Dodanie DNA do segmentov ľudskej pečene "ex vivo" génová terapia

Dodanie DNA do segmentov ľudskej pečene "ex vivo" génová terapia

Anonim

abstraktné

Hydrodynamická injekcia je účinný postup pre génovú terapiu pečene u hlodavcov, ale s obmedzenou účinnosťou u veľkých zvierat pomocou „ in vivo “ adaptovaného regionálneho systému na dodávanie hydrodynamického génu. Študujeme schopnosť tohto postupu sprostredkovať dodávanie génov v ľudských pečeňových segmentoch získaných chirurgickou resekciou. Vodotesné pečeňové segmenty sa retrográdne injikovali z pečeňovej žily soľným roztokom obsahujúcim plazmid nesúci gén zosilneného zeleného fluorescenčného proteínu (eGFP) za rôznych podmienok prietokovej rýchlosti (1, 10 a 20 ml s –1 ) a konečného perfúzneho objemu. Vzorky boli kultivované 1 až 2 dni a použité na mikroskopiu a molekulárnu analýzu génovej expresie. Fluorescenčné a imunohistochemické štúdie ukázali, že v segmentoch injikovaných pri -10 ml s –1 bola v sekciách pečene prítomná dobrá a široká génová expresia a molekulárna analýza kvantitatívne posilnila histologické pozorovanie (index zdanlivého doručenia génov: 10 2 –104 kópia eGFP DNA na 100 pg celkovej DNA; transkripčný index: 105–2 × 106 eGFP RNA na 100 ng celkovej RNA). Ďalej, injikované zlaté nanočastice (priemer 15 nm) naznačujú, že dodávanie DNA do hepatocytov musí zahŕňať uľahčený proces prenikania bez narušenia membrány. V súhrne sme ukázali, že retrográdna venózna injekcia vodotesného segmentu ľudskej pečene je anadromózny postup, ktorý vedie k širokému dodaniu génov do pečene a dobrej expresii génov. Budú však potrebné ďalšie štúdie, aby sa objasnil vplyv dlhodobého ischemického poškodenia hepatocytov v našom modeli.

úvod

Táto štúdia bola navrhnutá tak, aby preskúmala kapacitu regionálne hydrodynamického dodávania génov do segmentov ľudskej pečene pomocou katetrizačného postupu „ ex vivo “. Hydrodynamický prenos génov 1, 2 s nahou DNA je bezpečný a efektívny spôsob dodávania génov a my sme zaznamenali pokrok v účinnosti dodávania génov nahých DNA do pečene myši, čo vedie k dlhodobým terapeutickým hladinám proteínu v plazme kódovaného proteínom. exogénny gén. 2 Keďže navrhovaný mechanizmus, ktorý je základom dôležitej účinnosti dodávania pečeňových génov, zahŕňa prechodnú inverziu toku krvi v organizme, mali sme možnosť vylepšiť techniku ​​a aplikovať ju na väčšie zvieratá pomocou katetrizačných postupov - ako to naznačujú predbežné výsledky od ostatných autorov a našej vlastnej skupiny. 3, 4, 5 Účinnosť génovej expresie dosiahnutá týmto postupom je nižšia ako účinnosť dosiahnutá pôvodným postupom myši, ktorý zahrnuje injekciu hydrodynamickej žily chvosta. 2 Výsledky však naznačujú, že génová terapia pečene je sľubnou stratégiou, pri ktorej veľká veľkosť pečene a / alebo menej vyhovujúci rámec spojivového tkaniva veľkých zvierat obmedzujú účinnosť prenosu génov pečene. V tejto súvislosti existuje experimentálny dôkaz, že sľubné výsledky sa dosahujú v menej elastickom srdcovom tkanive6 a že obštrukcia odtoku počas injekcie DNA do pečeňovej žily DNA významne prispieva k zvýšeniu účinnosti hydrodynamického dodávania génov do pečene. Keďže všetky krvné cievy sú uzavreté v chirurgicky odvodených segmentoch ľudskej pečene, využívame takéto vodotesné segmenty pečene na vyhodnotenie účinnosti dodávania anadromóznej nahej DNA sprostredkovanej hydrodynamickou retrovenóznou injekciou.

Táto štúdia ukazuje, že retrográdna injekcia nahej DNA nesenej zosilneným markerovým génom zeleného fluorescenčného proteínu (eGFP) do pečeňovej žily segmentov ľudskej pečene „ ex vivo “, ktorá je sprostredkovaná katétrom, vedie k širokému dodaniu génov a expresii génov bez dramatických morfologických zmien v pečeňovom tkanive, o čom svedčí elektrónová mikroskopia a distribúcia častíc zlata 15 nm v pečeni. Musíme vziať do úvahy, že po vykonaní našich experimentov v ischemických segmentoch pečene u pacientov podstupujúcich resekciu v dôsledku rakoviny pečene sú potrebné ďalšie experimenty na potvrdenie výsledkov v menej predĺženej ischemickej situácii.

výsledok

katetrizácia

Katéter sa umiestnil do pečeňovej žily segmentu pečene a vaskulárna permeácia segmentu pečene sa monitorovala fluoroskopicky po injekcii kontrastného roztoku.

Obrázok 1 predstavuje všetky experimenty a zobrazuje fluoroskopickú polohu katétra vzhľadom na jeho anatomické umiestnenie (obrázky la a b) a cievny strom po injekcii 5 a 10 ml kontrastného roztoku (obrázky 1c a d), resp. Miesto, kde boli odobraté vzorky pečene na molekulárnu analýzu, je možné pozorovať na obrázku 1b, čo zodpovedá správnemu smeru injekcie, vzorkám zóny A a oblastiam laterálnej perfúzie, vzorkám zóny B. Nemôžeme vedieť, či injekcia kontrastného roztoku ovplyvňuje expresiu eGFP, pretože sme injektovali kontrast do všetkých našich experimentov. Z tohto dôvodu sme sa vždy snažili použiť minimálne potrebné množstvo (objem 1% hmotnosti segmentu).

Image

Poloha katétra v pečeňovom segmente. Reprezentatívny obrázok Rx fluoroskopie katétra umiestneného vo vnútri pečeňovej žily segmentu pečene ( a ) zodpovedajúci VII a VIII ľudským pečeňovým segmentom pečene, vážiaci 450 g, v porovnaní s anatomickým obrazom toho istého segmentu pečene ( b ), kde rezy predstavujú miesta, kde boli vzorky odobraté na účely morfologickej a molekulárnej analýzy po hydrodynamickej injekcii, pričom zóna A je rez uprostred segmentu zodpovedajúci priamemu miestu injekcie a zóna B je horná a dolná rezy zodpovedajúce bočným pásmom. Malé čierne pruhy v bode ( a ) sú svorky používané chirurgom na uzatvorenie ciev pri vykonávaní chirurgického zákroku. ( c, d ) Obraz Rx v rovnakom segmente počas injekcie kontrastného roztoku pri nízkej rýchlosti (<1 ml s –1, nie hydrodynamický) s celkovým objemom 5 ml. Obrázok zhotovený s ( c ) polovicou vstreknutého objemu a ( d ), ktorý je na konci vstreknutia.

Obrázok v plnej veľkosti

Histologické štúdium expresie eGFP

Tri rôzne skupiny sa analyzovali fluorescenčnými a / alebo imunohistochemickými postupmi. Jeden bol injektovaný pri 20 ml s -1, 1/10 objemu segmentu a génová expresia bola vyhodnotená fluorescenčnou mikroskopiou (obrázky 2a-c). Druhá skupina bola injikovaná v 10 ml s -1, 1/5 objemu segmentu a génová expresia bola vyhodnotená imunohistochémiou (obrázky 2e-g). Posledná skupina bola injikovaná pri 1 ml s- 1, 1/5 objemu hmotnosti segmentu a génová expresia bola vyhodnotená pomocou fluorescencie (obrázok 2d) a imunohistochémie (obrázok 2h). Potom sa kultivovali malé vzorky pečene (1 x 0, 5 cm) s hrúbkou <1 mm a 1 a 2 dni po prenose génov sme študovali expresiu génu eGFP v histologických rezoch pečene pomocou fluorescenčných a imunohistochemických postupov. Výsledky ukazujú, že 1 deň po injekcii bola fluorescencia jasne pozorovaná a široko distribuovaná v kryoskopiách pečene zo segmentov pečene injikovaných pri 20 ml s –1 a 1/10 hmotnosti segmentu (obrázky 2a – c), čo naznačuje, že účinné Týmto postupom sa dosiahla dodávka génov. Imunohistochémia bola tiež použitá na detekciu eGFP expresie. V týchto experimentoch bola injekcia uskutočňovaná pri prietokovej rýchlosti 10 ml s- 1 a s objemovým objemom segmentu 1/5. Špecifická imunofarbenie 1 deň po injekcii v parafínových rezoch zo vzoriek pečene fixovaných vo formalíne je pozorované na obrázkoch 2f ag, v porovnaní s kontrolou imunohistochémie vykonanou v neprítomnosti špecifickej primárnej protilátky (obrázok 2e). Naopak, v pečeni injikovaných 1 ml s –1, objeme 1/5 hmotnosti segmentu bola pozorovaná veľmi obmedzená fluorescencia v dvoch zo štyroch študovaných segmentov pečene. Dokonca aj v týchto prípadoch vykazovali iba dve alebo tri mikroskopické polia celého histologického rezu veľmi svetelnú fluorescenciu (obrázok 2d). Navyše, v našich rukách bolo imunohistochemické farbenie negatívne vo všetkých prípadoch (obrázok 2h).

Image

Fluorescencia a imunohistochémia eGFP. Znázorňujú sa výsledky fluorescencie a imunohistochémie eGFP v histologických rezoch pečene. V prvom prípade ( a – c ) sa do pečeňového segmentu injektoval soľný roztok obsahujúci plazmidovú DNA pri prietoku 20 ml s –1 s konečným objemom 1/10 hmotnosti segmentu. Vzorky pečene sa kultivovali 24 hodín a potom sa zmrazili a kryoskopy sa použili pre fluorescenčnú mikroskopiu. Obrázok ukazuje reprezentatívne obrázky pod zväčšením × 20. V druhom prípade ( e – g ) bol segment pečene vstreknutý s prietokom 10 ml s –1, s konečným objemom 1/5 hmotnosti segmentu. Po 24 hodinách kultivácie sa proteín eGFP vyvinul imunohistochémiou v parafínových rezoch z tkaniva fixovaného formalínom. e ) Obrázok z kontrolnej sekcie imunohistochemického tkaniva, vyvinutý v neprítomnosti špecifickej primárnej protilátky. ( f, g ) Špecifická imunohistochemická reakcia proti eGFP proteínu pri zväčšení × 40. Detekcia sa uskutočňovala s použitím súpravy peroxidázy LSAB-2. Tkanivo bolo kontrastne farbené hematoxylínom. Obrázky ( d, h ) ukazujú príslušné experimenty s fluorescenciou a imunohistochémiou zo segmentov pečene injikovaných s prietokom 1 ml s –1 a s objemovým objemom segmentu 1/5.

Obrázok v plnej veľkosti

Aj keď očakávaná reaktivita musí byť nižšia ako pri kryozekciách zo zmrazených vzoriek, pozitívna reakcia bola jasne pozorovaná v skupinách injektovaných rýchlosťou 10 ml s –1 alebo vyššou; porovnávacie stanovenie účinnosti medzi týmito dvoma postupmi si však vyžadovalo molekulárnu analýzu.

Kvantitatívne testy eGFP pomocou PCR a reverznej transkriptázy-PCR (RT-PCR)

Aby sme určili vplyv prietoku (20 vs 10 vs 1 ml s –1 ) a celkového objemu (1/10 vs 1/5 segmentovej hmotnosti) injekcie na účinnosť prenosu génov, zaradili sme ďalšiu skupinu (prietok 20 ml s –1 a 1/5 ml objemu segmentu) vo vyššie opísanej histochemickej štúdii, ktorej výsledkom boli tieto skupiny: 20 ml s –1 (1/10 obj.), 20 ml s –1 (1/5) objem), 10 ml s –1 (1/5 obj.) a 1 ml s –1 (1/5 obj.), ktorých tlaky počas hydrodynamickej injekcie na špičke zavádzača boli 122, 0 ± 102, 1, 190, 8 ± 79, 4, 93, 4 ± 33, 4 a 25, 0 ± 12, 3 mm Hg.

Po transfekcii segmentu pečene, ktorá bola vykonaná, ako je vysvetlené v materiáloch a metódach, boli odobraté kultivované vzorky v dňoch 1 a 2 po transfekcii, aby sa vyhodnotil index zjavného doručenia génov a transkripcie na základe počtu kópií molekúl s použitím kvantitatívnej PCR. respektíve RT-PCR. Z každého segmentu sa po injekcii odobralo niekoľko vzoriek, ktoré vždy patrili do tkanivových oblastí zodpovedajúcich oblastiam, o ktorých sa zistilo, že sú perfundované kontrastnou predbežnou injekciou. Získané údaje o génovej expresii sa významne nelíšili medzi vzorkami A a B z každého segmentu, pričom A je oblasť priamo premývaná a B sú oblasti zodpovedajúce laterálnym zónam. Index zjavného dodania génu eGFP do tkaniva pečene sa vyhodnotil ako pomer kópií eGFP DNA na 100 pg celkovej DNA. Výraz „zjavný“ sa snaží poznamenať, že index vyhodnocuje celkové množstvo DNA prítomné v tkanive bez rozlišovania funkčných schopností. Výsledky sú zhrnuté na obrázku 3a a ukazujú, že transgén bol prítomný vo všetkých vzorkách pečeňového tkaniva, ale medzi skupinami boli pozorované významné rozdiely: maximálne hodnoty boli pozorované v skupine s 20 ml s –1, 1/5, pričom boli štatisticky odlišné od všetkých ďalšie skupiny v zóne A druhý deň ( P <0, 01). Transkripčný index sa vyhodnotil ako množstvo kópií eGFP RNA na 100 pg celkovej RNA. Výsledky sú zhrnuté na obrázku 3b a naznačujú, že transgén bol prítomný vo všetkých vzorkách pečeňového tkaniva zo segmentov injikovaných pri -10 ml s –1, dosahujúcich približne od 105 do 2 x 106 kópií na 100 ng celkovej RNA, približne. Vo všetkých prípadoch boli najvyššie hodnoty pozorované 2. deň po transfekcii, ale medzi skupinami neboli pozorované žiadne štatisticky významné rozdiely. Opäť sa však pozorovali nižšie hodnoty v segmentoch injektovaných 1 ml s –1, 1/5 obj. ( P <0, 05, zóna B, deň 2).

Image

Index zjavnej dodávky génov a index transkripcie tkanív. Ľudským pečeňovým segmentom sa retrográdne injektoval soľný roztok obsahujúci 20 μg ml- 1 DNA plazmidu nesúceho gén eGFP. Rôzne skupiny boli stanovené podľa rôznych podmienok prietokovej rýchlosti (1, 10 alebo 20 ml s –1 ) a celkového vstrekovaného objemu (1/5 alebo 1/10 hmotnosti segmentu v gramoch). Kvantitatívna eGFP PCR alebo RT-PCR sa uskutočňovala vo vzorkách pečeňového tkaniva odobratých 1 a 2 dni po prenose génov zo zón A a B a počet kópií eGFP v každej vzorke sa vypočítal na štandardnej krivke s použitím rovnakého transfekčného plazmidu. Index zdanlivého dodania génu eGFP do tkaniva pečene ( a ) sa vypočítal ako pomer kópií eGFP DNA na 100 pg celkovej DNA. Štatistická významnosť pomocou dvojsmernej analýzy rozptylu (ANOVA) a Bonferroniho post-testu sa zistila v skupinách označených * P <0, 01 v porovnaní s 20 ml s –1, 1/5 skupina. Index transkripcie tkaniva ( b ) sa vypočítal ako počet kópií eGFP RNA na 100 pg celkovej RNA. Medzi skupinami sa nepozorovali žiadne štatisticky významné rozdiely, s výnimkou 1 ml s –1, 1/5 ( P <0, 05) dvojcestným ANOVA a Bonferroni po teste, označeným hviezdičkou ( * ).

Obrázok v plnej veľkosti

Zjavná vnútorná génová účinnosť (iE) označuje množstvo RNA produkovanej na kópiu génu a bola vyhodnotená ako pomer kópie eGFP RNA / DNA v každej vzorke. Musíme si uvedomiť, že tento parameter, ako naznačuje jeho názov, je „zrejmý“, a preto sa hodnoty musia interpretovať v kontexte experimentu. Prítomnosť extracelulárnych alebo nefunkčných plazmidov sa nedá vylúčiť, ale mal by byť zaujímavým parametrom pre relatívne porovnanie medzi skupinami. Výsledky sú zhrnuté na obrázku 4 a ukazujú, že vyššia zdanlivá iE, ∼ 104 bola pozorovaná v pečeňových segmentoch transfektovaných s prietokom injekcie 10 ml s –1, 1/5 obj. A naďalej vykazuje podobné hodnoty na 1. a 2. deň po transfekcii, pričom sa významne líšili ( P <0, 01) od všetkých ostatných skupín. Avšak v segmentoch transfekovaných s 20 ml s –1 bola zdanlivá iE nižšia (103) a vo vzorkách zo zóny A, deň 2 sa znížila o jeden rád vo vzťahu k dňu 1, najmä keď bol najvyšší konečný objem (1 / 5 segmentovej hmotnosti). Pretože iE do značnej miery závisí od životaschopnosti buniek, máme podozrenie, že mierne transfekčné podmienky by mali ponúkať bunkové výhody pre génovú expresiu, pretože vyššie hodnoty toku a objemu môžu sprostredkovať poškodenie buniek, čo vedie k časovo závislému zníženiu génu iE. Ak sú podmienky perfúzie príliš pomalé (1 ml s –1 ), vnútorná účinnosť sa dramaticky zníži (∼ 10 −1 ), čo naznačuje, že funkčnosť dodanej DNA musí byť veľmi obmedzená. Pokiaľ ide o zóny A a B, významné rozdiely medzi nimi boli zistené iba v skupine 10 ml s –1, 1/5 ( P <0, 01).

Image

Index zjavnej génovej vnútornej účinnosti v pečeňovom tkanive. Experimentálne podmienky transfekcie a molekulárnej analýzy vzoriek pečene boli také, ako je opísané na obrázku 3. Index zdanlivého iE bol vypočítaný ako pomer kópie eGFP RNA / DNA eGFP v každej vzorke a označuje množstvo RNA produkovanej na kópiu génu DNA., Štatistická významnosť medzi skupinami sa uvádza ako * P <0, 01, keď sa porovnávajú skupiny s 10 ml s –1, 1/5. # P <0, 01 Štatistická významnosť medzi zónami A a B vo vnútri skupiny dvojsmernou analýzou rozptylu (ANOVA) a Bonferroniho post-testom.

Obrázok v plnej veľkosti

Transmisná elektrónová mikroskopia

U myší a ošípaných boli už predtým opísané relevantné morfologické zmeny v pečeni po hydrodynamickej injekcii, najmä narušenie endotelu a masívne endocytické vezikuly v hepatocytoch. 2, 4, 5, 8 Na potvrdenie toho, či sa tieto morfologické zmeny vyskytujú aj u ľudí, boli segmenty pečene retrográdne injikované pri prietoku 20 ml s –1 s pufrovaným 2, 5% roztokom glutaraldehydu. Potom sa odobrali vzorky tkaniva na transmisnú elektrónovú mikroskopiu (TEM). Obrázok 5 zobrazuje reprezentatívny obrázok pri malom zväčšení žilového sínusoidu a štyri detaily (rámčeky a-d), pri väčšom zväčšení, rôznych oblastí obsahujúcich vaskulárne endotelium, diskový priestor a apikálne hepatocyty. Hlavné pozorované morfologické zmeny boli: (1) dilatačný sínusoid; (2) veľmi malé zmeny, ak existujú, v sínusovom endoteli, bez známok narušenia; a (3) dilatovaný priestor Disse na niektorých miestach bez masívnych endocytických vezikúl v hepatocytoch. Morfologické zmeny pozorované v pečeni boli menšie, ako sa očakávalo, čo naznačuje, že dodávka anadromóznej DNA do hepatocytov musí zahŕňať uľahčenú permeáciu, nie proces narušenia membrány.

Image

Ultraštrukturálne morfologické zmeny. Pečeňový segment bol retrográdne injikovaný pri prietoku 20 ml s- 1 pufrovaným 2, 5% roztokom glutaraldehydu a vzorky tkaniva boli odobraté na transmisnú elektrónovú mikroskopiu. V strede je nádoba obklopená hepatocytmi znázornená pri malom zväčšení (stĺpec, 10 μm) a štvorce a, b, cad označujú príslušné oblasti pri väčšom zväčšení na identifikáciu morfologických zmien vaskulárneho endotelu, priestoru Disse a apikálnych hepatocytov. membrána. Šípky označujú diskontinuálny endotel, hviezda označuje endocytické vezikuly alebo počiatočné vezikuly a biele šípky označujú Disse space. Stĺpec štvorca b, 500 nm; stĺpce štvorcov a, cad, 1 000 nm.

Obrázok v plnej veľkosti

S cieľom odhaliť možnú existenciu narušenia membrány, ktoré TEM priamo nepozoroval, sa do ďalších segmentov pečene vstrekovalo retrográdne s prietokom 20 ml s –1 s pufrovaným 2, 5% roztokom glutaraldehydu obsahujúcim zlaté nanočastice (priemer 15 nm a 10 12 častíc na ml). Pretože pre tieto experimenty sú potrebné veľké množstvá nanočastíc zlata, častice sa pripravili tak, ako je opísané v materiáloch a metódach. Morfologické charakteristiky nanočastíc a distribúcia priemeru sú uvedené na obrázku 6. Priemerný priemer nanočastíc použitý v tomto experimente bol 15, 5 ± 0, 3 nm. Distribúcia nanočastíc zlata v pečeňovom segmente je znázornená na obrázku 7, kde centrálny obrázok (pri malom zväčšení) ukazuje rozšírený sínusoid, v ktorom sú špecifické políčka zodpovedajúce miestam endotelu - diskový priestor - hepatocyty (a – d). zosilnené s cieľom identifikovať umiestnenie nanočastíc. Vo všetkých prípadoch boli nanočastice pozorované vo vnútri sínusoidy alebo v priestore Disse. Vo vnútri hepatocytov neboli v žiadnom prípade pozorované nanočastice, čo svedčí o neprítomnosti narušenia membrány hepatocytov a implikácii uľahčeného procesu prenikania pri dodávaní DNA do pečeňových buniek.

Image

Charakterizácia nanočastíc zlata. Nanočastice zlata boli pripravené tak, ako je opísané v materiáloch a metódach. Morfologické charakteristiky zlatých nanočastíc boli skúmané transmisnou elektrónovou mikroskopiou ( b ) a priemerné rozdelenie priemeru a veľkosti ( a ) bolo stanovené počítaním najmenej 300 nanočastíc.

Obrázok v plnej veľkosti

Image

Distribúcia nanočastíc zlata v pečeňovom segmente. Pečeňový segment bol retrográdne injikovaný s prietokom 20 ml s- 1 s pufrovaným 2, 5% roztokom glutaraldehydu plus zlatými nanočasticami (priemer 15 nm a 1012 častíc na ml). Centrálny obrázok (pri malom zväčšení) ukazuje rozšírený sínusoid, kde sú zosilnené špecifické políčka zodpovedajúce miestam endotelu - diskový priestor - hepatocyty ( a – d ) a potom opäť zväčšené (a1 – a3, b1, c1, c2 a d1). s cieľom identifikovať umiestnenie nanočastíc. Posledne menované sú pozorované v sínusoidách a Disseho priestore, ale nie vo vnútri hepatocytov.

Obrázok v plnej veľkosti

diskusia

Táto práca ukazuje, že dodávanie anadromného génu do „ ex vivo “ ľudských pečeňových segmentov, sprostredkované retrográdnou injekciou nahej DNA kódujúcej gén eGFP v pečeňovej žile, vedie k účinnému prenosu génov, ako je uvedené v: (1) eGFP DNA, RNA identifikované pomocou kvantitatívnej PCR a RT-PCR; (2) eGFP proteín identifikovaný pomocou fluorescenčných a imunohistochemických postupov (v našich rukách bolo najlepším zo študovaných podmienok na transfekciu retrográdna injekcia fyziologického roztoku plazmidu eGFP (20 μg ml –1 ) pri prietokovej rýchlosti 10 ml s - 1 a konečný objem zodpovedajúci 1/5 hmotnosti segmentu pečene v gramoch); a (3) ultraštrukturálne štúdie využívajúce zlaté nanočastice naznačujú, že mechanizmus dodávania génov musí byť sprostredkovaný uľahčeným permeačným procesom, nie narušením membrány hepatocytov.

Dôležitý pokrok sa dosiahol v nevírusovej génovej terapii, pretože hydrodynamický postup dodávania myšieho pečeňového génu bol prvýkrát opísaný. 2, 8, 9, 10 Systémová porucha vyplývajúca z hydrodynamickej injekcie však zostáva pre klinickú aplikáciu vážnym obmedzením, pretože môže viesť ku kolapsu obehu a dokonca k smrti. Aby sme sa vyhli tomuto nepriaznivému účinku, opísali sme retrográdny katétrom sprostredkovaný postup dodávania génov 5 s cieľom lokálne reprodukovať intrahepatické stavy sprostredkované hydrodynamickou injekciou chvostovej žily. Všetky štúdie uvádzané na ošípaných 4, 5, 11, 12, 13, 14 a v klinických skúškach na ľuďoch 3 však naznačujú, že účinnosť postupu zostáva o niekoľko rádov nižšia ako pozorovaná na myšiach. Presný dôvod nízkej účinnosti prenosu génov pri retrográdnej injekcii je stále neznámy, ale veľmi dôležitým faktorom musí byť nízka rezistencia sínusoidového lôžka, pretože DNA môže po injekcii do hepatálnej žily ľahko cestovať po segmente pečene a dosiahnuť portálnu žilu a potom sa voľne vracia do dolnej cava žily cez iný segment pečene. 15

V predloženej práci predpokladáme, že humánne „ ex vivo “ segmenty pečene musia byť vynikajúcimi kandidátmi na prenos anadromóznych génov, pretože odtok injikovaného roztoku DNA z cieľového segmentu je blokovaný v procese chirurgického odstránenia. Vo všetkých prípadoch bola vaskulárna priechodnosť pred injekciou potvrdená kontrastnou injekciou a röntgenovou fluoroskopiou. Podmienky injekcie boli podobné tým, ktoré sa použili pri pokusoch na ošípaných na katérom sprostredkovaný „ in vivo “ prenos génov, ale s výhodou blokovania odtoku injikovaného roztoku DNA. Výsledky naznačujú, že 20 i 10 ml s –1 rýchlosti vstrekovania roztoku plazmidu (20 μg ml –1 ) obsahujúceho gén eGFP sprostredkujú efektívny génový prenos, ako bolo pozorované svetelnou mikroskopiou využívajúcou priame fluorescenčné alebo imunohistochemické postupy. Toto pozorovanie potvrdzuje predbežnú hypotézu a podporuje myšlienku, že obštrukcia odtoku počas injekcie DNA do pečeňových žíl DNA významne prispieva k zvýšeniu účinnosti hydrodynamického dodávania génov do pečene. 7 Keď sa však segmentom injektovali veľké objemy (1/5 obj.), Ale nízky prietok (1 ml s –1 ), sotva sme našli expresiu proteínu v histologických rezoch. Mikroskopické pozorovania podporujú dobrú účinnosť dodávania génov v skupinách s injekciou -10 ml s –1, ale gén eGFP kóduje nereekretovaný proteín, ktorý sa hromadí v cytoplazme, a preto množstvo proteínu slabo koreluje s účinnosťou expresie.

Na vyhodnotenie toho, ako dodanie a transkripcia génu eGFP prispieva k účinnosti prenosu génov pečene, sa použili dva tkanivové indexy na základe počtu kópií DNA alebo RNA. Index zdanlivého dodania génu eGFP (počet kópií DNA na 100 pg celkovej DNA) bol približne 10–104 kópií eGFP na 100 pg celkovej DNA, približne. Nižšie hodnoty indexu vykazovali aj segmenty pečene injikované 1 ml s –1 . Je zaujímavé, že hodnota indexu klesá, keď sa podmienky na vstrekovanie stávajú miernejšími (všeobecne 20 ml s –1 1/5> 20 ml s –1 1/10> 10 ml s –1 1/5> 1 ml s –1 1/5). Musíme však poznamenať, že tento index má zjavnú distribúciu, a teda neanalyzuje funkčnosť kvantifikovanej DNA. Vzhľadom na to, že počet kópií dosiahnutý miernejšími podmienkami je 10 2, mohli by sme si myslieť, že veľká časť injikovanej DNA by mohla dosiahnuť tkanivo, ale bez funkčnej schopnosti, ako to potvrdzujú histochemické štúdie zhrnuté na obrázku 2. Ak vezmeme do úvahy, že 3, 3 pg DNA je ekvivalentná s haploidným ľudským genómom, 16 naše výsledky naznačujú približne rovnakú účinnosť 10 až 1 000 kópií génu eGFP na bunku.

Index génovej transkripcie eGFP (počet kópií RNA na 100 ng celkovej RNA) bol 105 až 2 x 106 kópií na 100 ng celkovej RNA, približne v skupinách, ktorým bola injikovaná 10 ml s –1, ale 2 až 3 rády veľkosť nižšia pri injekcii 1 ml s –1, 1/5 obj. Vo všetkých prípadoch boli najvyššie hodnoty pozorované 2 dni po transfekcii v skupinách injikovaných pri -10 ml s –1 . Aj keď medzi týmito skupinami nebol pozorovaný žiadny významný rozdiel, pečeňové segmenty injikované 10 ml s- 1 vykazovali mierne vyššie hodnoty indexu 1 deň po injekcii.

Zjavný iE (číslo kópie génu RNA / DNA) je zaujímavý parameter, pretože naznačuje úroveň funkčnosti zavedeného génu vo vnútri bunky na základe toho, koľko kópií molekúl RNA sa transkribuje z každej dodanej molekuly DNA. na vzorku tkaniva. Musíme si uvedomiť, že tento „zdanlivý“ parameter sa musí interpretovať v kontexte experimentu. Prítomnosť extracelulárnych alebo nefunkčných plazmidov nie je možné vylúčiť, a preto v prípadoch, keď bol podiel extracelulárnych plazmidov veľmi zvýšený, indexy nemohli byť presnými mierami účinnosti. Mohli by to však byť zaujímavé parametre pre relatívne porovnanie medzi skupinami. Naše výsledky naznačujú, že zjavný iE sa znížil 10-krát od 1. do 2. dňa po transfekcii v obidvoch skupinách pečeňových segmentov injikovaných s prietokom 20 ml s –1, hlavne v zónach A, kde bol hydrodynamický vplyv vyšší. Podobné hodnoty za 2 dni sa však pozorovali v skupine injektovanej s prietokom 10 ml s –1 . Vyššie hodnoty zdanlivej iE sa okrem toho pozorovali aj v skupine 10 ml s –1 v porovnaní so skupinami po 20 ml s –1, čo naznačuje, že miernejšie podmienky na injekciu musia ponúkať bunkové výhody na génovú expresiu a potvrdzujúc tak, že prekážka odtoku 7 musí prispievať k zvýšeniu účinnosti hydrodynamického dodávania génov pečene. Je zaujímavé, že keď sa použil najnižší prietok (1 ml s –1 ), zdanlivá iE sa dramaticky znížila až na 5 rádov, čo naznačuje, že za týchto podmienok je účinnosť hydrodynamického postupu veľmi nízka. Toto zistenie podporuje naše predchádzajúce tvrdenie, že množstvo dodaného génu nebolo z veľkej časti funkčné. Na základe týchto výsledkov predpokladáme, že všetky postupy vpichu DNA s 10 ml s –1 sprostredkujú podobnú účinnosť transkripcie, ako ukazuje index transkripcie, a že špeciálne vodotesné podmienky pravdepodobne prispejú k zníženiu minima potrebné požiadavky na dosiahnutie hydrodynamického prenosu génov. Extrémnejšie podmienky (vyššia rýchlosť a objem) však prispievajú k zvýšeniu počtu kópií DNA v tkanive (index zdanlivého dodania génu), ale ktorých funkčnosť (schopnosť expresie génu) musí byť pravdepodobne obmedzená, pretože zjavná vnútorná účinnosť je nižšia, pokiaľ ide o miernejšiu skupinu podmienok (10 ml s –1 ). Mechanizmus prenosu génov sprostredkovaný hydrodynamickou injekciou zostáva v každom prípade nejasný.

Predtým naša skupina (využívajúca simultánne tlaky portálnej a cava žily a intravitálne mikroskopické vyhodnotenie sínusového krvného obehu) opísala, že mechanizmus hydrodynamického prenosu génov pečene zahŕňa inverziu sínusového krvného toku kvôli prechodnej inverzii portálových versus diferenčných tlakov žilových žíl. Morfologické zmeny boli tiež spojené s intrahepatickými tlakmi, najmä so zväčšeným priemerom sínusoidov a dissého priestoru, ako aj so zvýšeným endotelovým narušením a prítomnosťou hojných endocytových vezikúl v apikálnom póle hepatocytov. 8 Rýchly nárast tlakov dolnej cavy a portálnej vény sprostredkovaných hydrodynamickou injekciou naznačuje nízku vaskulárnu rezistenciu , ale tlak v dolnej cava-vej žile zostáva vyšší po dobu menej minút, čo vedie k obrátenému sínusovému toku. Nedávno sa navrhlo 17, že počas hydrodynamickej injekcie retrográdny roztok DNA dosiahne portálnu žilu, kde vaskulárna rezistencia intestinálnych, splenických a pankreatických kapilárnych lôžok poskytuje účinnú obštrukciu výtoku z portálnej žily, a preto je nevyhnutná obštrukcia výtoku. stav pre efektívne hydrodynamické dodávanie génov do jednotlivých segmentov alebo lalokov pečene. 7, 18 Výsledky tohto článku potvrdzujú v ľudských pečeňových segmentoch „ ex vivo “, že obštrukcia odtoku pri hydrodynamickej injekcii génu eGFP vedie k širokému dodaniu génu a účinnej génovej expresii.

Presný mechanizmus dodávania génov sprostredkovaný hydrodynamickou injekciou zostáva neznámy, boli však navrhnuté dve cesty vstupu DNA plazmidov do hepatocytov: prasknutie 19 plazmatickej membrány a zvýšenie priepustnosti membrány, 5, 8, 20, 21 pravdepodobne prostredníctvom endocytických vezikúl. V tejto štúdii potvrdzujeme, že hydrodynamická injekcia sprostredkuje zväčšenie priemeru sínusoidy s endoteliom, ktorý kombinuje spojité aj diskontinuálne zóny, hoci v žiadnom prípade nebolo pozorované všeobecné narušenie. Okrem toho zvyčajne úzky Disse priestor predstavoval rozšírený aspekt kompatibilný so zvýšeným prietokom / tlakom na tomto území. Aj keď niektoré endocytické vezikuly alebo aspoň začínajúce vezikuly boli pozorované v apikálnej membráne hepatocytov, nepodarilo sa nám nájsť územia s hojnými endocytovými procesmi lemujúcimi hepatocytovú membránu, ako už bolo opísané u myší a ošípaných. Nevieme dôvod tohto rozdielu, a hoci by to mohlo byť z dôvodu štrukturálnych rozdielov súvisiacich s druhmi, podmienky „ ex vivo “ tiež znamenajú, že segmenty pečene boli zbavené vaskulárneho zásobovania 2 až 3 hodiny pred hydrodynamickou injekciou, a preto mohla by byť možná strata bunkovej endocytovej reakcie. Nemôžeme však vylúčiť, že tieto nezrovnalosti by mohli byť kvôli suboptimálnym podmienkam experimentálneho modelu, ktoré by sa mohli zlepšiť. Aj keď stupeň endocytických vezikúl by mohol obmedziť účinnosť procesu, táto skutočnosť by sa mohla kompenzovať zvýšením priepustnosti membrány kvôli špeciálnym podmienkam pečeňových segmentov v našich experimentoch.

Na vyhodnotenie toho, ako by táto okolnosť mohla prispieť k minimálnemu pretrhnutiu membrány plazmatických buniek hepatocytov umožňujúcich vstup DNA do bunky, sa uskutočnili ďalšie experimenty, pričom sa injektovali nanočastice zlata so stredným priemerom 15 nm. Výsledky naznačujú, že nanočastice boli vždy umiestnené vo vaskulárnom lôžku a vo vnútri Disseho priestoru, ale nikdy vo vnútri hepatocytov, čo podporuje myšlienku, že do procesu prenosu génov musí byť zapojený proces prenikania. V tomto kontexte je uľahčená permeácia spojená so schopnosťou DNA prechádzať cez bunkovú membránu v konkrétnom scenári hydrodynamickej injekcie. Je potrebné poznamenať dve otázky. Aj keď by nanočastice a veľkosť plazmidov mohli byť podobné, charakteristiky tuhosti sú veľmi odlišné, čo by mohlo vysvetľovať ich rozdielnu schopnosť prechádzať cez bunkové membrány. Druhým bodom je, že vyššie koncentrácie injikovaných nanočastíc by mohli prispieť k objasneniu stupňa membránovej prestupnosti týmto časticiam.

V súhrne sme ukázali, že retrográdna venózna injekcia „ ex vivo “ ľudských pečeňových segmentov je anadromózny postup, ktorý môže sprostredkovať dobrú účinnosť génovej expresie a génovej expresie v ľudskej pečeni s možnými klinickými aplikáciami. V tejto súvislosti sa domnievame, že tento postup prenosu génov by mohol byť sľubnou možnosťou v oblasti transplantácie pečene u ľudí, pretože geneticky modifikované štepy by mohli prispieť k zníženiu ischemicko-reperfúzneho poškodenia alebo zabrániť odmietnutiu štepu, ako sa nedávno naznačilo. 22