Prerušenie prenosu koreňového uhlíka do lesného humusu stimuluje hubových oportunistov na úkor mykorrhizálnych húb | isme journal

Prerušenie prenosu koreňového uhlíka do lesného humusu stimuluje hubových oportunistov na úkor mykorrhizálnych húb | isme journal

Anonim

predmety

  • Ekológia lesa
  • Plesňová ekológia

abstraktné

V humusových vrstvách boreálnych lesov dominujú ektomykorhizné huby. Závisia od uhľohydrátov, ktoré sa translokujú cez korene, hubovým myceliom na mikrostránky v pôde, kde sa živia výživnými látkami. Mykorhizné huby sú preto citlivé na rušivé poruchy, ktoré môžu obmedziť ich prísun uhlíka. Prerušením koreňových spojení sme vyvolali náhly pokles hojnosti mykorhizálneho mycelia a študovali sme následné účinky na rast a aktivitu voľného života, saprotrofné huby a baktérie v humuse borovicového lesa pomocou analýz molekulárnej komunity v kombinácii s meraním enzýmovej aktivity. Ektomykorhizné huby sa znížili v hojnosti 14 dní po odtrhnutí koreňov, ale množstvo určitých voľne žijúcich askomycetov bolo trikrát vyššie v priebehu 5 dní od narušenia v porovnaní s ničím neporušenými kontrolami. Prerušenie koreňov tiež zvýšilo produkciu lakov rádovo a produkciu celulázy faktorom 5. Na rozdiel od toho sa zdá, že bakteriálne populácie sú málo ovplyvnené. Výsledky naznačujú, že prístup k vonkajšiemu zdroju uhlíka umožňuje mykorrhizálnym húb monopolizovať humus, ale poruchy môžu vyvolať rýchly rast oportúnnych saprotrofických húb, ktoré pravdepodobne využívajú umierajúce mykorrhizálne mycélium. Štúdie takýchto funkčných posunov v hubových spoločenstvách vyvolané narušením môžu objasniť mechanizmy za zadržiavaním a uvoľňovaním živín v boreálnych lesoch. Výsledky tiež zdôrazňujú základné problémy spojené s metódami, ktoré skúmajú mikrobiálne procesy vo vzorkách pôdy, ktoré boli izolované z živých koreňov.

úvod

Vláknité huby sa klasifikujú ako mikroorganizmy z dôvodu mikroskopického priemeru ich hýf, ktorý im umožňuje preniknúť do mikrozariadení na rôznych substrátoch. Mnohé huby, najmä basidiomycety, však produkujú mycélium, ktoré siaha cez decimetre k metre, cez ktoré môžu prenášať uhľovodíky a živiny na veľké vzdialenosti (Finlay and Read, 1986; Boddy, 1999). Prerozdelenie zdrojov umožňuje týmto hubám mobilizovať zdroje lokálne na jednom mieste, ale použiť ich na podporu rastu v iných vzdialených častiach ich mycélia (Lindahl a Olsson, 2004). Ektomykorhizné huby podporujú husté halulové siete pomocou translokácie nedávno fotosyntetizovaných uhľohydrátov z koreňov hostiteľských rastlín, čím sa zabezpečuje účinná asimilácia živín vo vrstvách humusu a minerálnych pôdach (Leake a kol., 2001; Rosling a kol., 2004). Závislosť od translokácie fotosyntetických produktov prostredníctvom koreňov a mycélia umožňuje mykorrhizálnym hubám pôsobiť nezávisle na lokálne dostupnom organickom uhlíku v pôde, ale zároveň ich robí náchylnými na rušivé poruchy.

Vo vrstvách organického humusu ihličnatých lesov sa zistilo, že ektomykorrhizačné druhy dominujú fungálnym spoločenstvám (O'Brien a kol., 2005; Lindahl a kol., 2007) a v laboratórnych mikrokozmoch sa ektomykorrhizačné huby úspešne konkurujú saprotrofy pre pôdny priestor a živiny (Lindahl a kol., 1999, 2001, 2002; Werner a kol., 2002). Mykorrhizálne huby, ktoré sú podporované uhľohydrátmi z ich hostiteľských rastlín, a nie v závislosti od energie z organických látok, môžu vylúčiť saprotrofy zo substrátov s nedostatkom energie, aby monopolizovali živiny pre seba a svojich hostiteľov (Lindahl et al., 2007). V chudobných podmienkach na živiny môžu ektomykorizálne huby tiež zvýšiť dostupnosť živín produkciou extracelulárnych enzýmov (Lindahl a kol., 2005), čo uľahčuje priamu recykláciu živín v organických formách (Lindahl a kol., 2002; Read a Perez-Moreno, 2003). Takéto tesné cyklovanie živín v konečnom dôsledku závisí od neporušených translokačných ciest medzi listami fotosyntézy, cez korene k organickým substrátom kolonizujúcim mykorhizálne mycélium v ​​humuse a pôde.

Predchádzajúce dlhodobé štúdie účinkov narušenia koreňov (Siira-Pietikäinen a kol., 2001; Brant a kol., 2006) alebo pletenie stromov (Högberg a Högberg, 2002; Subke a kol., 2004) zistili výrazný pokles. v plesňovej biomase kvôli škodlivým účinkom na mykorrhizačné taxóny (Yarwood et al., 2009). Fyzické narušenie mikrobiálnej komunity v boreálnych lesných pôdach tiež často vedie k uvoľňovaniu NH 4 + (Yavitt a Fahey, 1984; Siira-Pietikäinen a kol., 2001; Lavoie a Bradley, 2003; Piirainen a kol., 2007) a zvýšené hladiny NH4 + boli tiež pozorované v súvislosti s opakovanými cyklami zmrazenie-topenie (Sulkava a Huhta, 2003) a s jasným rezaním (Carmosini a kol., 2003; Lapointe a kol., 2005). Predpokladá sa, že zvýšená mineralizácia dusíka po poruche závisí od rýchleho obratu odumretej mikrobiálnej biomasy (DeLuca et al., 1992). Transformácia ektomycorrhizálneho mycélia citlivého na narušenie na mŕtvy zdroj pre oportunistické saprotrofy by vyžadovala zložité interakcie medzi rôznymi funkčnými cechmi mikroorganizmov, o ktorých stále vieme veľmi málo.

Boreálne lesné pôdy možno opísať ako relatívne stabilné systémy. Dážďovky, ktoré bránia vytvoreniu myceliálnych translokačných ciest zmiešaním pôdy (Butenschoen et al., 2007), sú v boreálnych lesných pôdach zriedkavé. Aj keď môžu byť výrazné sezónne zmeny, dominantné rastliny sú vždy zelené a degradácia zložiek podstielky sa predlžuje o niekoľko rokov, čím sa zabezpečuje nepretržitá dodávka uhľohydrátov do pôdnych mikroorganizmov prostredníctvom koreňov a podstielky. Predpokladáme, že v tomto inak stabilnom prostredí môžu náhle poruchy rýchlo posunúť rovnováhu medzi rôznymi funkčnými cechmi mikroorganizmov s veľkými následnými účinkami na ekosystémové procesy. Aby sme otestovali, či narušenie mykorhizálnych translokačných dráh stimuluje rast voľne žijúcich saprotrofov, študovali sme krátkodobé (14-dňové) reakcie mikrobiálnej komunity na náhle narušenie vyvolané vložením plastových skúmaviek do lesného humusu, ktoré oddeľuje korene. Pomocou metód založených na DNA na zacielenie húb a baktérií sme monitorovali zmeny v komunite na úrovni druhov a funkčných skupín. Merali sme tiež aktivity extracelulárnych enzýmov zapojených do degradácie organických látok.

Materiály a metódy

Odber vzoriek

Terénna štúdia sa uskutočnila koncom septembra 2006 v Jädraås IhV (60 ° 49 ′ s. Š., 16 ° 30 ′ v., Nadmorská výška 185 m), čo je dobre zdokumentované pole v strednom Švédsku (Persson, 1980; Lindahl et al., 2007). Táto lokalita sa skladá z lesa Pinus sylvestris L. s rozvetvením erikovaných kríkov trpaslíkov ( Vaccinium vitis-ideae L. a Calluna vulgaris (L.) Hull) a machov ( Pleurozium schreberi (Bridel) Mitten a Dicranum majus Turner), ktoré rastú na pieskový podzol. Plastové trubice (150 mm dlhé, priemer 28 mm) so naostrenými okrajmi sa pomocou gumového kladiva pretlačili vrstvou podstielky a humusu nadol do minerálnej pôdy. Celkom bolo vložených 25 rúrok 1 m od seba pozdĺž lineárneho priechodu. Po 5 dňoch sa odobralo každé ďalšie jadro spolu s kontrolnými vzorkami, ktoré sa odobrali pozdĺž paralelného transektu 1 m od prvého. Kontrolné skúmavky boli zatĺkané do pôdy bezprostredne pred opätovným odberom jadier. Zostávajúce jadrá sa získali spolu s novými kontrolnými jadrámi po celkom 14 dňoch inkubácie. Jadrá pôdy sa okamžite rozdelili; Minerálna pôda, machy a štrukturálne neporušená podstielka boli odstránené a dobre roztrieštená podstielka a humus boli zmrazené na suchom ľade priamo pri odbere vzoriek. Pokiaľ boli ešte zmrazené, vzorky sa rozdrvili a zhruba homogenizovali v trecej miske a rozdelili sa na ďalšie analýzy.

analýzy

Podrobný opis analytických metód je uvedený ako doplnkový materiál (doplnok 1).

Stručne, mikroskopicky boli spočítané 4, 6-diamidino-2-fenylindolové (DAPI) farbiace baktérie a celková dĺžka húb v organických vzorkách.

DNA sa extrahovala z 50 mg humusu. Interná transkribovaná medzerníková oblasť (ITS) plesňových ribozómových kódujúcich génov a časti 16S oblasti bakteriálnych ribozómových kódujúcich génov boli amplifikované PCR. Produkty PCR sa zhromaždili v rámci ošetrenia a klonovali sa do Escherichia coli , čo viedlo k vytvoreniu štyroch klonových knižníc (dva odbery vzoriek x dva ošetrenia), každá pre huby a baktérie. Z každej klonovej knižnice bolo vybratých 48 klonov a inzerty amplikónov boli znovu amplifikované a sekvenované. Sekvencie boli zoskupené, čo umožnilo 1% rozdielnosť v zoskupeniach a taxonomické pridruženia boli priradené na základe fylogenetických vzťahov k referenčným sekvenciám (doplnok 2 a 3).

Zloženie plesňových spoločenstiev v každej vzorke bolo analyzované polymorfizmom dĺžky koncových reštrikčných fragmentov (T-RFLP) založeným na polymorfizmoch v oblasti ITS. Vrcholy T-RFLP v profiloch získaných zo vzoriek humusu boli priradené k húb taxónom porovnaním so vzorkami T-RFLP získanými z klonovaných a identifikovaných genotypov (Lindahl et al., 2007). Pre každú vzorku bol odhadnutý relatívny príspevok hubových taxónov k celkovej komunite ako fluorescencia ich pridružených vrcholov T-RFLP delená integrovanou fluorescenciou celého profilu T-RFLP.

Na základe sekvencií získaných z klonovaných ITS amplikónov boli navrhnuté priméry tak, aby špecificky amplifikovali skupinu taxónov v helotialesi húb, s sekvenčnou afinitou k anamorfám Leptodontidium (doplnok 3). Po testovaní špecificity primerov bolo pomocou kvantitatívnej PCR odhadnuté absolútne množstvo templátu Leptodontidium ITS v DNA extraktoch.

Aktivity extracelulárnych enzýmov sa hodnotili v humusových extraktoch vyrobených pridaním 1 g pôdy do 3 ml deionizovanej vody a intenzívnym trepaním počas 60 minút pri 4 ° C. Po odstredení a filtrácii extraktov sa odhadli aktivity lakáz, celuláz, peroxidáz mangánu a N-acetylglukozaminidáz (NAG) s použitím kolorogénnych alebo fluogénnych substrátov.

Štatistická analýza

Účinky na odhady mikrobiálnej biomasy, množstvá extrahovanej DNA, aktivity enzýmov a hodnoty hojnosti leptodontídia sa testovali pomocou obojsmernej analýzy rozptylu (ANOVA), pričom rozdelenie koreňov a doba odberu vzoriek boli vysvetlené ako premenné. Hyphal dĺžky, aktivity celulázy a hodnoty hojnosti leptodontídia sa pred analýzou logaritmicky transformovali, aby sa splnili predpoklady ANOVA. Distribúcia lakových a NAG aktivít nespĺňala predpoklady ANOVA a účinky oddeľovania koreňov a času odoberania vzoriek sa testovali samostatne pomocou Mann-Whitney U- testov. Lineárna regresia sa použila na testovanie možnej korelácie medzi odhadmi mikrobiálnej biomasy a množstvom extrahovanej DNA alebo log-transformovaných enzýmových aktivít. Možné korelácie medzi hojnosťou leptodontídia a dĺžkou haluby alebo enzýmovými aktivitami sa tiež testovali lineárnou regresiou.

Distribúcie klonovaných amplikónov naprieč bakteriálnou fylou a fungálnymi radmi sa testovali na nezávislosť vo vzťahu k oddeľovaniu koreňov a času odoberania vzoriek pomocou testov χ2. Skupiny predstavované niekoľkými klonmi boli zlúčené, takže žiadne udalosti neočakávali frekvencie nižšie ako 4. Rozdiely medzi vzorkami v zložení húb Spoločenstva, ako boli analyzované T-RFLP, boli graficky znázornené korešpondenčnou analýzou (terBraak, 1986) s použitím CANOCO verzie 4.5 pre Windows (Microcomputer Power, Ithaca, NY, USA). Účinky oddeľovania koreňov a času odoberania vzoriek na zloženie plesňových spoločenstiev sa testovali na štatistickú významnosť osobitne pomocou kanonickej korešpondenčnej analýzy nasledovanej testami Monte Carlo. Analýzy sa opakovali s abundanciami taxónov zlúčenými do rodov. V dvoch vzorkách fungálnym spoločenstvám úplne dominovali Phellodon niger a Luellia recondita , ktoré vo všetkých ostatných vzorkách chýbali. Tieto dve vzorky, ktoré sa silne odchýlili v ordinačných analýzach a tiež sa líšili vo svojich veľmi tenkých vrstvách humusu, boli vylúčené.

výsledok

Mikrobiálna biomasa a enzýmové aktivity

Priemerná dĺžka halu viac ako dvojnásobná po odrezaní koreňov ( P <0, 0001) bez ohľadu na čas odberu vzoriek (obrázok 1a). Počty baktérií ani množstvo DNA neboli významne ovplyvnené oddeľovaním koreňov (obrázky 1b a c). Celkové množstvo extrahovanej DNA bolo vyššie ( P = 0, 048) v 14. deň odberu vzoriek ako v 5. deň a bol pozorovaný podobný, nevýznamný trend v počte baktérií ( P = 0, 057). Celkové množstvo extrahovanej DNA korelovalo s počtom baktérií ( P = 0, 011), ale nie s dĺžkami hýľ.

Image

Odhady mikrobiálnej biomasy ( ad ) a enzýmových aktivít ( eh ) vo vzorkách humusu z lesa Pinus sylvestris . Vzorky bez narušenia (otvorené stĺpce) sa porovnávajú so vzorkami, v ktorých boli prerušené spojenia koreňov (tieňované stĺpce) 5 alebo 14 dní pred odberom. Všetky odhady sa uvádzajú na gram suchej hmotnosti humusu, pričom chybové stĺpce predstavujú ± 1 se

Obrázok v plnej veľkosti

Lakové aktivity sa po oddelení koreňov zvýšili o rádovú hodnotu ( P <0, 0001) bez ohľadu na čas odberu vzoriek (obrázok 1e) a pozitívne korelovali s dĺžkami hýľ ( P <0, 0001). Keď sa ako vysvetľujúca premenná zahrnovalo oddeľovanie koreňov, korelácia sa znížila na nevýznamný trend ( P = 0, 08). Celulázové aktivity boli v priemere päťnásobne vyššie po oddelení koreňov ( P = 0, 024), ale iba pri odbere vzoriek na 5. deň (interakcia P = 0, 023). Pri odbere vzoriek zo 14. dňa boli celulózové aktivity podobné pri oboch ošetreniach a medzi nimi medzi narušenými a nerušenými vzorkami 5. dňa (obrázok 1f). Priemerná aktivita NAG bola šesťnásobne vyššia po odrezaní koreňov, ale rozdiel nebol štatisticky významný ( P = 0, 08), kvôli veľkým rozdielom medzi vzorkami (obrázok 1h). Priemerné aktivity peroxidázy mangánu boli podobné bez ohľadu na oddeľovanie koreňov alebo čas odoberania vzoriek (obrázok 1g).

Klonovať knižnice

Z klonových knižníc bakteriálnych 16S amplikónov sa získalo 169 vysoko kvalitných sekvencií. Sekvencie sú uložené v NCBI (Národné centrum pre biotechnologické informácie; www.ncbi.nlm.nih.gov) pod prístupovým číslom GU558922 – GU559073. Jedenásť sekvencií, ktoré boli priradené rastlinnej chloroplastovej DNA (ktorá je tiež amplifikovaná všeobecnými 16S primérmi) a šesť sekvencií, ktoré boli identifikované ako PCR chiméry, bolo odstránených z ďalších analýz. Phyle nebolo možné priradiť päť sekvencií. Medzi klonovanými bakteriálnymi 16S sekvenciami dominovali aktinobaktérie, po ktorých nasledovali Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Acidobacteria a Planctomycetes (obrázok 2a). Distribúcia 16S klonov v fyle nebola významne ovplyvnená oddeľovaním koreňov ( P = 0, 57) alebo časom odberu vzoriek ( P = 0, 30).

Image

Distribúcia ( a ) bakteriálnych klonov 16S a ( b ) fungálnych klonov ITS vo všetkých bakteriálnych skupinách a druhoch húb vo vzorkách humusu z lesa Pinus sylvestris, kde niektoré vzorky mali prerušené koreňové spojenia 5 alebo 14 dní pred odberom. Bakteriálne údaje 16S z dvoch odberov boli zlúčené. Ektomykorrhálne huby sú zastúpené modro-zelenými farbami, zatiaľ čo ostatné funkčné skupiny húb sú znázornené žlto-červeno-hnedou farbou.

Obrázok v plnej veľkosti

Z klonových knižníc fungálnych ITS amplikónov sa získalo 163 vysoko kvalitných sekvencií predstavujúcich 53 genotypov (jedna sekvencia bola vylúčená ako PCR chiméra). Sekvencie sú uložené v NCBI pod prístupovými číslami GU559074 – GU559126. Päť sekvencií (z ktorých každá predstavuje jeden klon) nebolo možné priradiť k príkazom s istotou. Dominantným poradím boli Agaricales (hlavne Cortinarius spp.), Za ktorým nasledovali Helotiales a Chaetothyriales ( Capronia spp.) (Obrázok 2b). Zistilo sa, že distribúcia klonov ITS v rámci objednávok je významne ovplyvnená oddeľovaním koreňov ( P <0, 001), ale nie časom odberu vzoriek ( P = 0, 21). Podiel klonov Agaricales ( Cortinarius ) sa po oddelení koreňov znížil, zatiaľ čo podiel klonov Helotiales a Chaetothyriales ( Capronia ) sa zvýšil. V piaty deň odberu vzoriek bol podiel klonov pripísaných zavedeným mykorhizným taxónom 87% v nerušených vzorkách, ale iba 54% vo vzorkách s oddelenými koreňmi. Zodpovedajúce hodnoty pre 14. deň odberu vzoriek boli 67% a 35%.

Polymorfizmus dĺžky koncových reštrikčných fragmentov

Celá sada referenčných vzorov T-RFLP odvodených zo sekvenovaných klonov obsahovala šesť skupín 2–4 genotypov a 34 samostatných genotypov, ktoré všetky poskytli jedinečné vrcholy T-RFLP z aspoň niektorých kombinácií primer-enzým. Z nich bolo 22 identifikovaných medzi profilmi T-RFLP zo vzoriek pôdy, zatiaľ čo 18 genotypov nedosiahlo hraničnú prahovú hodnotu (5% výšky najsilnejšieho vrcholu vo vzorke) v jednom alebo viacerých primeroch - kombinácie enzýmov a boli zaznamenané ako neprítomné. Početnosť taxónov podľa ich priemerného podielu fluorescencie T-RFLP primerane dobre korelovala so zastúpením taxónov v klonových knižniciach ( R2 = 0, 82). Vo vzorkách boli detegované ďalšie štyri taxóny ako vzory T-RFLP, hoci neboli prítomné medzi sekvenovanými klonmi. T-RFLP obrazce týchto taxónov boli získané zo sekvenovaných klonov z predchádzajúcej štúdie na rovnakom mieste (Lindahl et al., 2007) a patria k subphylu v rámci Ascomycota, ktoré boli doteraz opísané iba na základe sekvencií DNA (klonová skupina). I; Porter a kol., 2008). Berúc do úvahy vysoký počet týchto taxónov v profiloch T-RFLP; v priemere 14% fluorescencie je prekvapujúce, že sa nevyskytli medzi sekvenovanými klonmi. Identifikované taxóny predstavovali 30 - 93% (priemerne 65%) z celkovej fluorescencie v profiloch T-RFLP, zvyšok sa pripisoval genotypom s nízkym výskytom spolu s chybnými produktmi PCR, ktoré nie sú ITS (obrázok 3).

Image

Profily T-RFLP založené na priemernej fluorescencii spojenej s rôznymi dĺžkami fragmentov. Profily sa získali zo vzoriek humusu z lesa Pinus sylvestris a predstavujú ( a ) vzorky bez narušenia ( b ) vzorky odobraté 14 dní po odrezaní koreňov. Profily predstavujú fungálne ITS amplikóny po štiepení reštrikčným enzýmom Cfo I, s primérom ITS1f fluorescenčne značeným. Taxóny, ktoré znižujú relatívny počet v reakcii na oddeľovanie koreňov, sú označené červeným odtieňom, zatiaľ čo taxóny, ktoré zvyšujú relatívny počet po oddeľovaní koreňov, sú označené zeleným odtieňom.

Obrázok v plnej veľkosti

V korešpondenčnej analýze sa približne polovica vzoriek s oddelenými koreňmi našla mimo priestoru obsadeného skorými, nerušenými vzorkami, čo naznačuje rozdiel v zložení húb. Niektoré nerušené vzorky z neskorého odberu vzoriek sa tiež odchyľovali v zložení spoločenstva rovnakým smerom (obrázok 4). Kanonická analýza ukázala, že účinok oddeľovania koreňov na zloženie spoločenstva bol pri analýze na úrovni druhov mierne nevýznamný ( P = 0, 062), ale zreteľne významný, keď sa taxóny zlúčili v rodoch ( P = 0, 012). Čas vzorkovania nemal významný vplyv na zloženie spoločenstva ( P = 0, 15).

Image

Korešpondenčná analýza založená na relatívnom množstve plesňových rodov vo vzorkách humusu z lesa Pinus sylvestris , ako sa odhaduje pomocou T-RFLP. Osi 1 a 2 spolu tvoria 45% celkovej zotrvačnosti údajov.

Obrázok v plnej veľkosti

V nasledujúcej prezentácii sú priemerné početnosti taxónov prezentované ako frakcie z celkovej identifikovanej komunity, za predpokladu, že väčšina neidentifikovanej fluorescencie v analýzach T-RFLP môže byť pripísaná chybným produktom PCR, ktoré nie sú ITS. Podľa analýzy T-RFLP tvoril Cortinarius v priemere 69% fungálnej komunity v nerušených vzorkách, ale iba 33% po odrezaní koreňov v 5. deň odberu vzoriek. Zodpovedajúce hodnoty pre 14. deň odberu vzoriek boli 48% a 25%. Najbežnejším druhom (na začiatku experimentu) bol Cortinarius caperatus , ktorý tvoril 36% nerušených spoločenstiev, ale iba 3% po odrezaní koreňov pri odbere 5. dňa. V 14 dňoch však predstavovalo 16–17% narušených aj nenarušených komunít. Taxóny v Helotiales tvorili 6% nerušených spoločenstiev, ale 21% po odrezaní koreňov (13% a 30% po 14 dňoch). Rovnaký obrazec bol pozorovaný aj pre iné askomycety; Druhy Capronia tvorili 1% nerušených spoločenstiev, ale 10% po oddelení koreňov (2% a 6% po 14 dňoch) a Penicillium spinulosum sa nezistili vo vzorkách bez narušenia, ale predstavovali 6% vo vzorkách s oddelenými koreňmi (4 % pri oboch ošetreniach po 14 dňoch). Druhy Mortierella sa nezistili vo vzorkách bez narušenia, ale tvorili 1% z komunity 5 dní po odrezaní koreňov a 4% po 14 dňoch. Zdá sa, že skupina askomycetových klonov nebola ovplyvnená oddeľovaním koreňov, tvorila 16% v nerušených vzorkách a 14% po oddeľovaní koreňov (32% a 19% po 14 dňoch) (obrázok 3).

Kvantitatívna PCR na druhoch Leptodontidium

Priméry, ktoré sme použili špecificky amplifikovanými taxónmi v komplexe Leptodontidium . Dohromady dva rôzne reverzné priméry amplifikovali všetky klonované produkty ITS v skupine bez prekrývania cieľového rozsahu. Účinnosť PCR sa pohybovala medzi 74% a 79% a inhibícia sa pohybovala medzi 0% a 70% s priemerom 18%.

Počet kópií ITS Leptodontidium na gram humusu (výsledky oboch pridaných reverzných primérov) boli po rozdelení koreňov ( P = 0, 025) signifikantne vyššie, ale pri vzorkovaní neboli všeobecne ovplyvnené ( P = 0, 38). Interakcia medzi narušením koreňov a dobou vzorkovania bola však veľmi významná ( P = 0, 001). Po 5 dňoch po odrezaní koreňov bol počet kópií Leptodontidium ITS v priemere viac ako trikrát vyšší vo vzorkách s oddelenými koreňmi v porovnaní s nenarušenými vzorkami. Po 14 dňoch sa hladiny znížili vo vzorkách s odrezanými koreňmi a zvýšili sa v nerušených vzorkách a boli podobné pri obidvoch ošetreniach (obrázok ld). Množstvo DNA Leptodontidium v humuse pozitívne korelovalo s aktivitou celulázy ( P <0, 0001) a vzťah zostal, keď sa ako vysvetlenie premenných zahrnuli oddeľovanie koreňov, čas odberu vzoriek a ich interakcia.

diskusia

Predpokladali sme, že rýchly pokles početnosti živého mykorhizálneho mycélia v reakcii na odrezanie koreňov by viedol k zvýšenému množstvu oportunistických saprotrofov. Rýchly rast húb sa objavil do 5 dní po odtrhnutí koreňov, čo naznačuje dvojnásobná hustota mikroskopicky rozlíšiteľných hukových hyf v humuse (obrázok la). Výsledky molekulárnej analýzy naznačujú, že určité skupiny askomycet v rámci radu Helotiales a rod Capronia a Penicillium , spolu s mukoromycetami (druh Mortierella ), zvýšili svoj podiel na plesňovej DNA (obrázky 2b, 3 a 4), a to Zdá sa pravdepodobné, že týmto skupinám možno pripísať zvýšenú hustotu haluďov. Kvantitatívna PCR potvrdila, že množstvo Leptodontidium DNA 5 dní po roztrhnutí koreňov sa zvýšilo v porovnaní s kontrolami, nielen relatívne, ale tiež v absolútnom množstve (obrázok 1d). Po 14 dňoch zostala relatívna hojnosť leptodontídia vo vzorkách s odrezanými koreňmi vysoká, ale absolútne množstvo sa znížilo na polovicu úrovne zistenej po 5 dňoch a na podobnú úroveň ako v kontrolách. Zdá sa, že medzi 5 a 14 dňami sa znížil celkový súbor DNA húb, čo naznačuje, že relatívny pokles taxónov ektomykorhizy zodpovedá ešte výraznejšiemu poklesu v absolútnom vyjadrení. V súvislosti s poklesom mykorhizy sa musí vziať do úvahy zvyšujúci sa podiel iných húb v spoločenstve počas tohto obdobia.

Zdá sa teda, že narušenie koreňov spôsobuje veľké zníženie množstva ektomycorrhizálnej DNA sprevádzané pulzom produkcie haluby niektorými ascomycetami a neskôr aj mukoromycetami. Táto porucha poskytla nové zdroje vo forme starnutia mykorhizálneho mycélia, ktoré mohli byť použité proliferujúcimi, oportunistickými saprotrofmi. Okrem toho môže narušenie koreňov uvoľniť konkurenciu pri mykorhizačnom zásahu, čo umožňuje hojnosť voľne žijúcich saprotrofov. Toto zistenie v teréne je v súlade s predchádzajúcimi pozorovaniami konkurencie mykorhiznej interferencie v laboratórnych mikrokozmoch (Lindahl a kol., 1999, 2001, 2002; Werner a kol., 2002). Relatívny význam zníženej interakcie s mykorhizou a obohatenia substrátu je však ťažké stanoviť. Tieto koncepcie sa prekrývajú v tom, že živé mykorrhizálne mycélium predstavuje potenciálny zdroj pre saprotrofy a parazity, ktorý je mykorhizálnymi hubami bránený prostredníctvom antagonistických interakcií. Táto štúdia sa zaoberala krátkodobými účinkami prerušenej translokácie. Z dlhodobejšieho hľadiska sa preukázalo, že pletenie stromov zvyšuje relatívny výskyt neektomykorrhizálnych húb (Yarwood a kol., 2009) a na vytrhnutých pozemkoch sa pozorovalo zvýšenie miery rozkladu (Gadgil a Gadgil, 1971). Dlhodobé účinky na absolútnu hojnosť a činnosť saprotrofov však zostávajú neisté.

Produkty PCR s 99–100% sekvenčnou podobnosťou s najčastejšie zisteným genotypom Leptodontidium sa tiež amplifikovali z ihličnatých lesných pôd v Kanade, na Aljaške a na východe USA, ako aj z vlasových koreňov ericaceóznych kríkov v Škótsku (Bougoure et al., 2007 ). Ekológia druhov Capronia je neistá; Boli opísané patogénne, mykoparazitické a lišajníkové taxóny, ale ich kapacita ako primárnych saprotrofov rastlinného odpadu je spochybnená (Untereiner a Malloch, 1999). Bolo potvrdené, že niektoré kmene Capronia vytvárajú mykorhizu podobné štruktúry v koreňoch ericaceóznych kríkov (Allen et al., 2003). Nie je možné, že by erikoidné symbionty mohli byť uprednostňované narušením koreňov, pretože rastliny Vaccinium boli často zakorenené v izolovaných jadrách. Avšak rýchly pokles skupiny Leptodontidium počas neskoršej fázy experimentu, spolu s pozitívnou koreláciou s aktivitou celulázy a relatívnou vzácnosťou skupiny v nenarušených podmienkach naznačujú, že táto skupina pozostáva z voľne žijúcich oportunistov. Jeden z najbežnejších genotypov Mortierella bol pridelený M. humilisovi , o ktorom sa ukázalo, že pri kolonizácii slamy degraduje celulózu (Varnaitė et al., 2008). Pri rozkladajúcich sa ihličkách zozbieraných na rovnakom výskumnom mieste (Lindahl et al., 2007) nebol zistený žiadny druh, ktorý pozitívne reagoval na oddeľovanie koreňov, čo naznačuje, že nejde o pravidelné saprotrofy vrhu.

Vysoký počet Actinobacteria a Acidobacteria v kombinácii s neprítomnosťou beta-proteobaktérií a Bacteriodetes naznačuje bakteriálnu komunitu prispôsobenú nízkej dostupnosti uhlíka (Fierer et al., 2007). Na rozdiel od dramatických reakcií pozorovaných v fungálnej komunite bakteriálna komunita významne nereagovala na narušenie koreňov (obrázky 1b a 2a). Vierohodné vysvetlenie je, že saprotrofné huby, ktoré prosperovali v reakcii na mycorrhizálne starnutie, potlačili bakteriálnu komunitu a nahradili mykorhizné huby ako dominantné. Antagonizmus proti baktériám je dobre známy pre mnoho askomycet (Gloer, 2007).

Posuny v fungálnej komunite boli spojené so zvýšenou aktivitou celulázy, lakázy a NAG (obrázky 1e-g), aj keď táto bola medzi vzorkami veľmi variabilná. Celulázová aktivita korelovala s výskytom Leptodontidium , čo naznačuje príčinnú súvislosť. Zvýšené aktivity enzýmov zapojených do hydrolýzy a oxidácie organických substrátov podporujú obraz posunu od mykorhiznej komunity, nezávislej od potreby získavania energie z mŕtvych organických látok, do saprotrofických spoločenstiev, získavania energie z degradácie organických substrátov prostredníctvom pôsobenie extracelulárnych enzýmov. Laky sa môžu použiť na degradáciu fenolových zlúčenín v organických látkach, ale často sa vytvárajú aj počas konkurenčných interakcií medzi saprotrofickými hubami (Baldrian, 2004). NAG sú enzýmy podieľajúce sa na degradácii chitínu a produkujú sa vo zvýšenej miere, keď huby prerastú mŕtve mycélium iných húb (Lindahl a Finlay, 2006). Trend zvýšenej aktivity NAG v reakcii na oddeľovanie koreňov podporuje myšlienku, že mŕtve mykorhizálne mycélium by mohlo byť dôležitým substrátom pre reagujúce saprotrofy (Lindahl et al., 2001). Zvýšená aktivita celulázy však naznačuje, že sa použila aj organická hmota získaná z rastlín. Uhynuté korene by potenciálne mohli tvoriť nový substrát v narušených vzorkách, hoci pokles aktivity celulázy po 14 dňoch naznačuje, že sa používali hlavne iné, rýchlejšie vyčerpané substráty. Aktivita Mn-peroxidáz, čo sú enzýmy schopné oxidácie najrecitatívnejších zlúčenín v pôde, ako sú veľké humínové komplexy a lignín, sa nezmenila v reakcii na oddeľovanie koreňov (obrázok 1f). Nedostatok zvýšenia aktivity peroxidázy je v súlade s názorom, že tieto enzýmy sú primárne produkované basidiomycetami a že reagujúce askomycyty a mukoromycety pôsobia hlavne ako oportunisti a používajú ľahšie degradovateľné substráty. Predpokladá sa, že ektomykorhizné huby môžu byť hlavnými rozkladačmi humusu, pretože vlastnia gény Mn-peroxidázy (Bödeker a kol., 2009) a sú jedinými basidiomycetami, ktoré sa vyskytujú v humuse hojne (Lindahl a kol., 2007). Túto hypotézu podporujú relatívne vysoké aktivity Mn-peroxidázy pozorované v nenarušených vzorkách, v ktorých v komunite dominovali mycorrhizálne huby, ale nesúhlasí s trvalými aktivitami napriek narušeniu koreňov. Pretrvávajúce vysoké aktivity Mn-peroxidázy po oddeľovaní koreňov môžu naznačovať pomalú rýchlosť premeny týchto enzýmov v humuse.

Po 14 dňoch niektoré z kontrolných vzoriek vykazovali podobnosť so vzorkami oddelenými koreňmi, a to ako s ohľadom na zloženie fungálnych spoločenstiev (obrázky 1d, 2b a 4), tak na zvýšenie aktivity celulázy (obrázok 1f). Možno, že šliapanie počas pokusu a prvého odberu vzoriek, spolu s narušením koreňov spojených so zberom iných vzoriek, tiež spôsobili určité narušenie fungálnej komunity v kontrolných vzorkách. Po 14 dňoch sa počet Cortinarius caperatus zvýšil vo vzorkách oddelených koreňmi v porovnaní s veľmi nízkou prevalenciou po 5 dňoch. Dalo by sa to vysvetliť rekolonizáciou jadier zdola, pretože tento druh bol prítomný v minerálnej pôde (Lindahl et al., 2007).

Vrhové saprotrofy v boreálnom lese sú obmedzené na dusík (Boberg a kol., 2008) a zdá sa, že k počiatočnému saprotrofickému rozkladu dochádza k malému čistému uvoľňovaniu dusíka (Berg a kol., 1982). Namiesto toho sa živiny recyklujú do rastlín z degradovanejšej podstielky a humusu (Melillo a kol., 1989; Lindahl a kol., 2007). Ako už bolo uvedené, v hubových spoločenstvách v nenarušených vrstvách humusu v boreálnych lesoch prevládajú mykorhizné huby a živiny sa môžu do rastlín recyklovať priamo mykorhizálnymi hubami, a nie mineralizáciou saprotrofami (Lindahl et al., 2002, 2007; Schimel a spol. Bennet, 2004). Narušenie translokačných ciest z listov, cez korene do mykorrhizálneho mycélia však znižuje dominanciu mykorrhizálnych húb a umožňuje šírenie voľne žijúcich húb v humuse. Oportunistické saprotrofy pravdepodobne žijú na mŕtvom mykorhizálnom mycéliu, ako aj na iných zlúčeninách, ktoré sa kvôli narušeniu stanú ľahko dostupnými. Keďže oportunisti nemajú prístup k iným externým zdrojom uhlíka, ako sú živé korene alebo čerstvá podstielka, s väčšou pravdepodobnosťou zažijú obmedzovanie uhlíka a uvoľňujú živiny v anorganickej forme. Ukázali sme teda hodnoverný mechanizmus za zvýšenými hladinami anorganického dusíka, ktoré sa pozorovali v súvislosti s narušením v boreálnych lesoch (Siira-Pietikäinen a kol., 2001; Carmosini a kol., 2003; Lavoie a Bradley, 2003; Sulkava a Huhta, 2003; Lapointe a kol., 2005; Piirainen a kol., 2007). Avšak z dôvodu možného odstránenia NH4 + koreňmi v nenarušených systémoch sme sa nemohli priamo zaoberať otázkou, či zmeny v zložení hubových spoločenstiev skutočne viedli k zvýšeniu miery mineralizácie N. Tento problém zdôrazňuje ťažkosti pri meraní rýchlosti mineralizácie v systémoch, ktoré sú citlivé na narušenie koreňov. Naše výsledky v skutočnosti vyvolávajú tieň pochybností o všetkých metódach používaných na štúdium mikrobiálnych procesov v izolovaných vzorkách lesných pôd, v ktorých boli prerušené koreňové spojenia. Je zrejmé, že takéto merania sa uskutočňujú na mikrobiálnej komunite, ktorá je funkčne veľmi odlišná od merania v nerušenej pôde. Vylúčením mykorhizných húb je pravdepodobné, že merania podceňujú mikrobiálne dýchanie a rast. Naopak, v dôsledku spustenia oportúnnych saprotrofov bude miera mineralizácie živín pravdepodobne nadhodnotená.

Funkčný posun v mikrobiálnej komunite uvedený v tejto štúdii súvisel so zmenami relatívnej dominancie funkčných skupín húb, čo poukazuje na nedostatočné rozlíšenie metód, ktoré sa zameriavajú na všetky huby ako jednu funkčnú entitu. Analýzy molekulárnych spoločenstiev poskytujú rozlíšenie potrebné na identifikáciu druhov a funkčných skupín. Metodický vývoj v molekulárnej húbovej ekológii v súčasnosti prechádza boomom (Hibbett a kol., 2009) av kombinácii s opatrnými poľnými manipuláciami a meraniami environmentálnych a funkčných parametrov, ako sú koncentrácie prvkov a enzýmové aktivity. Metódy založené na DNA nám môžu pomôcť objasniť environmentálne faktory, ktoré ovplyvňujú zostavenie húb, ako aj funkčné úlohy húb v ekosystémoch. Naše výsledky naznačujú, že potláčanie voľne žijúcich húb mykorhizálnymi hubami môže byť významným faktorom pri formovaní fungálnych spoločenstiev. Prerušenie translokačných ciest uhlíka z dôvodu prírodných alebo antropogénnych porúch môže spôsobiť dramatické posuny v zložení húb a potenciálne znížiť zadržiavanie živín v plesňových myceliálnych sieťach.

prírastky

GenBank / EMBL / DDBJ

  • GU558922-GU559073
  • GU559074-GU559126

Doplnková informácia

Obrázkové súbory

  1. 1.

    Doplnkový materiál 2

  2. 2.

    Doplnkový materiál 3

Word dokumenty

  1. 1.

    Legendy za doplnkový materiál

  2. 2.

    Doplnková informácia

    Doplňujúce informácie sprevádzajú dokument na webovej stránke časopisu ISME (//www.nature.com/ismej).