovená PE (ľavé panely). Pravé panely predstavujú rovnaké experimentálne podmienky v prítomnosti 20 uM pifitínu. Je ukázaná tvorba kolónií po indukcii tetracyklínu dominantne negatívneho Aurora-B mutanta (tet) alebo AZD1152 (AZD) alebo AZD1152 kombinovaná s indukciou tetracyklínu (AZD plus tet) v bunkovej línii ( d ) HEK293 DN. Je znázornený jeden reprezentatívny aspekt troch nezávislých experimentov (uskutočňovaných trojmo), X ± sd

Obrázok v plnej veľkosti

Účinok rádiosenzibilizácie sprostredkovanej AZD1152-HQPA na bunkovom cykle

Aby sme určili predpokladanú špecificitu bunkového cyklu rádiosenzibilizácie sprostredkovanej AZD1152-HQPA, vybrali sme bunky HT29 buď vo fáze G2 / M alebo G1 / S bunkového cyklu a ošetrili sme ich pomocou AZD1152-HQPA a / alebo IR. Bunky obohatené vo fáze G2 / M boli dobre rádiosenzibilizované pomocou AZD1152-HQPA (obrázok 7b). Tento rádiosenzibilizujúci účinok AZD1152-HQPA bol menej výrazný pri hodnotení na populácii obohatenej vo fáze G / S, čo naznačuje, že rádiosenzibilizácia sprostredkovaná AZD1152 je závislá od bunkového cyklu (obrázok 7c).

Image

Bunkové línie HT29 vystavené kombinácii AZD1152-HQPA a ožiareniu. ( a ) HT29 bunky boli ošetrené 400 nM AZD1152-HQPA alebo dimetylsulfoxidom (DMSO) (kontrola; PE AZD / PE DMSO : 23, 2%) počas 24 hodín a následne ožiarené rôznymi dávkami. Distribúcia bunkových cyklov buniek HT29 bez ošetrenia je uvedená vpravo. Je znázornený jeden reprezentatívny aspekt troch nezávislých experimentov (vykonávaných v troch vyhotoveniach), X ± sd ( b ) G2 – M (PE AZD / PE DMSO 60%) a ( c ) G1 – S (PE AZD / PE DMSO 59%) HT29 bunky vybrané pomocou FACS podľa obsahu DNA boli vystavené pôsobeniu AZD1152-HQPA 400 nM a ožiarené. Je znázornený jeden reprezentatívny aspekt dvoch nezávislých experimentov (uskutočňovaných trojmo), X ± sd

Obrázok v plnej veľkosti

Absencia rádiosenzibilizácie pomocou AZD1152 v bunkových líniách CHK2 a 14-3-3 σ

Aby sme určili, či by sa do rádiosenzibilizácie sprostredkovanej AZD1152 mohli zapojiť aj iné proteíny kontrolného bodu G2 / M ako Aurora-B, porovnávali sme porovnateľne reakciu buniek wt, CHK2 - / - a 14-3-3 σ - / - HCT116 na IR. a / alebo AZD1152-HQPA. S prekvapením sme zistili, že knockout CHK2 alebo 14-3-3 úplne zrušil rádiosenzitizujúci účinok AZD1152-HQPA (obrázok 8).

Image

Analýza kontrolného bodu G2 v reakcii na kombinatorické ošetrenie. ( a ) Bunky CHK2 - / - HCT116 boli vopred ošetrené 20 nM AZD1152-HQPA alebo 1 uM ZM447439 počas 24 hodín a ožarované uvedenými dávkami. ( b ) Klonogenické krivky prežitia pre 14-3-3 σ - / - bunky HCT116 vopred ošetrené 5 nM AZD1152-HQPA alebo 1 μM ZM447439 počas 24 hodín a ožiarené. Je znázornený jeden reprezentatívny aspekt troch nezávislých experimentov (uskutočňovaných trojmo), X ± sd

Obrázok v plnej veľkosti

diskusia

V tejto štúdii sme analyzovali potenciálne účinky AZD1152 na inhibíciu Aurora-B kinázy v konjugácii s IR, s cieľom zlepšiť výsledky rádioterapie u pacientov s rakovinou.

AZD1152 je rádiosenzibilizátor in vitro a in vivo

Nedávno bolo opísaných niekoľko inhibítorov Aurora kinázy (Keen a Taylor, 2004), vrátane ZM447439 (Ditchfield a kol., 2003), Hesperadin a VX-680 a AZD1152. Tu opisujeme, že AZD1152-HQPA bola schopná inhibovať tvorbu kolónií spôsobom závislým od dávky v niekoľkých líniách ľudských rakovinových buniek. Už sme predtým uviedli, že IR môže viesť k tvorbe mikronukleovaných buniek a následnej mitotickej katastrofe (Zhang a kol., 2006), čo zvyšuje pravdepodobnosť, že IR v kombinácii s inhibíciou kontrolných bodov bunkového cyklu (ktoré sa normálne vyhýbajú mitotickej katastrofe; Castedo a kol. ., 2004) by boli zvlášť účinné pri indukcii smrti nádorových buniek. Nedávno ďalšia štúdia (Tao et al., 2005) ukázala, že aktivácia kontrolného bodu vretena nasledovaná mitotickým sklzom iniciuje apoptózu, uľahčenú inhibíciou KSP (kinesin-5, mitotický vretenový motorový proteín). Inhibícia Aurora-B vyvolaná AZD1152 by mohla potenciálne potlačiť kontrolný bod vretena a pravdepodobne uľahčiť bunkovú smrť indukovanú žiarením.

P53 - Závislý účinok AZD1152 na IR reakciu

Pozorovali sme väčšiu akumuláciu buniek obsahujúcich> 4 N buniek obsahujúcich DNA v bunkovej línii p53 - / - HCT116 ako v bunkovej línii p53 wt HCT116. Tieto výsledky sú v súlade s predchádzajúcimi nálezmi v nádorových a normálnych bunkách ošetrených ZM447439, ktoré odhaľujú cytoprotektívny účinok p53-sprostredkovaného postmitotického kontrolného bodu (Ditchfield a kol., 2003). Je pravdepodobné, že v neprítomnosti p53 bunky pokračovali v cykle aberantnými mitózami, čo nakoniec viedlo k smrti buniek. V súlade s týmto scenárom testy klonogénneho prežívania ukázali, že liečba AZD1152 viedla k zvýšeniu bunkovej smrti po ošetrení IR v prítomnosti nefunkčného p53. Podobne bol účinok in vivo účinnejší pri mutantných bunkách p53 - / - alebo p53. V bunkách HT29 naznačuje rozsah TGD u zvierat liečených AZD1152 a skupinou IR v porovnaní so stredne ťažkým TGD u myší ošetrených samotným AZD1152 synergickú interakciu . Výsledky in vivo získané s karcinómom hrubého čreva HCT116 potvrdili, že bunky s deficitom p53 (v porovnaní s p53 dostatočnými bunkami) vykazovali výraznejší TGD udeľovaný liečbou AZD1152, čo zdôrazňuje vplyv p53 na systém.

Toto pozorovanie naznačuje, že tento inhibítor Aurora-B môže mať zaujímavo odlišný účinok na normálne versus nádorové bunky. Nádorové bunky, v ktorých je systém p53 často inaktivovaný, sú zvlášť citlivé na radiosenzitizačný účinok AZD1152, pravdepodobne v dôsledku absencie rádioprotektívneho kontrolného bodu bunkového cyklu závislého od p53, ktorý zálohuje kontrolný bod vretena, aby sa zabránilo množeniu buniek nesúcich abnormálne genómy. (Keen a Taylor, 2004). Z tohto dôvodu by zlyhanie kontrolného bodu zostavenia vretena (v dôsledku liečby AZD1152) a zastavenie G1 po abnormálnej mitóze (v dôsledku defektov p53) boli obzvlášť smrteľné po poškodení DNA IR (Zhou a Bartek, 2004).

Genetická inhibícia Aurora-B vykazuje aditívne účinky s ožiarením, ale neprináša ďalšiu synergiu v bunkách s deficitom p53.

V tejto štúdii mala genetická inhibícia Aurora-B pomocou siRNA alebo podmieneného mutantu DN Aurora-B indukovateľného tetracyklínom rádiosenzibilizujúce účinky na niekoľko bunkových línií. V bunkách bez funkčného p53 však nebola pozorovaná žiadna ďalšia synergia žiarenia a inhibície Aurora-B. Pozorovali sme rozpor medzi liečbou AZD1152 a genetickou inhibíciou Aurora-B siRNA alebo expresiou mutantu DN. Aj keď AZD1152 a genetická inhibícia Aurora-B mali podobné účinky na bunkový cyklus (polyploidia) a klonogénne prežitie (v neprítomnosti IR), genetická inhibícia Aurora-B nedokázala rekapitulovať zvýšenú rádiosenzibilizáciu pozorovanú v bunkách s deficitom p53. Mohli by sme tiež ukázať, že AZD1152 sprostredkovala ďalšiu rádiosenzibilizáciu v bunkách, v ktorých bola Aurora-B inhibovaná mutantom DN. Okrem toho skutočnosť, že AZD1152 sprostredkuje ďalšie zníženie klonogénneho prežitia v bunkách, v ktorých bola inhibovaná Aurora-B, tiež ilustruje rozdiely medzi genetickými a farmakologickými prístupmi proti Aurora-B. Integrita p53-p21 Cip / WAF1- dependentného postmitotického kontrolného bodu riadi reakciu na inhibíciu Aurora kináz. Nedávno sa ukázalo, že endoreduplikácia a apoptóza v reakcii na VX-680 sú obmedzené v bunkách p53 wt a výrazne sa zvyšujú v bunkách bez p53. Rozdiel v reakcii na VX-680 medzi týmito bunkovými líniami koreluje s načasovaním indukcie p21 Cip / WAF1 a jeho schopnosťou inhibovať aktivitu cyklínu E-cdk2 (Gizatullin et al., 2006). Ukazujeme tiež zvýšenie expresie p21 Cip / WAF1 v bunkách p53 wt HCT116 exponovaných AZD1152 v porovnaní s kontrolnými bunkami exponovanými DMSO, zatiaľ čo v bunkách p53 - / - HCT116 je nízka expresia p21 Cip / WAF1 . Tieto naznačujú súhru medzi p53, jeho downstream efektorovým p21 Cip / WAF1 a Aurora kinázami.

Celkovo by tieto nálezy mohli odrážať výrazné rozdiely, pokiaľ ide o trvanie a intenzitu Aurora-B inhibície medzi genetickým a farmakologickým prístupom, nemožno však vylúčiť skutočnosť, že AZD1152 má mimo cieľový účinok na iné bunkové ciele ako Aurora-B.,

Účinok AZD1152 na bunkový cyklus (G 2 – M) na ožiarenie

Vo fáze G2 / M boli bunky citlivejšie na kombinované ošetrenie s AZD1152 plus IR, ako keď boli vo fáze G1 alebo S bunkového cyklu. Nádory s chybnými kontrolnými bodmi, ako sú tie s mutantným p53, mali tendenciu sa selektívne hromadiť v G2 po poškodení DNA. Kontrolný bod G2 / M bráni bunkám v iniciovaní mitózy, keď utrpia poškodenie DNA počas G2 alebo keď postupujú do G2 s neopraveným poškodením spôsobeným v predchádzajúcich fázach S alebo G1 (Kastan a Bartek, 2004). Kontrolné body G2 bunkového cyklu nezávislé na p53 (Kastan a Bartek, 2004) zastavujú bunky na hranici G2 / M po poškodení DNA IR alebo inými činidlami poškodzujúcimi DNA. To, že subpopulácia buniek G2 / M vykazuje vyššiu citlivosť na IR v kombinácii s AZD1152, má sľubné terapeutické implikácie, najmä ak je kombinovaná s frakcionovanou rádioterapiou, čo spôsobuje, že sa bunky akumulujú na hranici G2 / M (Pawlik a Keyomarsi, 2004).

Neprítomnosť rádiosenzibilizácie pomocou AZD1152 alebo ZM447439 v bunkách CHK2 - / - alebo 14-3-3 σ - / - naznačuje, že normálny kontrolný bod G2 - M (ktorý závisí od prítomnosti CHK2 a 14-3-3 σ) je kritický pre terapeutický účinok AZD1152.

Záverom je možné konštatovať, že táto štúdia odhaľuje, že postupné pôsobenie AZD1152 a IR zvyšuje bunkovú smrť pri rakovine HCT116, HT29 a A549. Tento účinok bol výraznejší v neprítomnosti funkčného p53 a buniek obohatených G2 / M. Predklinické údaje získané u myší nesúcich xenoimplantáty ľudského karcinómu silne naznačujú, že rádiosenzibilizujúci účinok AZD1152 si vyžaduje ďalšie klinické skúmanie.

Materiály a metódy

Bunkové línie

Bunkové línie ľudskej rakoviny hrubého čreva a konečníka HCT116 (p53 wt, p53 - / -, CHK2 - / - a 14-3-3 σ - / - ) boli láskavým darom od B. Vogelsteina (Bunz a kol., 1998; Chan a kol., 1999; Jallepalli a kol., 2003). Bunková línia kolorektálneho karcinómu HT29 (mutovaná p53 a Raf) a ľudské nemalobunkové pľúcne bunky A549 (ktoré nesú neporušenú dráhu p53) boli získané zo zbierky American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Bunky HCT116 a HT29 sa udržiavali v McCoyovom 5A médiu (Gibco, Worcester, MA, USA) doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom (ATGC, Cergy Pontoise, Francúzsko), 1% PS (Gibco), 1% L-glutamínom (Eurobio, Les Ulis, Francúzsko), 1 m pyruvát sodný (Gibco) a 10 m M kyselina 4- (2-hydroxyetyl) -1-piperazínetánsulfónová (HEPES; Sigma, St. Louis, MO, USA), vo zvlhčenej atmosfére obsahujúcej 5% C02 pri 37 ° C. Bunková línia A549 sa udržiavala v médiu RPMI 1640 (Eurobio) doplnenom 10% fetálneho hovädzieho séra (ATGC), 1% PS (Gibco), 1% L-glutamínu (Eurobio), 1 mM pyruvátu sodného (Gibco) a 10 mM HEPES (Sigma). Stabilné izogénne bunkové línie exprimujúce Aurora-B transgény (vytvorili sme stabilné bunkové línie exprimujúce wt Aurora-B kinázu, ako aj transgény nesúce bodové mutanty navrhnuté tak, aby inhibovali katalytickú aktivitu. Samostatne sme mutovali kyselinu aspartovú vo vysoko konzervovanom motíve DFG, subdoména VII na asparagín (DN)) pod kontrolou tetracyklínu sa generovala použitím systému založeného na FRT-Flp, ako sa už opísalo (Girdler a kol., 2006). Stručne, otvorené čítacie rámce boli klonované do vektora pcDNA5-FRT-TO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) modifikovaného tak, aby obsahoval N-koncovú Myc-epitopovú značku. Výsledné vektory sa kotransfekovali do buniek Flp-In TRex-HEK293 s pOG44, plazmidom kódujúcim Flp rekombinázu. Po selekcii v hygromycíne sa kolónie spojili, expandovali a indukovala sa expresia transgénu pomocou 0, 25–1 μg ml -1 tetracyklínu. Podmienky bunkovej kultúry sa uskutočňovali tak, ako je opísané (Girdler et al., 2006).

Klonogénne testy prežitia

Bunky sa naočkovali trojmo do šesťjamkových doštičiek alebo do 25 cm2 banky v rozsahu 100 - 80 000 buniek na jamku podľa dávky žiarenia dodanej do buniek, experimentálnych podmienok a rôznych bunkových línií, aby sa získalo 20 –200 kolónií na banku alebo jamku. Po pripojení buniek bola podaná jediná dávka fotónového ožarovania s / bez liečiva. Bunky sa kultivovali 10 až 14 dní v inkubátore s 5% C02 pri 37 ° C. Jednotlivé kolónie (> 50 buniek na kolóniu) sa fixovali a farbili sa 20 minút roztokom obsahujúcim kryštálovú fialovú a metanol. Účinnosť naočkovania (PE) zodpovedá percentu naočkovaných buniek, ktoré rastú do kolónií za špecifických kultivačných podmienok danej bunkovej línie. PE AZD is the percentage of seeded cells that grow into colonies when exposed to AZD1152-HQPA for a given cell line. PE DMSO is the percentage of seeded cells that grow into colonies when exposed to DMSO (used as a control) for a given cell line. We calculated the ratio of PE AZD /PE DMSO as an estimate of the percentage of cell killing in certain cell lines caused by AZD1152-HQPA alone using a colony-formation method. The survival fraction, expressed as a function of irradiation, was calculated as follows: survival fraction=colonies counted/(seeded cells × PE/100). A 200 kV X-ray device (0.66 Gy min −1 ) was used for the in vivo experiments and a Cesium-137 source (1.85 Gy min −1 ) was used for in vitro experiments. The IC 50 values for the various cell lines have been calculated with the software GraphPad Prism 5.01 of Windows.

Aurora-B kinase inhibitors

AZD1152 (provided by AstraZeneca Pharmaceuticals, Macclesfield, UK) is an Aurora kinase inhibitor with selectivity for Aurora-B. AZD1152 is a phosphate prodrug that is converted in vivo into the active agent AZD1152-HQPA (diluted in DMSO at a concentration of 10 m M ). AZD1152-HQPA (Ki: Aurora-A 1370 n M, Aurora-B-INCENP 0.36 n M, Aurora-C-INCENP 17 n M, relative molecular mass 507.57) was used in vitro . Screening of a kinase panel indicated that, testing at doses of up to 100 times higher than those required to inhibit Aurora-B, AZD1152-HQPA did not significantly inhibit any of the following 27 kinases: JAK3, v-ABL, IGFR, ZAP70, P38, CDK1, CDK2, JNK1A, PKA, MEK, MTK, TEK, TRK, EGFR, ErbB2, P70, PLK, PDGFRa, PDGFRb, PI3K, KIS, KDR, FLT1, FLT3, FGFR, C-KIT and B-sRAF. The duration of cell incubation with AZD1152 in vitro was 24 h, if not specified otherwise. ZM447439 (provided by AstraZeneca Pharmaceuticals) is an Aurora kinase inhibitor. In in vitro kinase assays using purified recombinant proteins, ZM447439 inhibited Aurora-A and -B with IC 50 values of 1000 and 50 n M, respectively (Girdler et al., 2006).

siRNA

The following siRNAs were followed for analyses: two human Aurora-B (QIAGEN, Hilden, Germany), GGAGGAGGAUCUACUUGAU; AURKB 2 (HP Genomewide siRNA 1027400) and AURKB 5 (HP-validated siRNA 1027400). The first siRNA AURKB 2 has been successfully confirmed in previous siRNA experiments. siRNA transfections were conducted with Oligofectamine transfection reagent (Invitrogen), and a nonspecific double-stranded RNA (QIAGEN) was used as a control. Annealing of the component siRNA strands and transfection procedures were performed as previously described (Elbashir et al., 2001).

The p53 inhibitor

Pifithrin-α (Komarov et al., 1999) was used for p53 inhibition in A549 cells. The final concentration used in experiments was 10–20 μ M in medium with serum. Pifithrin-α was added 8 h prior to AZD1152 treatment.

Analýza bunkového cyklu

Sham control and 6 Gy-irradiated cells with/without drug exposure were harvested by trypsinization at the indicated time after irradiation, washed with ice-cold PBS, fixed in 70% ethanol and stored at −20 °C. Prior to DNA analysis, DNA content was labeled with 0.1 μg ml −1 propidium iodide (PI) and 1 mg ml −1 RNAse. The cell cycle analysis was performed by flow cytometry (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Purification of selected cell cycle subpopulations

Twenty-four hours after incubation with AZD1152-HQPA, HT29 cells were trypsinized, neutralized with medium, centrifuged and then stained with 10 μg ml −1 of Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, USA) for 30 min at 37 °C in the absence of light. Samples were washed once and re-suspended in medium containing 0.5 μg ml −1 PI. Selection of G 2 –M and G 1 –S phase cells was performed using a FACS Vantage SE (BD Biosciences).

Immuno(cyto)chemistry and antibodies

HCT116 cells were seeded in 12-well plates, incubated with 100 n M AZD1152-HQPA for 1 or 24 h and fixed in 4% paraformaldehyde (Sigma) for 30 min. Cells were then permeabilized with PBS containing 0.1% Triton X-100 for 3 min and incubated with 1 mg ml −1 BSA/PBS blocking solution. Cells were incubated with phospho-histone-H3 PhH3 (1:500, catalog no. 06–570; Upstate Cell Signaling Solutions, Danvers, MA, USA) and mouse monoclonal anti-β-tubulin (1:200, catalog no. ATN01-A; Cytoskeleton, Denver, CO, USA) primary antibodies, followed by incubation with goat anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) conjugated to Alexa 555 fluorochrome (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) or anti-mouse IgG Alexa 488 conjugate (1:500, Molecular Probes) secondary antibodies. The mouse monoclonal anti-BubR1 (1:100, catalog no. B34920; BD Transduction Laboratories) antibody had been used and a human anti-kinetochore antibody (1:200, obtained from patients with calcinosis cutis, Raynaud phenomenon, esophageal motility disorder, sclerodactyly and telangiectasis (CREST) syndrome) was kindly provided by JC Brouet, Hopital St Louis, Paris, France. The p21 Cip/WAF1 antibody (1:500; catalog no. 05–345, Upstate) has been used to detect p21 Cip/WAF1 expression 24 h after 100 n M AZD1152 HQPA in the p53 wt and p53 −/− HCT116. Chromosomes were stained with 1 μg ml −1 Hoechst 33324 in PBS for 5 min. Tricolor images were merged using Adobe Photoshop (v 8.0). A mouse monoclonal antibody against Aurora-B kinase (BD Biosciences) at a 1:1000 dilution was used for immunoblotting.

In vivo xenograft in nude mice

Female athymic nude mice 6–8 weeks of age (Janvier CERT 53940, Le Genest St Isle, France) were used for the tumor xenograft model. The in vivo experiments were carried out at the Institut Gustave Roussy under the Animal Care license C94-076-11 (Ministere de l'Agriculture). A total of 3 × 10 6 HT29 or p53 wt and p53 −/− HCT116 cells were subcutaneously implanted in the right flank of each mouse. Treatment began when the tumor was at least 5 mm in diameter. Mice were randomly allocated to four groups: A, control; B, IR alone, 4 Gy (p53 wt and p53 −/− HCT116) or 6 Gy (HT29) twice in 2 days; C, AZD1152 alone, 10 mg kg −1 per day (p53 wt HCT116) or 35 mg kg −1 per day p53 −/− HCT116 and 40 mg kg −1 per day HT29) for 4 days; D, AZD1152 combined with IR (24 h after the administration of AZD1152, similar schedule as IR alone) for 4 days. Drug or vehicle control was administered intraperitoneally. The tumor size was measured twice a week with an electronic caliper. Follow-up of individual mouse was conducted over 30–60 days to obtain a mean tumor volume of at least 800 mm 3 after the beginning of the treatment. The tumor volume was estimated from 2-D tumor measurements (six or eight mice per group) using the following formula: tumor volume=length (mm) × width 2 (mm 2 )/2.