Endocytóza fcαr je závislá od klatrínu a dynamínu, ale jeho cytoplazmatická doména sa nevyžaduje | bunkový výskum

Endocytóza fcαr je závislá od klatrínu a dynamínu, ale jeho cytoplazmatická doména sa nevyžaduje | bunkový výskum

Anonim

abstraktné

FcaR, Fc receptor pre IgA, je nevyhnutný pre imunitné reakcie sprostredkované IgA. Predchádzajúce štúdie ukázali, že imunitné komplexy IgA a IgA môžu byť rýchlo endocytované FcyR. Základný mechanizmus však zostáva nejasný. Tu sme skúmali endocytovú dráhu FcaR v monocytovej bunkovej línii U937, ktorá prirodzene exprimuje FcaR a v transfekovaných vaječníkoch čínskeho škrečka (CHO), COS-7 a Hela. Použitím selektívnych chemických inhibítorov rôznych endocytových dráh, nadmernej expresie dominantne negatívnych mutantov Eps15 a knockdown ťažkého reťazca klatínu (CHC) prostredníctvom interferencie s RNA sme preukázali, že endocytóza FcaR je cez dráhu sprostredkovanú klatrínom. Endocytózovaný FcaR prešiel do Rab5- a Rabll-pozitívnych endozómov. Endocytózu FcyR však nebolo možné blokovať dominantne negatívnym mutantom Rab5. Tiež sme demonštrovali, že endocytóza FcaR bola závislá od dynamínu nadmernou expresiou dominantne negatívneho mutanta dynamínu. Preskúmal sa aj potenciálny endocytový motív pre FcyR. Neočakávane sme zistili, že celá cytoplazmatická doména FcaR nebola potrebná pre endocytárny proces FcaR. Dospeli sme k záveru, že endocytóza FcaR je závislá od klatrínu a dynamínu, ale nie je regulovaná pomocou Rab5 a endocytový motív sa nenachádza v cytoplazmatickej doméne FcaR.

úvod

U ľudí je IgA najhojnejšou protilátkou na slizničných povrchoch a druhou najhojnejšou protilátkou v krvi 1, 2 . IgA hrá dôležitú úlohu pri slizničnej aj systémovej imunite 3, 4 . FcaR (CD89), Fc receptor pre IgA, hrá rozhodujúcu úlohu v imunitných reakciách sprostredkovaných IgA spájaním vrodených a adaptívnych imunitných reakcií pri aktivácii efektorových buniek. Väzba IgA s komplexom antigénu na FcaR iniciuje rôzne odpovede a endocytóza je jednou z nich 5, 6 .

Už dlhú dobu je známe, že imunitný komplex s komplexom IgA a IgA možno internalizovať pomocou FcaR7. Základný mechanizmus však zostáva neznámy. Pretože FcyR nemá vo svojej cytoplazmatickej doméne rozpoznané signalizačné motívy, predpokladá sa, že imunitné reakcie vyvolané IgA komplexovaným s antigénom závisia od jeho funkčného spojenia s FcRy reťazcom, ktorý obsahuje ITAM (imunoreceptorový aktivačný motív založený na tyrozíne), signálny motív zdieľaný inými imunitnými receptormi, ako je FcyRI, FcyRIII, BCR, TCR atď. 8, 9, 10 . Aj keď y-reťazec obsahuje dobre charakterizovaný endocytový motív (YXXL), ktorý hrá dôležitú úlohu pri endocytóze a pri prezentácii antigénu 11, niekoľko štúdií potvrdilo, že y-reťazec sa nevyžaduje na endocytózu IgA a IgA imunitných komplexov sprostredkovanú FcyR. , 12 . Namiesto toho je y-reťazec zapojený do intracelulárneho transportu FcaR po endocytóze 12, 13 . Launay a kol. 12 pozorovali, že internalizovaný IgA sa recykloval späť na bunkový povrch, keď FcyR nebol asociovaný s y-reťazcom, zatiaľ čo internalizovaný IgA bol dodaný do lyzozómu na degradáciu po endocytóze, keď je FcyR asociovaný s y-reťazcom. Preto endocytóza IgA pomocou asociovaného FcyR asociovaného s y-reťazcom môže hrať dôležitú úlohu pri udržiavaní koncentrácie IgA v sére tým, že ju chráni pred degradáciou.

Endocytóza membránových receptorov sa môže vyskytovať rôznymi cestami. Dráhy závislé od klatínu a od klatínu nezávislé predstavujú dve hlavné cesty pre internalizáciu receptorov 14, 15, 16 bunkového povrchu. Endocytóza sprostredkovaná klatrínmi, najdôkladnejšie študovaná endocytová dráha, sa vyznačuje tvorbou jamiek potiahnutých klatrínom na plazmovej membráne. Vytváranie potiahnutých jamiek vyžaduje niekoľko zložiek, vrátane klatrínu, AP-2, AP-180, Eps15 atď. Na endotelóze závislej od clatrínu je potrebný GTPázový dynamín 17, 18, 19, ktorý sa podieľa na vzniku pľuzgierikov potiahnutých klatrínom, ktoré sú potom určené pre endozomálne kompartmenty. Na druhej strane endocytóza nezávislá od klatrínov je až donedávna menej dobre známa. Do tejto kategórie patrí niekoľko endocytických dráh, vrátane endocytózy sprostredkovanej caveolami a endocytózy sprostredkovanej lipidovými raftmi, ako aj cesty, ktoré sú nezávislé na klatríne aj na caveolae / lipidovej rafte 20 . Napríklad nedávna štúdia ukázala, že vysokoafinitný receptor IgE (FceRI) je endocytovaný mechanizmom nezávislým od AP-2 / klatínu, ktorý sa zdá byť sprostredkovaný lipidovým plťom a regulovaný dynamínom 21 .

Aj keď existujú rôzne endocytové dráhy pre receptory vstupujúce do buniek, internalizácia, intracelulárny transport a membránová fúzia endocytových vezikúl sú všeobecne regulované podrodinou malých podobných GTPáz podobných Ras (Rab GTPázy) 22, 23 . Bolo identifikovaných približne 40 členov Rab GTPáz a každá z nich sa považuje za špecificky spojenú s konkrétnou organelou alebo cestou. Spomedzi nich je Rab5 lokalizovaný vo vesikulách a skorých endozómoch potiahnutých klatrínom, regulujúcich internalizáciu a skorú fúziu endozómov 24, 25 ; Rabll je lokalizovaný v recyklácii endozómov, regulujúcich endocytovú recykláciu 26, 27, 28 ; Rab7 a Rab9 sú lokalizované v neskorých endozómoch, regulujú transport z skorých do neskorých endozómov a neskorých endómov do trans-Golgi, respektíve 29, 30, 31, 32 . Je známe, že endocytóza a intracelulárne transportovanie mnohých receptorov spojených s G proteínom sú regulované Rab GTPázami 33 .

V tejto štúdii sme demonštrovali, že FcaR je endocytovaný cestou závislou od clatrínu a internalizovaný receptor postupne prechádza do endozómov pozitívnych na Rab5 a Rab11. Endocytóza FcyR vyžaduje dynamín, ale nie je regulovaná pomocou Rab5. Ďalej sme zistili, že cytoplazmatická doména FcaR je postačujúca pre svoju endocytózu.

výsledok

Endocytóza FcaR v bunkách U937

Bunka U937 je ľudská bunková línia s monocytárnymi charakteristikami a prirodzene exprimuje FcaR. Predchádzajúca štúdia ukazuje, že FcaR podlieha rýchlej endocytóze v bunkách U93712. Preto sa bunky U937 použili na skúmanie endocytovej dráhy (ov) FcyR. Niekoľko chemických inhibítorov sa použilo na selektívnu blokádu endocytózy sprostredkovanej klatrínmi alebo caveolami / lipidmi na rafte, čo sú dve endocytové dráhy bežne používané mnohými membránovými receptormi. Ako je znázornené na obrázkoch 1A a 1B, blokovanie endocytózy sprostredkovanej klatrínom hypertonickou sacharózou (0, 4 M), MDC (100 μM) a vyčerpaním K + 34, 35, 36 dramaticky inhibovalo internalizáciu FcaR. Na porovnanie, FcyR endocytóza bola ťažko inhibovaná, keď boli bunky ošetrené Filipínom III (5 μg / ml) alebo nystatínom (50 μg / ml), ktorý je schopný inhibovať endocytózu 37, 38, 39 sprostredkovanú kasavolami / lipidmi.

Image

Endocytóza FcaR v bunkách U937. (A) Bunky U937, ktoré rástli na krycom sklíčku potiahnutom poly-lyzínom, boli ošetrené PMA ( 10, 7 M) počas 24 hodín. Potom boli bunky ošetrené hypertonickou sacharózou (0, 4 M), MDC (100 μM), Filipínom III (5 μg / ml), nystatínom (50 μg / ml), genisteínom (100 μg / ml) alebo herbimycínom A (1 μM) po dobu 60 minút pri 37 ° C alebo podrobené úbytku K +, ako je opísané v časti Materiály a metódy. Bunky sa potom inkubovali s MIP8a-F (ab ') 2 označeným FITC v médiu obsahujúcom inhibítory počas ďalších 60 minút pri 4 ° C, premyli sa a rýchlo preniesli do predhriateho (37 ° C) média obsahujúceho inhibítory a inkubovali sa počas 30 minút na umožnenie endocytózy. Potom boli bunky fixované a jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst 33258 (modrá). Endocytóza sa skúmala konfokálnym laserovým skenovacím mikroskopom. Stĺpec predstavuje 7, 5 um. Údaje predstavujú tri nezávislé experimenty. (B) Kvantitatívna analýza účinku chemických inhibítorov na FcyR endocytózu pomocou prietokovej cytometrie, pozri materiály a metódy. * P <0, 01.

Obrázok v plnej veľkosti

Dráha závislá od klatínu nevyžaduje, ale niektoré cesty závislé od klatrínu vyžadujú aktivitu tyrozínkinázy na internalizáciu ligandu 40, 41, 42 . Skúmali sme teda, či je potrebná tyrozínkinázová aktivita pre FcyR endocytózu s použitím inhibítorov tyrozínkinázy, genisteínu a herbimycínu A. Ako je znázornené na obrázkoch 1A a 1B, ošetrenie buniek genisteínom (100 μg / ml) alebo herbimycínom A (1 μM) Nemal žiadny vplyv na FcyR endocytózu, čo naznačuje, že aktivita tyrozínkinázy nebola potrebná pre FcyR endocytózu a ďalej naznačuje, že endocytóza bola sprostredkovaná cestou závislou od clatrínu.

Endocytóza FcaR v transfekovaných bunkách CHO

Na štúdium mechanizmov endocytózy FcaR sa v bunkách CHO stanovil stabilný transfektant FcaR. Analýza prietokovou cytometriou ukázala, že transfekované CHO bunky exprimovali FcyR na povrchu bunky (obrázok 2A) a boli schopné viazať IgA (obrázok 2B). Molekulová hmotnosť exprimovaného FcaR bola medzi 55 a 75 kDa (obrázok 2C), ktorá bola podobná prirodzene exprimovanému receptoru.

Image

Endocytóza FcaR v stabilne transfekovaných bunkách CHO. (A) CHO bunky stabilne exprimujúce FcaR boli inkubované s MIP8a (čierna čiara) alebo izotypovou kontrolou MOPC21 (plnené) počas 60 minút na ľade, nasledovaná inkubáciou s kozím anti-myším IgG konjugovaným s FITC. (B) CHO bunky (plné) alebo CHO bunky stabilne exprimujúce FcaR (čierna čiara) sa inkubovali s ľudským IgA2 konjugovaným s FITC počas 60 minút na ľade. (C) 5 x 106 CHO buniek alebo CHO buniek stabilne exprimujúcich FcaR sa lyžovalo, FcaR sa purifikovali pomocou guľôčok spojených s mAb anti-FcaR mAb a analyzovali sa westernovým prenosom. (D) Testy chemického inhibítora sa uskutočňovali rovnakým spôsobom ako v bunkách U937 a endocytóza sa skúmala konfokálnym laserovým skenovacím mikroskopom. Stĺpec predstavuje 10 um. Údaje predstavujú najmenej tri nezávislé experimenty. (E) Kvantitatívna analýza účinku chemických inhibítorov na FcyR endocytózu pomocou prietokovej cytometrie, pozri materiály a metódy. * P <0, 05.

Obrázok v plnej veľkosti

Aby sme preskúmali, či je endocytická dráha FcaR v bunkách CHO rovnaká ako v bunkách U937, ktoré prirodzene exprimujú FcaR, vykonali sme testy chemického inhibítora v bunkách CHO stabilne exprimujúcich FcaR. Ako je znázornené na obrázkoch 2D a 2E, tak konfokálna mikroskopia, ako aj analýza prietokovou cytometriou ukázali, že hypertonická sacharóza (0, 4 M), MDC (100 μM) a vyčerpanie K + dramaticky inhibujú endocytózu FcaR, zatiaľ čo Filipín III (5 μg / ml) alebo nystatín (50 μg / ml) μg / ml) to nedokázal. Inhibítory tyrozínkinázy, genisteín (100 μg / ml) a herbimycín A (1 μM) tiež neboli schopné inhibovať endocytózu FcyR v bunkách CHO. Ako kontrola sa bunky CHO, ktoré neboli transfekované FcaR, neviazali alebo internalizovali IgA alebo FITC-konjugovaný MIP8a, čo dokazuje, že endocytóza IgA alebo FITC-konjugovaného MIP8a v transfekovaných CHO bunkách bola sprostredkovaná FcaR, ale nie inými neidentifikovanými receptormi (dáta) neukázané). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že endocytóza FcaR v bunkách CHO nasledovala rovnakú cestu ako v bunkách U937.

Dominantne negatívne mutanty Eps15 inhibujú internalizáciu FcaR

Eps15 je proteín, ktorý sa viaže priamo na adaptér AP-2 na plazmovú membránu a je potrebný na endocytózu sprostredkovanú klatrínom. Nadmerná expresia dominantne negatívnych mutantov Eps15 môže selektívne blokovať endocytózu sprostredkovanú klatrínom 43 . Takže sme nadmerne exprimovali dominantne negatívne mutanty Eps15, aby sme ďalej preskúmali, či bol FcaR internalizovaný prostredníctvom endocytózy sprostredkovanej klatrínmi. EGFP-značená Eps15-D3A2 (kontrola divokého typu (WT), ktorá nemá vplyv na klatrínmi sprostredkovanú endocytózu) a dve dominantne negatívne mutanty označené EGFP, Eps15-DIII a Eps15-EH29, boli prechodne transfekované do buniek CHO stabilne exprimujúci FcaR. Inhibičný účinok mutantov Eps15 na endocytózu sprostredkovanú klatrínom sa skúmal absorpciou transferínu Texas Red (Texas Red-Tfn). Ako je znázornené na obrázkoch 3A a 3B, absorpcia Texas Red-Tfn bola inhibovaná až o 40% až 60%, keď boli bunky transfekované Eps15-EH29 a Eps15-DIII značenými EGFP. ET15-D3A2 označený WT kontrolou EGFP nemal žiadny vplyv na absorpciu Tfn. Podobné výsledky boli pozorované pre endocytózu FcyR. Eps15-EH29 a Eps15-DIII, ale nie Eps15-D3A2, inhibovali internalizáciu FcaR (obrázky 3C a 3D), čo naznačuje, že FcaR sa internalizoval prostredníctvom endocytózy sprostredkovanej klatrínmi.

Image

Nadmerná expresia dominantne negatívnych mutantov Eps15 inhibovala FcyR endocytózu. Bunky CHO stabilne exprimujúce FcaR sa prechodne transfekovali s EGF15-značeným Eps15-D3A2 (kontrola WT), Eps15-DIII alebo Eps15-EH29. 48 hodín po transfekcii sa bunky nechali internalizovať s TRITC-konjugovaným MIP8a-F (ab ') 2 počas 30 minút pri 37 ° C (C) . Na absorpciu transferínu (A) sa bunky nechali hladovať sérum počas 1 hodiny pri 37 ° C a potom sa inkubovali s 50 ug / ml Texas Red-Tfn v DMEM bez séra pri 37 ° C počas 30 minút. Na konci endocytózy sa bunky rýchlo ochladili na 4 ° C, premyli a fixovali. Jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst 33258 (modrá). Endocytóza sa analyzovala konfokálnym laserovým skenovacím mikroskopom. (B) a (D) sú kvantitatívne analýzy vychytávania Tfn a endocytózy FcyR. * P <0, 01. Stĺpce predstavujú 10 μm. Údaje predstavujú najmenej tri nezávislé experimenty.

Obrázok v plnej veľkosti

FcyR endocytóza je zrušená, keď je ťažký reťazec klatrínu vyčerpaný krátkou vlásenkou (shRNA)

Vyššie uvedené inhibičné experimenty s použitím chemických inhibítorov a dominantne negatívnych mutantov Eps15 ukázali, že endocytóza FcaR bola závislá od clatrínu. Na získanie priameho dôkazu sa na zrážanie ťažkého reťazca klatrínu (CHC) použila RNA interferencia. Najprv sme sa pokúsili knockdown CHC v bunkách CHO, ale zlyhali (údaje nie sú uvedené). Vzhľadom na to, že naša cieľová sekvencia (GTA ATC CAA TTC GAA GAC C) proti CHC je konzervovaná iba u ľudí a myší, ale nie u potkanov, predpokladali sme, že táto cieľová sekvencia sa nemusí zachovať ani v CHO bunkách pochádzajúcich z škrečkov. Preto sme namiesto toho použili bunky Hela pochádzajúce z človeka. FcaR bol kotransfekovaný vektorom pSUPER (falošná kontrola) alebo pSUPER-shRNA CHC v Hela bunkách a potom bola vyšetrená endocytóza FcaR. Hladina expresie klatrínu v Hela bunkách bola evidentne znížená 72 hodín po transfekcii pSUPER-shRNA CHC, ako bolo stanovené pomocou westernového prenosu (obrázky 4A a 4B). Imunofluorescenčné farbenie CHC tiež ukázalo, že CHC sa úspešne vyčerpala v pSUPER-shRNA CHC-transfekovaných bunkách, ale nie v pSUPER-transfekovaných bunkách (obrázok 4C). Ako je znázornené na obrázkoch 4C a 4D, FcaR bol schopný internalizovať, keď boli bunky kotransfektované vektorom pSUPER, ale endocytóza bola zrušená, keď bola kotransfektovaná pSUPER-shRNA CHC. Tieto výsledky demonštrovali, že FcaR bol internalizovaný cestou klatínu závislou cestou v Hela bunkách.

Image

Vyčerpanie ťažkého reťazca klatrínu pomocou shRNA odstránilo endocytózu FcyR v Hela bunkách. (A) Deplécia CHC sa analyzovala pomocou Western blotu. Hela bunky boli transfekované s pSUPER-shRNA CHC. Po 72 hodinách po transfekcii sa lýzovali rovnaké počty buniek, oddelili sa 5% -18% SDS-PAGE a preniesli sa na nitrocelulózovú membránu. CHC sa detegoval myšacím monoklonálnym Abs TD-1. (B) Relatívna expresia CHC bola kvantifikovaná denzitometriou. Údaje sú z troch nezávislých experimentov. * P <0, 01. (C) Endocytóza FcaR v Hela bunkách kotransfektovaných s PCDNA3.1-FcaR a pSUPER-shRNA CHC. Po 72 hodinách po transfekcii sa bunky nechali internalizovať s TRITC-konjugovaným MIP8a-F (ab ') 2 (červený) počas 30 minút pri 37 ° C. Na konci endocytózy sa bunky fixovali, permeabilizovali a CHC sa zafarbili králičími anti-klatrínovými polyklonálnymi ťažkými reťazcami a následne kozím anti-králičím IgG konjugovaným s FITC. Jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst 33258 (modrá). Endocytóza FcaR sa skúmala konfokálnym laserovým skenovacím mikroskopom. Stĺpec predstavuje 10 um. Údaje predstavujú tri nezávislé experimenty. (D) Kvantitatívna analýza FcyR endocytózy po deplécii CHC. * P <0, 01.

Obrázok v plnej veľkosti

Na ďalšie skúmanie toho, či je clatrín potrebný pre endocytózu FcaR v bunkách U937, ktoré prirodzene exprimujú tento receptor, sme použili lentivírusový shRNA vektor pLVTHM na knockdown CHC v bunkách U937. Bunky U937 boli infikované vírusmi balenými do buniek 293T a bunky s vysokou úrovňou expresie GFP boli triedené pomocou FACS. Western blot ukázal, že expresia CHC v shRNA bunkách CHC U937 klesla na 18% falošných shRNA buniek (obrázok 5A), čo bolo v súlade s výsledkom imunofluorescenčného farbenia CHC, čo ukazuje, že farbenie CHC v bunkách CHC knockdown bolo významne slabšie ako v kontrolné bunky (obrázok 5C). Potom sa skúmala endocytóza FcaR v CHC knockdown U937 bunkách. Ako je znázornené na obrázku 5D, FcyR endocytóza v CHC knockdown bunkách sa výrazne znížila. Kvantitatívna analýza prietokovou cytometriou ukázala, že endocytóza FcaR v CHC knockdown U937 bunkách klesla na 28% kontroly (obrázok 5B), čo demonštruje, že endocytóza FcaR v bunkách U937 bola závislá od clatrínu.

Image

Knockdown CHC v bunkách U937 inhibuje FcyR endocytózu. (A) CHC expresia v U937 bunkách stabilne infikovaných pLVTHM alebo pLVTHM-shRNA CHC sa analyzovala westernovým prenosom. Celkom 30 ug proteínu z každého bunkového lyzátu sa separovalo pomocou 5% -18% SDS-PAGE, prenieslo sa na nitrocelulózovú membránu a CHC sa detegoval myšacou monoklonálnou protilátkou Abs TD-1. Číslo pod každým jazdným pruhom je relatívna hladina expresie CHC kvantifikovaná denzitometriou. (B) Kvantifikácia FcyR endocytózy v CHC bunkách pLVTHM a pLVTHM-shRNA prietokovou cytometriou. Údaje sú z troch nezávislých experimentov. * P <0, 01. (C) Skúmanie expresie CHC v bunkách U937 stabilne infikovaných pLVTHM alebo pLVTHM-shRNA CHC sa uskutočňovalo konfokálnym laserovým skenovacím mikroskopom. Bunky, ktoré rástli na krycom sklíčku, sa fixovali, permeabilizovali a zafarbili králičími anti-klatrínovými polyklonálnymi ťažkými reťazcami a následne kozím anti-králičím IgG konjugovaným s FITC. Jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst 33258 (modrá). (D) Endocytóza FcaR v bunkách U937 stabilne infikovaných pCVTHM alebo pLVTHM-shRNA CHC. Bunky boli inkubované s TRITC-konjugovaným MIP8a-F (ab ') 2 počas 60 minút pri 4 ° C, premyté studeným HBSS a potom inkubované pri 37 ° C počas 30 minút, aby sa umožnila endocytóza. Po endocytóze boli bunky fixované a jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst 33258 (modrá). Stĺpec predstavuje 15 um. Údaje sú reprezentatívne pre štyri nezávislé experimenty.

Obrázok v plnej veľkosti

Endocytovaný FcyR je lokalizovaný v Rab5- a Rab11-pozitívnych endozómoch, ale endocytóza FcaR nie je regulovaná pomocou Rab5.

Malé GTPázy široko regulujú endocytózu, vnútrobunkový transport a membránovú fúziu endocytových vezikúl. Rab5, Rab11, Rab7 a Rab9 sú uznávané ako markery pre skoré endozómy, recyklačné endozómy a neskoré endozómy. Preskúmali sme, či FtaR bol prítomný v týchto malých endozómoch obsahujúcich GTPázu počas endocytózy a intracelulárneho transportu. Na vizualizáciu kolokalizácie FcaR s týmito proteínmi Rab sa CHO bunky stabilne exprimujúce FcaR prechodne transfekovali plazmidmi kódujúcimi E5P-Rab5, Rabl, Rab7 alebo Rab9 označený EGFP. 48 hodín po transfekcii bol FcaR exprimovaný na bunkovom povrchu značený pomocou TRITC-konjugovaného MIP8a-F (ab ') 2, monoklonálnej protilátky (mAb) špecificky proti FcaR. Potom sa bunky inkubovali pri 37 ° C, aby sa umožnila endocytóza. Lokalizácia internalizovaných proteínov FcaR a EGFP-Rab sa stanovila konfokálnou mikroskopiou. Obrázok 6A ukazuje, že internalizovaný FcaR kolonizovaný s Rab5 a Rab11 30 minút po endocytóze. Analýza časového priebehu kolokalizácie ukázala, že FcaR kolonizovaný s Rab5 už 5 minút po inkubácii buniek pri 37 ° C (doplnková informácia, obrázok S1A). Táto kolokalizácia dosiahla maximum po 30 minútach a potom pomaly klesala. Kolokalizácia FcaR s Rabll sa pozorovala po 10 minútach a dosiahla maximum po 60 minútach, potom sa znížila v priebehu nasledujúcich 3 hodín (doplňujúce informácie, obrázok S1B). Na porovnanie, malá kolokalizácia medzi FcaR a Rab7 alebo Rab9 sa pozorovala počas celého časového priebehu (doplnkové informácie, obrázok S2). Tieto údaje naznačujú, že internalizovaný FcaR prešiel do Rab5-pozitívnych skorých endozómov, potom sa možno recykloval späť na povrch buniek prostredníctvom Rab11-pozitívnych recyklačných endozómov, ale neboli dodané do neskorých endozómov.

Image

Kolokalizácia endocytovaného FcyR pomocou Rab5 a Rab11. Bunky CHO stabilne exprimujúce FcaR sa prechodne transfekovali s Rab5, Rabl alebo Rab5-S34N značeným EGFP. 48 hodín po transfekcii boli bunky inkubované s TRITC-konjugovaným MIP8a-F (ab ') 2 počas 60 minút pri 4 ° C. Nadbytok ligandov sa premyl a bunky sa preniesli do predhriateho média (37 ° C), aby sa umožnila endocytóza počas 30 minút. Jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst 33258 (modrá). Endocytóza FcaR sa skúmala konfokálnym laserovým skenovacím mikroskopom. (A) Kolonizácia internalizovaného TRIPC-konjugovaného MIP8a-F (ab ') 2 s Rab5 (horný panel) alebo Rab11 (dolný panel). (B) Účinok Rab5-S34N na FcyR endocytózu. Stĺpce predstavujú 10 μm. Údaje predstavujú najmenej tri nezávislé experimenty.

Obrázok v plnej veľkosti

Rab5-S34N je dominantne negatívny mutant Rab5, o ktorom sa ukázalo, že je schopný inhibovať endocytózu niektorých receptorov 33 . Pretože FcaR bol kolokalizovaný pomocou Rab5, ďalej sme skúmali, či endocytóza FcaR bola regulovaná pomocou Rab5. 48 hodín po transfekcii Rab5-S34N značeného EGFP v bunkách CHO stabilne exprimujúcich FcaR sa bunky nechali internalizovať s TRITC-konjugovaným MIP8a-F (ab ') 2 počas 30 minút pri teplote 37 ° C. Ako je znázornené na obrázku 6B, nadmerná expresia dominantne negatívneho mutantu Rab5 neblokovala internalizáciu FcaR v bunkách CHO, čo naznačuje, že endocytóza FcaR nebola regulovaná pomocou Rab5.

FcyR endocytóza je závislá od dynamínu

Clathrin-dependentná a podmnožina endotelózy nezávislej od clatrinov vyžaduje aktivitu dynamínu, GTPázy zodpovednej za štiepenie vezikúl z plazmatickej membrány, a tým poháňanie internalizácie nákladu do vezikúl 17, 18, 19 . Aby sa určilo, či internalizácia FcyR bola závislá od dynamínu, WT dynamín značený HA (Dyn-WT-HA) alebo dominantne negatívny dynamínový mutant K44A (Dyn-K44A-HA) sa prechodne transfekovali do CHO buniek stabilne exprimujúcich FcaR. Podobne ako v prípade Tfn (obrázky 7A a 7B) bola endocytóza FcyR dramaticky znížená v bunkách exprimujúcich dominantne negatívny dynamínový mutant, ale nie v bunkách exprimujúcich dynamín WT (obrázky 7C a 7D), čo naznačuje, že na endocytózu FcaR bol potrebný dynamín.

Image

FcyR endocytóza je závislá od dynamínu. Bunky CHO stabilne exprimujúce FcaR sa prechodne transfekovali s divokým typom dynamínu značeného HA (Dyn-WT-HA) alebo s dominantne negatívnym mutantným dynamínom K44A (Dyn-K44A-HA). 48 hodín po transfekcii sa bunky nechali internalizovať s TRITC-konjugovaným MIP8a-F (ab ') 2 počas 30 minút pri 37 ° C ( C ). Na absorpciu Tfn ( A ) sa bunky nechali hladovať sérum počas 1 hodiny pri 37 ° C, potom sa inkubovali s 50 μg / ml Texas Red-Tfn v DMEM bez séra pri 37 ° C počas 30 minút. Na konci endocytózy boli bunky rýchlo ochladené na 4 ° C, premyté, fixované a jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst 33258 (modrá). Endocytóza sa analyzovala konfokálnym laserovým skenovacím mikroskopom. ( B) a ( D) sú kvantitatívne analýzy vychytávania Tfn a endocytózy FcyR. * P <0, 01. Stĺpce predstavujú 10 μm. Údaje predstavujú najmenej tri nezávislé experimenty.

Obrázok v plnej veľkosti

Endocytový motív FcaR sa nenachádza v cytoplazmatickej doméne FcaR

Triedenie transmembránových proteínov na endozómy je sprostredkované konsenzuálnymi motívmi prítomnými v cytoplazmatických doménach týchto proteínov. Najbežnejšími endocytovými motívmi sú motívy na báze tyrozínu YXXØ (X znamená akúkoľvek aminokyselinu a Ø znamená aminokyselinový zvyšok s objemným hydrofóbnym účinkom). bočné reťazce) a signály založené na dileucíne [DE] XXXL [LI] alebo DXXLL 44 . Pretože v cytoplazmatickej doméne FcyR sa nenachádzajú žiadne také konzervované motívy, uvažujeme, že za nerozpoznaný motív v cytoplazmatickej doméne môže byť zodpovedný za endocytózu FcyR. Na testovanie tejto hypotézy bola odstránená celá cytoplazmatická doména FcaR (41 aminokyselín). Tento bez chvosta FcyR bol prechodne transfektovaný v bunkách COS-7 a stabilne transfektovaný v bunkách CHO. Analýza prietokovou cytometriou ukázala, že tento chvostový FcyR bol schopný sa exprimovať na povrchu bunky a viažu IgA v rovnakom rozsahu ako receptor s úplnou dĺžkou (údaje nie sú uvedené). Výsledky endocytózy ukázali, že rovnako ako receptor s úplnou dĺžkou, FcyR bez chvosta sa mohol internalizovať tak v bunkách COS-7 (obrázok 8A), ako aj v bunkách CHO (obrázok 8B).

Image

Cytoplazmatická doména FcaR nie je potrebná pre svoju endocytózu. FcyR a FcyR bez chvosta boli prechodne transfekované v bunkách COS-7 (A) alebo stabilne transfekované v bunkách CHO (B) . Bunky sa inkubovali s FIPC-konjugovaným MIP8a-F (ab ') 2 počas 60 minút pri 4 ° C, potom sa premyli a rýchlo preniesli do predhriateho (37 ° C) média a inkubovali sa 30 minút, aby sa umožnila endocytóza. Endocytóza sa skúmala fluorescenčným mikroskopom. (C) Endocytóza bez chvosta FcyR stabilne transfekovaná v bunkách CHO v prítomnosti sacharózy (0, 4 M), MDC (100 μM) alebo Filipínu III (5 μg / ml). Endocytóza sa skúmala fluorescenčným mikroskopom. (D) Endocytóza bez chvosta FcaR v CHC knockdown Hela bunkách. Hela bunky boli kotransfektované s PCDNA3.1-chvostom bez FcaR a pSUPER alebo pSUPER-shRNA CHC. Po 72 hodinách po transfekcii sa bunky nechali internalizovať s TRITC-konjugovaným MIP8a-F (ab ') 2 počas 30 minút pri 37 ° C. Na konci endocytózy sa bunky fixovali, permeabilizovali a CHC sa zafarbili králičími anti-klatrínovými polyklonálnymi ťažkými reťazcami a následne kozím anti-králičím IgG konjugovaným s FITC. Jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst 33258 (modrá). Endocytóza sa skúmala konfokálnym laserovým skenovacím mikroskopom. Stĺpec predstavuje 15 um. Údaje predstavujú tri nezávislé experimenty. (E) Kinetická analýza endocytózy FcaR a FcyR bez chvosta v stabilne transfekovaných CHO bunkách prietokovou cytometriou. (F) Kvantitatívna analýza endocytózy FcyR bez chvosta v bunkách Hela knockdown CHC. * P <0, 01.

Obrázok v plnej veľkosti

Aby sa otestovalo, či je tento chvostový FcyR bez chvosta internalizovaný rovnakou cestou ako receptor s úplnou dĺžkou, použili sa chemické inhibítory endocytózy sprostredkovanej klatrinmi alebo kalachami / lipidmi vormi. Ako je znázornené na obrázkoch 8C a 8E, hypertonická sacharóza (0, 4 M) a MDC (100 μM), ale nie Filipín III (5 μg / ml), inhibovala endocytózu bez chvosta FcyR, čo naznačuje, že tento chvost bez FcyR bol tiež endocytovaný cestou klatrinovej závislosti. Ďalej bol FtaR bez chvosta kotransfektovaný CHC pSUPER alebo pSUPER-shRNA v Hela bunkách, ako to bolo urobené pre FcyR s úplnou dĺžkou. Ako sa očakávalo, CHC sa vyčerpala v pSUPER-shRNA CHC-transfekovaných bunkách, ale nie v pSUPER-transfekovaných bunkách. Okrem toho bola tiež inhibovaná endocytóza bez chvosta FcaR v CHC knockdown Hela bunkách (obrázky 8D a 8F). Tieto údaje demonštrovali, že endocytóza bez chvosta FcyR bola, rovnako ako FcyR s úplnou dĺžkou, tiež cestou klatrinovej závislosti.

Tiež sme porovnávali kinetiku endocytózy FcyR a FcyR bez chvosta v stabilne transfekovaných bunkách CHO a výsledok nepreukázal žiadny rozdiel medzi nimi (obrázok 8E). Tieto údaje naznačujú, že endocytóza FcyR s plnou dĺžkou a FcyR bez chvosta sleduje rovnakú dráhu závislú od clatrínu, ale cytoplazmatická doména sa nevyžaduje pre endocytózu FcyR.

diskusia

Aj keď je endocytóza dobre známou vlastnosťou FcyR, mechanizmus zostáva neznámy. Predchádzajúce štúdie ukázali, že FcaR sa po zosieťovaní 30 s redistribuoval do lipidovej plte, ale toto prerozdelenie sa znížilo na základnú úroveň do 5 minút pred endocytózou 9, 10 . Okrem toho FcaR nebol kolonizovaný s lipidovým plťovým markerom, GM-1 10 . Tieto výsledky naznačujú, že endocytóza FcaR nebola sprostredkovaná lipidovým plťom. V tejto štúdii sme skúmali endocytovú dráhu FcyR a preukázali sme, že FcaR sa internalizovala cestou závislou od klatrínu a dynamínu.

Endocytóza FcyR bola blokovaná hypertonickou sacharózou, MDC a K + depléciou, ale nie nystatínom a Filipínom III, čo naznačuje, že FcaR prešiel endocytózou cestou klatrin-dependentnej dráhy, ale nie prostredníctvom endocytózy sprostredkovanej caveolami alebo lipidmi. Okrem toho sa na endocytózu FcyR nevyžadovali tyrozínkinázy, pretože genisteín a herbimycín A neinhibovali endocytózu FcyR. Je to veľmi podobné FcyRI (CD64), ktoré môžu podstúpiť endocytózu v neprítomnosti y-reťazca spôsobom nezávislým od tyrozínkinázy 45 . Na porovnanie, tyrozínkináza je potrebná pre endocytózu FcyRIIA 46 . Tieto údaje naznačujú, že endocytóza rôznych Fc receptorov je diferencovane regulovaná tyrozínkinázou.

Na overenie výsledkov experimentov s chemickými inhibítormi sa použili dominantne negatívne mutanty Eps15, ktoré môžu špecificky inhibovať endocytózu sprostredkovanú klatrínmi 43 . Ako je znázornené na obrázku 3, expresia oboch mutantov, ale nie kontrola WT Eps15, blokovala endocytózu FcaR. To ďalej demonštrovalo, že FcaR sa internalizoval prostredníctvom endocytózy sprostredkovanej klatrínom. Okrem toho sa endocytóza FcyR zrušila, keď sa ťažký reťazec klatrínu vyčerpal pomocou shRNA, čo poskytuje priamy dôkaz, že na endocytózu FcyR sa vyžadoval clatrín. Celkovo tieto dáta ukazujú, že endocytóza FcaR je sprostredkovaná klatrínom.

FcaR je exprimovaný na rôznych myeloidných bunkách buď ako monoméry alebo multiméry spojené s reťazcom FcR-y12. Predchádzajúce štúdie s použitím buniek IIA1.6 a RBL-2H3 ukázali, že γ-reťazec FcR nebol potrebný pre endocytózu IgA a IgA imunitných komplexov 9, 12 sprostredkovanú FcyR. Tu sme demonštrovali, že FcaR bol schopný podstúpiť endocytózu v transfekovaných bunkách CHO, COS-7 a Hela, ktoré nie sú myeloidnými bunkami a nemajú y-reťazec. Preto je endocytóza vnútornou charakteristikou samotného FcaR v rôznych druhoch buniek bez ohľadu na prítomnosť y-reťazca FcR.

Hoci FcyR reťazec nie je potrebný pre FcyR endocytózu, po vstupe do bunky môže ovplyvniť osud FcyR. Predchádzajúca štúdia ukázala, že v transfekovaných RBL bunkách bol internalizovaný FcaR-R209L (mutantný FcaR, kde arginín 209 v transmembránovej oblasti je nahradený lyzínom, a preto sa nemôže asociovať s y-reťazcom), bol vyfarbený pomocou Tfn 12, známeho markera pre cesta recyklácie endocytózy. V súlade s týmito výsledkami sme zistili, že internalizované FcaR prešli do skorých endozómov pozitívnych na Rab5 a Rab11 a recyklovali endozómy a ťažko sa dostalo do neskorých endozómov pozitívnych na Rab7 a Rab9. Naopak, keď bol FcyR spojený s y-reťazcom, endocytovaný ligand bol triedený na lyzozómy na degradáciu a ďalej na prezentáciu antigénu 13 . Preto y-reťazec hrá dôležitú úlohu pri určovaní intracelulárnych transportných ciest FcaR po endocytóze 12, 13 .

Aj keď sa ukázalo, že Rab5 je schopný regulovať endocytózu niektorých membránových receptorov 33, nadmerná expresia dominantne negatívneho mutantu Rab5 (Rab5-S34N) nemala v tejto štúdii žiadny vplyv na endocytózu FcaR. To naznačuje, že endocytóza FcaR nie je regulovaná pomocou Rab5, podobný jav bol hlásený aj pre iné receptory 47, 48 .

Predpokladá sa, že signály pre endocytózu sprostredkovanú klatrínom spočívajú v cytoplazmatickej doméne membránových receptorov. Pretože v cytoplazmatickej doméne FcaR neexistujú žiadne také konzervované endocytové motívy, uvažovali sme, rovnako ako iné 13,, že v cytoplazmatickej doméne FcaR by mohol byť nejaký nerozpoznaný motív, ktorý by mohol interagovať s endocytárnym aparátom a sprostredkovať endocytózu FcyR. Prekvapivo sme však zistili, že FcaR by sa mohol stále internalizovať, keď sa odstránila celá cytoplazmatická doména. Zaujímavejšie je, že endocytóza tohto chvostového FcaR bola inhibovaná hypertonickou sacharózou, MDC a knockdown CHC, čo dokazuje, že endocytóza bez chvosta FcaR bola tiež závislá od clatrínu. Toto zistenie je však v súlade so skutočnosťou, že v cytoplazmatickej doméne FcaR sa nenachádzajú žiadne konzervované endocytové motívy. Niekoľko štúdií ukázalo, že signály pre endocytózu by sa mohli lokalizovať v extracelulárnej a / alebo transmembránovej doméne receptora 45, 49, 50 . For example, it has been reported that endocytic motif of another Fc receptor, FcγRI (CD64), localizes within the extracellular domain of the receptor rather than the transmembrane or cytoplasmic domain 45 . How FcαR could be internalized through clathrin-mediated endocytosis in the absence of its cytoplasmic domain is not clear at present.

First, it is possible that the endocytic motif for FcαR might also be localized within the extracellular domain of FcαR, just like FcγRI. The extracellular region of FcαR contains two Ig-like domains, EC1 and EC2. EC1 contains the binding site for IgA, and our mAb against FcαR also recognizes EC1. Deletion of EC1 will result in a receptor without the capacity to bind its natural ligand and our mAb will not recognize it. FcαR without the entire EC2 domain is actually an isoform of FcαR, which is generated through alternative splicing 5 . This isoform of FcαR has been only detected at mRNA level, and no surface expression on natural cells has been reported 51 . So, EC2 is important for the surface expression of FcαR. Therefore, to characterize the exact endocytic motif of FcαR, one would need to make site-directed mutations within its extracellular or transmembrane domain.

Second, we think that characterizing endocytic adaptors of FcαR is more important, because wherever the endocytic motif is localized, this motif must interact with the endocytic adaptors to accomplish endocytosis. So, we have tried to identify FcαR-interacting endocytic adaptors (or other transmembrane molecules) by CoIP. However, silver staining generated many weak bands (data not shown), which were difficult to characterize and might reflect non-specific bindings. Other techniques, such as yeast two-hybrid screening, might be able to identify FcαR-interacting proteins.

In conclusion, we demonstrate that FcαR is able to be internalized through clathrin-mediated endocytosis in the absence of its cytoplasmic domain. Our data shed new light on the mechanism of clathrin-mediated endocytosis by showing that the endocytic motif does not have to be localized in the cytoplasmic domain of the receptor. Further studies are needed for characterizing the exact endocytic motif of FcαR and endocytic adaptors that help tail-less FcαR accomplish endocytosis. Better understanding of the mechanisms of FcαR endocytosis will help us elucidate the role of this receptor in regulating serum IgA homeostasis and IgA-mediated immune responses.

Materiály a metódy

Antibody and agents

The murine anti-FcαR mAb MIP8a, rabbit anti-FcαR polyclonal antibody, FITC or tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC, USA)-labeled F(ab′) 2 fragments of MIP8a and human IgA 2 were prepared as described previously 52, 53, 54 . Rabbit anti-clathrin heavy chain (CHC) polyclonal antibody (ab21679) was from Abcam (Cambridge, UK), mouse anti-CHC mAb (TD-1) was from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, USA). Goat anti-HA polyclonal antibody, HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polyclonal antibody and FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG polyclonal antibody were from Zhongshan Biotechnology Co (Beijing, China). Sucrose, monodansylcadaverine crystalline (MDC), Filipin III, nystatin, genistein, herbimycin A and phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) were from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Texas Red-conjugated Tfn was from Invitrogen (Carlsbad, USA).

plazmidy

The cDNA of FcαR was cloned from human peripheral white blood cells by reverse transcription PCR, and inserted into the Bam HI and Xho I sites of pcDNA 3.1 vector (Invitrogen). The tail-less FcαR (the entire cytoplasmic domain of FcαR was deleted) was constructed by standard PCR procedure and inserted into pcDNA3.1 vector at the same sites. EGFP-tagged Eps15-EH29, DIII and D3Δ2 were provided by Dr Alexandre Benmerah 43 . HA-tagged WT dynamin and its dominant-negative mutant K44A were provided by Dr Sandra Schmid 19 . EGFP-tagged Rab7, Rab9 and Rab11 were gifts from Dr Richard E Pagano 55 . EGFP-tagged Rab5 and Rab5-S34N were provided by Dr Feng Du (Tsinghua University, China).

Bunková kultúra a transfekcia

U937 cells were grown in RPMI1640 containing 10% fetal bovine serum, and CHO, COS-7 and Hela cells were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum and antibiotics, at 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO 2 . Cells were transfected with plasmids encoding of FcαR using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Stably transfected CHO cells were selected with 800 μg/ml G418 and were evaluated for receptor expression by flow cytometry and western blot. Cells stably expressing FcαR were transiently transfected with EGFP-tagged WT and dominant-negative mutant of Eps15, HA-tagged dynamin WT and K44A or EGFP-tagged Rab GTPases using Lipofectamine 2000.

Manipulation of endocytic pathways by chemical inhibitors

Because the expression level of FcαR on U937 cells is relatively low, the signal of FcαR staining under laser-scanning confocal microscopy is weak. So, PMA was used to increase the expression level of FcαR 12 . U937 cells that grew on poly-lysine-coated coverslip were treated with 10 −7 M PMA for 24 h before experiments. CHO cells stably expressing FcαR were cultured as described above. 24 h prior to experiments, cells were seeded onto coverslip placed in 24-well plates and cultured for another 24-48 h. On the day of experiment, cells were pretreated with 0.4 M sucrose, 100 μM MDC, 5 μg/ml Filipin III, 50 μg/ml nystatin, 100 μg/ml genistein or 1 μM herbimycin A for 1 h at 37 °C. K + depletion was done according to the procedure of Altankov and Grinnell 36 . Briefly, cells were rinsed once with potassium-free buffer (140 mM NaCl, 20 mM Hepes, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mg/ml D-glucose, pH 7.4), then incubated in hypotonic medium (50% potassium-free buffer/50% H 2 O) for 5 min at 37 °C, followed by incubation in potassium-free buffer for 20 min at 37 °C. Cells were then cooled to 4 °C and incubated with FITC or TRITC-labeled MIP8a-F(ab′) 2 in medium or potassium-free buffer at 4 °C for 30 min. Cells were washed with cold HBSS (or potassium-free buffer), then transferred quickly into pre-warmed (37 °C) medium supplemented with inhibitors or potassium-free buffer, followed by incubation at 37 °C for various times to allow for endocytosis. Controls constituted of equal volume of respective solvent added in medium. In K + depletion assay, control was conducted with 10 mM KCl added in potassium-free buffer. At the end of endocytosis, cells were placed on ice, fixed with 4% paraformaldehyde and mounted. The inhibition of endocytosis was determined by confocal microscopy and quantified by flow cytometry.

Prietoková cytometria

To analyze the expression of FcαR on CHO cells, stably transfected cells were incubated with MIP8a or isotype control MOPC21 (Sigma-Aldrich) in 1% BSA/PBS followed by incubation with FITC-conjugated goat anti-mouse IgG. Then samples were analyzed by a flow cytometer (FACS Aria, USA). For IgA binding, CHO cells or FcαR stably transfected CHO cells were incubated with FITC-conjugated human IgA2 in 1% BSA/PBS for 60 min on ice, then washed and analyzed by flow cytometry.

Endocytosis of FcαR in U937 cells and stably transfected CHO cells was quantified by flow cytometry. Cells were incubated with MIP8a in medium (or medium containing inhibitors) for 60 min on ice, washed with cold HBSS thrice (for U937 cells, cells were centrifuged at 400 × g for 2 min after each wash), then cells were incubated in medium (or medium containing inhibitors) at 37 °C to allow for endocytosis for various times. The control sample was placed on ice all the time (Time 0). At the end of endocytosis, cells were cooled to 4 °C quickly by rinsing twice with cold HBSS; FcαR remaining on cell surface after endocytosis were stained with FITC-conjugated goat anti-mouse IgG by incubating in 1% BSA/PBS/AZ at 4 °C for 45 min. Then, cells were washed with cold 1% BSA/PBS/AZ thrice and analyzed by flow cytometry (CHO cells were detached by trypsin digestion before analysis). The percentage of FcαR endocytosis was calculated as: (MIP8a on cell surface at 4 °C (Time 0)−MIP8a on cell surface after 37 °C incubation)/ MIP8a on cell surface at 4 °C (Time 0) ×100%.

Immunofluoresence and confocal microscopy

CHO cells stably expressing FcαR were allowed to grow on coverslip as described above. 24 h later, cells were transfected with EGFP-tagged Eps15-EH29, DIII, D3Δ2, HA-tagged dynamin WT, dynamin K44A or EGFP-tagged Rab GTPases. In shRNA experiment, Hela cells were cotransfected with pcDNA3.1-FcαR and pSUPER-shRNA CHC at the ratio of 1:1. At 48 h posttransfection, cells were cooled to 4 °C and incubated with FITC or TRITC-labeled MIP8a-F(ab′) 2 in medium at 4 °C for 60 min, then washed with cold HBSS and transferred quickly into pre-warmed (37 °C) medium, followed by incubation at 37 °C for various times. At the end of endocytosis, cells were placed on ice and fixed with 4% paraformaldehyde. To detect HA and clathrin, cells were permeabilized by 0.2% Triton X-100 for 10 min at room temperature, then blocked with 5% horse serum for 30 min. Cells were incubated with rabbit anti-clathrin heavy chain polyclonal antibody or goat anti-HA polyclonal antibody in 1% BSA/PBS for 60 min at room temperature, then washed with 1% BSA/PBS, followed by incubation with FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG or rabbit anti-goat IgG for another 60 min at room temperature. Then, cells were washed and nuclei were stained with Hoechst 33258 (Merck & Co, USA). The colocalization of endocytosed MIP8a-F(ab′) 2 and Rabs GTPases during various time points was determined by a confocal laser-scanning microscope system (Leica TCS SP2 SE, Germany) with 100×1.44 numerical aperture oil immersion lens. The effects of Eps15, dynamin and Rabs GTPases on FcαR endocytosis were also examined by confocal microscopy. Each image was a single confocal slice. For quantitative analysis, the fluorescence intensity of endocytosed TRITC-conjugated MIP8a-F(ab′) 2 within cells were quantified by Image J software (NIH, USA). In each experiment, 100 untransfected cells and 100 transfected cells were quantified for their endocytosis of TRITC-conjugated MIP8a-F(ab′) 2, and the results were expressed as mean ± SEM.

Transferrin endocytosis assay

First, cells were serum starved by incubation in medium without serum for 1 h at 37 °C. Then, cells were incubated with 50 μg/ml Texas Red-Tfn in medium without serum at 37 °C for various times. At the end of endocytosis, cells were cooled to 4 °C quickly and washed with cold HBSS. Then, cells were fixed, stained with Hoechst 33258, mounted and analyzed as described above.

RNA interferencia

Target sequence of shRNA duplexes against CHC (GTA ATC CAA TTC GAA GAC C) was obtained from a published study 56 . For the expression of shRNA, oligonucleotides containing target sequence to CHC were synthesized and duplex oligo DNA was inserted into the pSUPER vector (Oligoengine, USA). This plasmid DNA was cotransfected with pcDNA3.1-FcαR in Hela cells. At 72 h posttransfection, the efficiency of CHC depletion and its influence on FcαR endocytosis were examined by confocal microscopy. To knockdown CHC in U937 cells, a lentiviral shRNA vector pLVTHM 57 was used. pLVTHM expresses GFP and shRNA simultaneously, therefore infected cells can be easily detected by fluorescent microscopy and also can be sorted by FACS. The same target sequence of CHC was cloned in pLVTHM. pLVTHM or pLVTHM-shRNA CHC was cotransfected with packaging vector psPAX2 and envelope vector pMD2.G into 293T cells. Then U937 cells were infected with supernatants from packing cells supplemented with 8 μg/ml Polybrene. After 3 infections, cells with high GFP expression level were sorted by FACS. The expression of CHC in GFP-positive U937 cells was determined by western blot and fluorescent staining.

Western blot

To validate FcαR stably expressed in CHO cells, FcαR from 5×10 6 cells was purified with anti-FcαR mAb-coupled beads as described previously 50, separated by 10% SDS-PAGE and transferred onto a nitrocellulose membrane. After blocking with 5% defatted milk for 1 h at room temperature, membranes were incubated with rabbit anti-FcαR polyclonal antibody (1: 500) overnight at 4 °C. Then, membranes were washed with PBS containing 0.05% Tween-20 and incubated with HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (1: 3 000) at room temperature for 1 h. Then membranes were visualized by SuperSignal West Pico chemiluminescent substrate (Pierce, USA). In RNA interference experiment, depletion of CHC was also examined by western blot. Briefly, 72 h posttransfection, equal number of pSUPER or pSUPER-shRNA CHC-transfected cells was lysed with loading buffer and separated by 5%-18% SDS-PAGE, then proteins were transferred onto a nitrocellulose membrane. Mouse monoclonal anti-CHC antibody (TD-1) was used to detect CHC (1: 200).

( Supplementary information is linked to the online version of the paper on the Cell Research website.)

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplňujúce informácie, obrázok S1

    Time course of colocalization of internalized FcαR with Rab5 and Rab11.

  2. 2.

    Doplňujúce informácie, obrázok S2

    Internalized FcαR were not colocalized with Rab7 and Rab9.