Orientácia delenia buniek je spojená s adhéziou buniek k bunkám komplexom e-kadherín / lgn | prírodná komunikácia

Orientácia delenia buniek je spojená s adhéziou buniek k bunkám komplexom e-kadherín / lgn | prírodná komunikácia

Anonim

predmety

  • Prilepí križovatky
  • kadheriny
  • mitosis
  • Mitotické vreteno

abstraktné

Pri vytváraní tkanivovej architektúry zohrávajú pri vytváraní tkanivovej architektúry významnú úlohu priľnavosť medzi bunkami a orientované bunkové delenie, nie je však jasné, ako by mohli byť koordinované. Tu demonštrujeme, že bunkový adhézny proteín E-kadherín funguje ako poučné usmernenie pre orientáciu bunkového delenia. Toto je sprostredkované evolučne konzervovaným komplexom LGN / NuMA, ktorý reguluje kortikálne pripojenia astrálnych vretienkových mikrotubúl. Ukazujeme, že LGN, ktorý má trojrozmernú štruktúru podobnú katechínom viazaným na kadherín, sa viaže priamo na cytosolický chvost E-kadherínu, a tým sa lokalizuje pri adhézii medzi bunkami. Pri mitotickom vstupe sa NuMA uvoľňuje z jadra a kompetuje LGN z E-kadherínu o lokálne vytvorenie komplexu LGN / NuMA. To sprostredkuje stabilizáciu kortikálnych asociácií astrálnych mikrotubúl pri bunkových adhéziách, aby sa orientovala mitotická vretienka. Naše výsledky ukazujú, ako E-kadherín inštruuje zostavenie komplexu LGN / NuMA pri kontaktoch bunka - bunka, a definujú mechanizmus, ktorý spája orientáciu bunkového delenia s medzibunkovou adhéziou.

úvod

Orientácia bunkového delenia definuje polohu dcérskych buniek v tkanive, a teda riadi tkanivovú architektúru a bunkový osud 1, 2 . V jednoduchom epiteli si planárne bunkové delenia udržiavajú jednovrstvový epitel 1, 3, zatiaľ čo delenia v smere apikozálnej bazálnej osi vyvolávajú viacvrstvové vrstvenie, ako napríklad vo vrstvenom epiteli 2, 4 . Dôležitosť správnej orientácie na delenie je zdôraznená rôznymi vývojovými poruchami, ktoré sú dôsledkom dezorientovaného delenia buniek 5, 6, ktoré môžu tiež prispievať k progresii nádoru 7, 8, 9, 10 .

Rovina bunkového delenia je určená polohou mitotického vretena. V tkanivách po celom Metazoa je to evolučne konzervovaný adaptorový proteín LGN, ktorý viaže lipidy ukotvené Gai v bunkovej kôre 11, 12 . LGN lokalizuje NuMA, ktorý nasmeruje mitotické vreteno kotvením astrálnych mikrotubúl vretena do bunkovej kôry a pôsobením ťahovej sily na tieto mikrotubuly prostredníctvom pridruženého dyneínu 11, 13, 14, 15, 16. Na stanovenie správnej orientácie mitotického vretena bunky reagujú na inštruktívne priestorové narážky z miestneho prostredia 17, 18 . Aj keď už bolo opísaných niekoľko kortikálnych väzbových miest pre LGN, vrátane DLG 9, 19, preniknuteľných 20, 21, 22 a afadínu 23, identity receptorov, ktoré snímajú a prekladajú extracelulárne narážky na lokalizáciu komplexu LGN / NuMA a preto mitotické vreteno nie je dobre známe.

Vo väčšine tkanív sú susedné bunky spojené evolučne konzervovanými klasickými kadherínmi, ako je napríklad E-kadherín. Cytosolický chvost E-kadherínu je spojený s aktínovým cytoskeletom prostredníctvom viazaných kateínových proteínov (a-, P- a p120-katenínu) a tvorí signálnu platformu, ktorá spúšťa intracelulárne reakcie po trans- interakcii kadherínovej extracelulárnej domény 24 . Dôležité je, že strata E-kadherínu naruší nielen priľnavosť medzi bunkami, ale aj orientáciu bunkových delení, vrátane rovinnej orientácie bunkových delení v jednoduchých epiteloch 25, 26, 27, 28, 29 . Presná úloha E-kadherínu v divíznej orientácii však nie je známa a zostáva nejasné, či E-kadherín hrá iba permisívnu úlohu v divíznej orientácii, alebo či je samotný E-kadherín spojený s mitotickým vretenom 17 . Tu demonštrujeme, že LGN sa viaže priamo na cytosolický chvost E-kadherínu, ktorý riadi mitotický nábor NuMA, čo vedie k stabilným kortikálnym asociáciám astrálnych mikrotubúl v kontaktoch bunka-bunka na orientáciu mitotického vretena. Týmto spôsobom E-kadherín priamo koordinuje dva základné procesy, adhéziu medzi bunkami a orientáciu na bunkové delenie, ktoré riadia organizáciu tkanív počas vývoja a homeostázy.

výsledok

E-kadherín prijíma LGN do kontaktov bunka - bunka

Polarizované, kortikálne rozdelenie LGN definuje mitotickú os vretena v tkanivách v celom Metazoa. Nie je však dobre známe, ako extracelulárne narážky riadia lokalizáciu LGN na smerovanie orientácie vretena. V monovrstvách epitelových buniek MDCK bol LGN obohatený pri kontaktoch bunka - bunka, zatiaľ čo nebol prítomný v membránach, ktoré neboli v kontakte so susednými bunkami (obrázok la, horné panely). Táto distribúcia LGN pri kontaktoch bunka - bunka bola ešte výraznejšia po tom, ako bunky vstúpili do mitózy (obr. 1a, spodné panely). Špecifickosť zafarbenia LGN bola potvrdená depléciou sprostredkovanou shRNA, čo malo za následok stratu zafarbenia LGN pri kontaktoch bunka - bunka (doplnkový obrázok 1).

Image

a ) Lokalizácia endogénneho LGN pri kontaktoch bunka - bunka, označená E-kadherínom (E-cad), v medzifázových a mitotických bunkách MDCK. Šípky označujú kontakty bunka - bunka a hviezdičky označujú plazmatickú membránu, ktorá sa nedotýka inej bunky. ( b ) TIRF a epifluorescenčná mikroskopia zobrazujúca endogénne LGN v MDCK bunkách nanesených na povrchoch mikroimplantovaných striedavými prúžkami kolagén-IV / E-cad: Fc alebo kolagén-IV / Fc, s kvantifikáciou intenzít farbenia LGN v plazme membrána viazaná na rôzne pruhy. Kvantifikované údaje boli zhromaždené z troch nezávislých experimentov, sivé stĺpce ukazujú priemer ± sd ( c ) povrchové štruktúry NuMA v komplexe s TPR opakovaniami LGN 20 a p-katenínu a p20-katenínu s E-kadherínom 32, 33 . Viac podrobností o rozhraní viažucom sa na E-kadherín / p120-katenín a LGN / NuMA, pozri doplnkový obrázok 2. CBD, doména viažuca katenín; JMD, juxtamembránová doména. ( d ) GST-strhnutie rekombinantného E-kadherínového cytosolického chvosta (GST-E-cad-cyto) s LGN-TPR, imunoblotované pre GST (červená) a LGN (zelená). e ) bunky U2OS s nízkymi hladinami endogénneho E-kadherínu, ktoré vykazujú nábor LGN-TPR značeného YFP do cytosolického chvosta E-kadherínu (cyto) alebo JMD zameraného na mitochondrie fúziou s mitochondriálnym lokalizačným signálom (MLS) ActA, Tento nábor nebol pozorovaný u CBD alebo JMD obsahujúcich mutáciu DEE758-760AAA. EV, prázdny vektor. Mierka, 10 μm; **** P <0, 0001; NS = nevýznamné, pri použití spárovaného študentského t- testu.

Obrázok v plnej veľkosti

Aj keď viac adhéznych komplexov prispieva k medzibunkovej adhézii v epitelových bunkách, E-kadherín hrá významnú úlohu pri vytváraní adhézií medzi bunkami 30 . Použili sme redukcionistický prístup na testovanie, či adhézia buniek a buniek na báze E-kadherínu riadi kortikálne obohatenie LGN. Jednotlivé MDCK bunky sa umiestnili na povrch funkcionalizovaný striedajúcimi sa pruhmi kolagénu-IV a buď extracelulárnou doménou E-kadherínu (E-cad: Fc) alebo Fc ako kontrolou 31 . Mikroskopia s úplnou internou reflexnou fluorescenciou (TIRF) odhalila významné obohatenie LGN na bunkovom povrchu viazanom na pruhy E-cad: Fc v porovnaní buď s kolagénom-IV alebo Fc (obr. 1b). Zdá sa teda, že E-kadherín smeruje k lokalizácii tejto kľúčovej zložky strojového zariadenia na orientáciu vretena do kôry buniek.

Zvážili sme, ako by E-kadherín mohol lokalizovať LGN pri kontaktoch bunka - bunka. E-kadherín sa asociuje s aktínovým cytoskeletom prostredníctvom cytosolického chvosta, ktorý sa viaže priamo na p120-katenín a p-katenín. Napriek malému prekrývaniu sa v aminokyselinovej sekvencii tvorí TPR opakujúca sa doména LGN (LGN-TPR) 20, 21, 22 a opakovaná doména armadillo β-katenínu a p120-katenínu 32, 33 podobnú super helikálnu štruktúru obsahujúcu nabitá drážka (Obr. 1c; Doplnkový obrázok 2). Naviazanie LGN-TPR na negatívne nabitý motív v NuMA navyše veľmi pripomína, ako sa p-katenín a p120-katenín viažu na cytosolický chvost E-kadherínu (doplnkový obrázok 2).

Aby sme otestovali, či sa LGN-TPR viaže priamo na E-kadherínový cytosolický chvost, v baktériách sme ko-exprimovali LGN-TPR a GST-označený E-kadherínový cytosolický chvost. GST-down down preukázal, že medzi týmito dvoma proteínmi vznikol komplex (obr. Ld). Na testovanie tejto interakcie v cicavčích bunkách sme nesprávne zacieľovali E-kadherínový cytosolický chvost na povrch mitochondrií v bunkách U2OS, ktorým chýba endogénny E-kadherín. To viedlo k spoločnému náboru LGN – TPR (obr. 1e). K podobnému spoločnému náboru LGN došlo, keď juxtamembránová doména (JMD), ale nie p-katenín viažuca doména (CBD) cytosolického chvosta E-kadherínu bola zameraná na mitochondrie (obrázok 1e). Nábor LGN do cytosolického chvosta E-kadherínu si vyžadoval vysoko konzervovaný, negatívne nabitý motív v rámci JMD, pretože expresia DEE758–760 trojitého alanínového mutanta (JMD-AAA) neregistrovala LGN-TPR na mitochondrie (obrázok 1e). E-kadherínový cytosolický chvost sa teda viaže priamo na LGN prostredníctvom väzbového režimu podobného kadherínovým väzbovým proteínom.

E-kadherín usmerňuje mitotickú orientáciu vretena

Predtým sa ukázalo, že strata adhézie sprostredkovanej E-kadherínom narúša orientáciu bunkového delenia v rôznych tkanivách, vrátane planárneho delenia v epiteli 25, 26, 27, 28, 29 . Spolu s našou identifikáciou priamej väzby E-kadherínu na LGN tieto výsledky naznačujú, že E-kadherín by mohol pôsobiť ako poučný pokyn pre orientáciu mitotických vretien, ktorý je dostatočný na orientáciu epiteliálneho delenia. Na priame testovanie sme selektívne prerušili, indukovali alebo napodobňovali bunkovú adhéziu sprostredkovanú E-kadherínom a analyzovali sme lokalizáciu LGN a orientáciu mitotického vretena.

Po prvé, na prerušenie adhézie E-kadherínu bez straty celkovej medzibunkovej adhézie sme použili bunky MDCK exprimujúce mutant E-kadherínu (T151) so skrátenou nefunkčnou extracelulárnou doménou, ale intaktnou cytosolickou chvostou uviazanou na plazmovej membráne, ktorá viaže kateníny a aktín ( Doplnkový obrázok 3a; odkaz 34). Dôležité je, že endogénny E-kadherín je znížený, keď je indukovaná expresia T151, ale kohézna monovrstva je udržiavaná kvôli iným spojom bunka-bunka (doplnkový obrázok 3a; odkaz 34). Pretože nemôže tvoriť extracelulárne interakcie, T151 E-kadherín lokalizovaný pozdĺž celej plazmatickej membrány a LGN už podobne nebol obohatený o plazmatickú membránu špecificky pri kontaktoch bunka-bunka (obrázok 2a). Konfokálne zobrazovanie y-tubulínu lokalizovaného centrosómom ukázalo, že rovinná orientácia vretena pozorovaná v prítomnosti endogénneho E-kadherínu (obr. 2b, c, + DOX) sa tiež stratila, keď sa E-kadherín nahradil T151 (obr. 2b, c, -DOX). Táto strata orientácie vretena v prítomnosti T151 E-kadherínu nebola obmedzená na metafázu, ale bola rozšírená na anafázu (doplnkový obrázok 4a, b); nadmerná expresia cytosolického chvosta E-kadherínu má podobný účinok 25 . Selektívna strata adhézie bunka-bunka sprostredkovaná E-kadherínom teda narúša orientáciu delenia epitelových buniek v inak súdržnej monovrstve, ktorá exprimuje celý repertoár iných proteínov adhézie bunka-bunka.

Image

a ) Schematické znázornenie E-kadherínu skráteného v plnej dĺžke a T151 (pod kontrolou represorového promótora doxycyklínu (DOX)). Imunofarbenie endogénneho LGN a HA-značeného T151 E-kadherínu (-DOX), ktoré ukazuje, že lokalizácia plazmatickej membrány LGN sa už neobmedzuje iba na kontakty bunka-bunka (šípky), ale tiež sa lokalizuje na membránach, ktoré nie sú v kontakte so susednými bunkami. (hviezdičky). ( b ) Konfokálne obrázky centrosómov značených y-tubulínom v bunkách MDCK T151, ktoré ukazujú orientáciu mitotického vretena v metafáze. ( c ) Kvantifikácia mitotického uhla vretena vzhľadom na základný povrch v MDCK T151 bunkách. ( d ) lokalizácia LGN v L-bunkách v neprítomnosti alebo v prítomnosti ektopického E-kadherínu (E-kad). e ) Konfokálne zobrazenie centrosómov značených y-tubulínom v L-bunkách, ktoré ukazujú orientáciu mitotického vretena v metafáze, v neprítomnosti alebo v prítomnosti ektopického E-kadherínu. f ) Kvantifikácia mitotického uhla vretena vzhľadom na základný povrch v L-bunkách v neprítomnosti (prázdny vektor) alebo v prítomnosti ektopického E-kadherínu. Mierka, 10 μm. Kvantifikované údaje sa zhromaždili z troch nezávislých experimentov. Šedé stĺpce v bodkových grafoch ukazujú priemer ± sd; **** P <0, 0001 pomocou Mann-Whitneyovho testu.

Obrázok v plnej veľkosti

Po druhé, na testovanie, či ektopická expresia E-kadherínu môže orientovať mitotické vreteno, sme použili myšie fibroblasty L-buniek, ktorým chýba E-kadherín a iné adhézne spojenia bunka-bunka. Ektopická expresia E-kadherínu vedie k up-regulácii katechínov spojených s kadherínom a tvorbe kontaktov bunka-bunka na báze E-kadherínu v týchto bunkách (doplnkový obrázok 3b; odkaz 35, 36). Expresia E-kadherínu vyvolala nábor endogénneho LGN do kontaktov bunka-bunka (obr. 2d) a významné skreslenie v orientácii vretena rovnobežne s vytvorenou monovrstvou (obr. 2e, f). Naopak u rodičovských L-buniek nebol LGN obohatený plazmatickou membránou a orientácia vretena bola náhodná (obr. 2e, f). Ektopická expresia DE-kadherínu v neadherentných bunkách Drosophila S2, pestovaných v suspenzii, a teda aj v neprítomnosti adhézií extracelulárnej matrice, tiež ovplyvnila orientáciu vretena kolmo na spojenie medzi bunkami a bunkami (doplnkový obrázok 3c – e). Toto sa nepozorovalo, keď sa v bunkách S2 indukovala adhézia bunka-bunka expresiou buď DE-kadherínového mutanta, ktorý nemá cytosolický chvost, alebo nepríbuznej molekuly adhézie medzi bunkami a bunkami Fasciclin II (doplnkový obrázok 3d, e).

Po tretie, na testovanie toho, či je E-kadherín dostatočný na to, aby usmerňoval orientáciu vretienka v epitelových bunkách, sme použili mikro-vyrobené silikónové bočné steny funkcionalizované s E-cad: Fc. Tieto bočné steny majú geometriu podobnú adhézii natívneho E-kadherínu v MDCK bunkách 37 a napodobňujú E-kadherínom sprostredkované spojenia bunka-bunka v neprítomnosti iných adhéznych proteínov a juxtamembránových signálov zo susedných buniek (obrázok 3a). Bunky MDCK priľnuli k bočným stenám potiahnutým E-cad: Fc so silným obohatením bunkového E-kadherínu na plazmovej membráne pri kontakte s bočnou stenou bunky (obr. 3b). Je dôležité, že pripojenie buniek MDCK k bočnej stene Ecad: Fc viedlo k náboru LGN na hladiny porovnateľné s prirodzenými spojmi bunka-bunka (obr. 3c) a ovplyvňovalo orientáciu mitotického vretena kolmo na bočnú stenu (obr. 3d, e). Doplnkový obrázok 4c). Na rozdiel od toho bola orientácia vretena náhodná v bunkách, ktoré boli spojené s kontrolnými bočnými stenami potiahnutými Fc (obr. 3d, e; doplnkový obr. 4c). Naše výsledky dokazujú, že E-kadherín je dostatočný na to, aby pôsobil ako inštruktážna narážka, ktorá prijíma LGN a zameriava mitotické vreteno vzhľadom na spojenie medzi bunkami a bunkami.

Image

( a ) Návrh bočnej steny E-kadherínu: Fc, v ktorej je zvislá silikónová bočná stena potiahnutá E-kadherínom: Fc (E-cad: Fc) a základný povrch nie je potiahnutý. ( b ) Lokalizácia E-kadherínu: DsRed (E-kad) v spojení bunka bočnej steny v bunkách MDCK. ( c ) Imunofarbenie endogénneho LGN v bunkách asociovaných s bočnou stenou E-kadherínu: Fc, ktoré ukazuje, že LGN je rekrutovaný na spojenie medzi bočnou stenou a bunkou označené E-kadherínom (šípka), podobné natívnym adhéziám medzi bunkami a bunkami (šípka) v monovrstva, zatiaľ čo LGN chýba vo voľnej membráne (hviezdička). ( d, e ) GFP-tubulín exprimujúce MDCK bunky spojené s bočnými stenami E-cad: Fc ( n = 20) a Fc ( n = 21), s kvantifikáciou ružového diagramu mitotického uhlu vretena vzhľadom k bočnej stene. Pozri doplnkový obrázok 3f, kde nie sú údaje o nebalenom stave. Mierka, 10 μm. Kvantifikované údaje sa zhromaždili zo štyroch nezávislých experimentov.

Obrázok v plnej veľkosti

E-kadherín usmerňuje orientáciu vretena prostredníctvom viazaného LGN

Aby sme jednoznačne demonštrovali, že E-kadherín inštruuje orientáciu delenia buniek prostredníctvom vytvorenia komplexu s LGN, navrhli sme mutant E-kadherínu, ktorý sa neviaže na LGN, ale zachováva si svoju schopnosť vytvoriť adhéziu bunka-bunka. Ukázali sme, že LGN sa viaže na konzervovaný, negatívne nabitý aminokyselinový triplet (DEE758–760) v rámci JMD cytosolického chvosta E-kadherínu (obrázok 1e). Tento aminokyselinový triplet je tiež nevyhnutný pre väzbu pl20-katenínu na E-kadherín, čo vyžaduje druhý záporne nabitý triplet EED764-766 (obrázok 4a; odkaz 33). Testovali sme príspevok jednotlivých zvyškov v rámci prvého tripletu na väzbu p120-katenínu alebo LGN pomocou testu spoločného prijímania mitochondrií. Mutant D758A selektívne blokoval nábor LGN-TPR do cytosolického chvosta E-kadherínu, podobne ako účinok mutácie celého tripletu (obrázok 4b, c). D758A však v tomto teste neovplyvnil nábor p120-katenínu (obr. 4d), pravdepodobne preto, že susediace nabité zvyšky poskytujú dostatočnú afinitu pre väzbu p120-katenínu (obr. 4a). Je pozoruhodné, že mutant E-kadherínu D758A s plnou dĺžkou exprimovaný v L-bunkách lokalizovaný v spojení medzi bunkami a bunkami a indukovanú adhéziu medzi bunkami a bunkami porovnateľný s divokým typom E-kadherínu (obrázok 4e). E-kadherín D758A však neindukoval rovinnú orientáciu vretena (obr. 4e). Podobne bola planárna orientácia vretena blokovaná v L-bunkách exprimujúcich E-kadherín divokého typu, ale zbavená LGN pomocou knockdownovania sprostredkovaného shRNA (obr. 4e). Lokalizácia LGN je teda regulovaná interakciou s cytosolickým chvostom E-kadherínu a tvorba tohto komplexu je potrebná na orientáciu vretena sprostredkovanú E-kadherínom.

Image

( a ) Trojrozmerná štruktúra interakcie medzi p120-katenínom a juxtamembránovou doménou (JMD) E-kadherínu, pričom sa v E-kadheríne, ktoré prispievajú k p120 - označujú dve negatívne nabité triplety (červená) a hydrofóbne zvyšky (žltá). väzba na katenín; na základe ref. 33. ( b, c ) Nábor YFP – LGN – TPR do divokého typu alebo D758A JMD, ktorý bol zameraný na mitochondrie fúziou s mitochondriálnym lokalizačným signálom (MLS) ActA. Kvantifikácia ukazuje pomer mitochondriálneho versus cytosolického YFP-LGN-TRP na koexpresii prázdneho vektora (EV), štandardného typu JMD alebo uvedených mutantov; n = 5. d ) Kvantifikácia náboru GFP-p120-katenínu do JMD, obsahujúca indikované bodové mutácie, a zacielená na mitochondrie fúziou s MLS ActA; n = 5. e ) Kvantifikácia mitotického uhla vretena vzhľadom na základný povrch rodičovských L-buniek, E-kadherínu exprimujúceho L-bunky buď skramblovanými (scr) alebo LGN shRNA, alebo L-buniek exprimujúcich divoký typ alebo D758A E- kadherín-GFP, zhromaždené z troch nezávislých experimentov. Vpravo: xz - projekcia mitotických buniek vykazujúca podobnú laterálnu distribúciu pri kontaktoch bunka-bunka divého typu a D758A E-kadherín-GFP. Kvantifikované údaje sa zhromaždili z troch nezávislých experimentov, sivé stĺpce v bodových grafoch ukazujú priemerné stĺpce stupnice ± sd, 5 um. ** P <0, 003, *** P <0, 0002, **** P <0, 0001, NS = nevýznamné pomocou nepárového študentského t -testu ( c, d ) alebo Mann – Whitneyovho testu ( e ).

Obrázok v plnej veľkosti

E-kadherín lokalizuje komplex LGN / NuMA v mitóze

LGN orientuje mitotické vreteno lokalizáciou svojho väzobného partnera NuMA do kôry 11 . Avšak podobnosť vo väzbovom režime medzi LGN s E-kadherínom a s NuMA (obr. 1c; doplnkový obrázok 2) naznačuje, že tieto interakcie sa pravdepodobne vzájomne vylučujú. Túto možnosť sme testovali v in vitro konkurenčnom teste, ktorý ukázal, že pridanie rekombinantnej LGN-väzbovej domény NuMA kompetovalo E-kadherín z komplexu E-cad-cyto / LGN-TPR (obr. 5a). To vyvoláva otázku, či je E-kadherín schopný lokalizovať NuMA, aj keď sa nemôže tvoriť ternárny komplex E-kadherínu, LGN a NuMA.

Image

a ) S-proteínová agaróza stiahne z rekombinantného cytoplazmatického chvosta LGN – TPR a E-kadherínu v prítomnosti alebo neprítomnosti peptidu NuMA, imunoblotovaného pre LGN a E-kadherín, čo ukazuje konkurenciu cytosolického chvosta E-kadherínu z LGN-TPR : S-tag doménou NuMA viažucou LGN. ( b ) Lokalizácia endogénneho NuMA a E-kadherínu v interfázových a mitotických MDCK bunkách. ( c ) TIRF a epifluorescenčná mikroskopia NuMA v MDCK bunkách nanesených na mikro-vzorované striedavé pruhy kolagénu-IV / E-cad: Fc. Bunky sú na obrázku TIRF znázornené žltou farbou (mitotis) a šedou farbou (medzifázové). ( d ) Kvantifikácia intenzity fluorescencie NuMA na plazmovej membráne naviazanej na pruhy potiahnuté rôznymi proteínmi v medzifázových a mitotických bunkách. ( e ) Cytosolická lokalizácia nadmerne exprimovaného GFP-NuMA v bunkách MDCK s interfáziou, vykazujúca jeho cytosolickú akumuláciu (označenú hviezdičkou) v bunkách s vysokou expresiou. ( f ) Lokalizácia GFP-NuMA na MDCK bunkách nanesených na kolagén-IV / E-cad: Fc mikro-vzorované povrchy vizualizované TIRF mikroskopiou. ( g ) Kvantifikácia intenzity fluorescencie NuMA na plazmatickej membráne naviazanej na rôzne pásy v mitotických bunkách pri shRNA-sprostredkovanej deplécii LGN, prerušenie interakcií LGN / Ga a nadmernou expresiou Ric8 alebo na expresiu siRNA zacielených na Gai, Gα. i 2 a Ga 3. Reprezentatívne obrázky a epifluorescencia lokalizácie NuMA v monovrstvách shRNA LGN sú znázornené na doplnkovom obrázku 4a – 4c. h ) Model lokalizácie komplexu LGN / NuMA na kontaktoch bunka-bunka pomocou E-kadherínu. Interakciou s cytosolickým chvostom E-kadherínu sa LGN prijíma do medzifázových kontaktov medzi bunkami a bunkami. Po jadrovom rozklade počas mitotického vstupu sa NuMA uvoľňuje z jadra a konkuruje LGN z komplexu E-kadherín / LGN. Lokálne vytvorený komplex LGN / NuMA zostáva pri adhézii E-kadherínu prostredníctvom interakcie LGN s Gai. Mierka, 10 μm; všetky kvantifikované údaje boli spojené z troch nezávislých experimentov; sivé stĺpce v bodkových grafoch ukazujú priemer ± sd; **** P <0, 0001; *** P = 0, 0002, NS = nevýznamné, pri použití nepárového t- testu študenta.

Obrázok v plnej veľkosti

NuMA obsahuje nukleárny lokalizačný motív, a preto na rozdiel od LGN spočíva v jadre počas interfázy primárne (obr. 5b). Po rozdelení jadrových obalov na začiatku mitózy sa NuMA redistribuovala do mitotického vretienka a kôry buniek (obrázok 5b). TIRF zobrazovanie buniek nanesených na mikro-vzory kolagén-IV / E-cad: Fc ukázalo, že NuMA sa akumuloval v miestach adhézie E-kadherínu v mitotických bunkách (obrázok 5c, d). Aby sme otestovali, či strata jadrovej retencie pri rozpade jadrových obalov bola kľúčovou udalosťou pri regulácii zacielenia NuMA na adhézie E-kadherínu v mitóze, úmyselne sme nadmerne exprimovali GFP-NuMA, aby nasýtili jeho jadrovú prítomnosť a spôsobili jeho cytoplazmatickú akumuláciu v medzifáze (Obr. 5e). Za týchto podmienok sa cytosolický GFP-NuMA tiež ko-lokalizoval s miestami adhézie E-kadherínu na mikro-vzorovaných povrchoch (obrázok 5f). Tento výsledok naznačuje, že lokalizácia NuMA na adhézie E-kadherínu je konštitutívny proces, ale vyskytuje sa špecificky pri mitóze, keď sa NuMA uvoľňuje z jadra.

Keďže ternárny komplex E-kadherínu, LGN a NuMA netvorí, navrhujeme spoločné vysvetlenie pre nábor NuMA do E-kadherínu. Po obohatení LGN o E-kadherín v medzifázi mitotické uvoľňovanie NuMA z jadra konkuruje LGN z E-kadherínu, ako sme demonštrovali in vitro (obr. 5a); výsledný komplex LGN / NuMA zostáva lokalizovaný v kontaktoch bunka-bunka na báze E-kadherínu prostredníctvom väzby LGN na kortikálny Gai (ref. 11). Na testovanie tejto hypotézy sme skúmali, či nábor NuMA do adhézií E-kadherínu bol závislý od LGN a od interakcie LGN s Gai. Keď sme predpokladali, NuMA nebol prijatý na adhéziu E-kadherínu v mitóze po vyčerpaní LGN sprostredkovanom shRNA (obrázok 5g; doplnkový obrázok 5a, b). Pretože väzba LGN závisí od stavu Gai i viazaného na HDP (odkaz 11), ďalej sme nadmerne exprimovali faktor výmeny guicínového nukleotidu Ric8, aby sme priviedli Gai do stavu viazaného na GTP, a tak narušili väzbu na LGN, ako už bolo predtým preukázané. 38 . Podobne ako pri deplécii LGN, to malo za následok stratu náboru NuMA k mikro-vzorovým adhéziám E-kadherínu v mitotických bunkách (obrázok 5g; doplnkový obrázok 5c). Je dôležité, že nadmerná expresia Ric8 neovplyvnila spojovaciu lokalizáciu samotného E-kadherínu (doplnkový obrázok 5d). Nakoniec siRNA-sprostredkovaná deplécia Gai z MDCK buniek viedla k podobnej strate náboru NuMA ako pri mikro-vzorovaných E-kadherínových adhéziách pri mitóze (obr. 5g). Tieto výsledky naznačujú, že E-kadherín slúži ako kortikálna medzník na lokalizáciu LGN k bunkovým adhéziám, čo pripravuje miesto pre mitotické zostavenie komplexu LGN / NuMA viazaného na Ga pri adhézii bunkových buniek (obrázok 5h).

E-kadherín stabilizuje kortikálne astrálne mikrotubulárne asociácie

NuMA poskytuje spojenie medzi LGN a mitotickým vretenom, pretože NuMA sa viaže priamo na astrálne mikrotubuly a je schopný aplikovať na tieto mikrotubuly ťažnú silu prostredníctvom svojho spojenia s dyneínom 11, 13, 14, 15, 16. Po zistení, že komplex E-kadherín / LGN riadi mitotickú lokalizáciu NuMA na adhéziu medzi bunkami (obr. 5), sme predpokladali, že mitotické mikrotubuly by mali vytvárať stabilnejšie asociácie s bunkovou kôrou v bunkách závislých od E-kadherínu. adhézie ako na neadhéznych miestach. Aby sa to otestovalo, bunky MDCK stabilne exprimujúce mRNA EB1 značené mRFP, ktoré označovali kladné konce mikrotubulov, sa umiestnili na sklo funkcionalizované E-cad: Fc, aby sa vyvolala adhézia závislá od E-kadherínu na bazálnom povrchu buniek. Bunky sa alternatívne umiestnili na kontrolný povrch potiahnutý poly-D-lyzínom, aby sa vyvolala nešpecifická elektrostatická adhézia. Kortikálne EB1-značené mikrotubuly v bunkách v metafáze sa vizualizovali pomocou TIRF mikroskopie (obr. 6a). Mikrotubuly označené EB1 v bunkách adherujúcich k poly-D-lyzínu mali krátkodobé asociácie s bazálnou membránou (obr. 6b, c; priemerná doba zotrvania - 7 s). Na porovnanie, časy zotrvania kortikálnej EB1-plazmatickej membrány v bunkách, ktoré držali E-cad: Fc, boli významne dlhšie (obr. 6b, c; priemerný čas zotrvania - 25 s), hoci celkový počet udalostí za minútu bol porovnateľný s bunkami na poly-D-lyzín. Je dôležité, že časy zotrvania EB1-plazmatických membránových udalostí na membránach spojených s E-cad: Fc boli znížené pri deplécii LGN sprostredkovanej shRNA (obr. 6d). Kortikálna asociácia mitotických astrálnych mikrotubúl je teda stabilizovaná v miestach adhézie E-kadherínu, v závislosti od LGN.

Image

( a, b ) TIRF mikroskopické zobrazenie astrálnych mikrotubúl značených mRFP-EB1 na bazálnej membráne buniek MDCK, ktoré ulpievajú na povrchoch potiahnutých poly-D-lyzínom alebo E-cad: Fc. Kymograf ukazuje trvanie bazálnych udalostí mRFP-EB1 v perióde 60 s pozdĺž vyznačenej bodkovanej čiary. Fialové a zelené šípky označujú dynamické (5 s trvanie) punktu EB1. ( c ) Kvantifikácia časov zotrvania EB1 puncta na bazálnej membráne mitotických MDCK buniek adherujúcich k povrchom potiahnutým poly-D-lyzínom alebo E-cad: Fc ( n = 14 buniek). ( d ) Kvantifikácia časov zotrvania EB1 puncta na bazálnej membráne mitotických MDCK buniek, exprimujúca skramblovaná kontrola (scr) alebo LGN shRNA, adherovanie k povrchom potiahnutým E-cad: Fc ( n = 11 buniek). Mierka, 5 μm. Kvantifikované údaje sa zhromaždili z troch nezávislých experimentov; sivé stĺpce ukazujú priemer ± sd **** P <0, 0001 pri použití Mann-Whitneyovho testu.

Obrázok v plnej veľkosti

diskusia

Pri vývoji a organizácii tkanív hrajú významnú úlohu tak orientované bunkové delenie, ako aj adhézia bunka-bunka. Tu sme poskytli dôkaz, že E-kadherín koordinuje tieto dva základné procesy, pretože sme preukázali, že E-kadherín je poučný pokyn pre orientáciu mitotických vretien. Okrem toho sme identifikovali základný molekulárny mechanizmus, ktorým E-kadherín zameriava mitotické vreteno, sprostredkovaním postupného náboru LGN a NuMA závislých od bunkového cyklu na kontakty bunka-bunka. To usmerňuje tvorbu stabilných kortikálnych pripojení mitotických mikrotubulov k adhéziám na báze E-kadherínu a vyrovnanie mitotického vretena s kontaktmi bunka-bunka. Týmto spôsobom E-kadherín slúži ako priestorový bunkový medzník, ktorý spája orientáciu bunkového delenia priamo s adhéziou bunka-bunka.

Naše údaje naznačujú, že LGN sa viaže na cytozolický chvost E-kadherínu podobným spôsobom ako katechíny spojené s kadherínom. Po prvé, napriek malému prekrývaniu v aminokyselinovej sekvencii, TPR opakujúca sa doména LGN prijíma super helikálnu štruktúru obsahujúcu nabitú drážku podobnú armadillo opakujúcim sa doménam p120-katenínu a p-katenínu (doplnkový obrázok 2) a priamo sa viaže. do cytosolického chvosta E-kadherínu (obr. 1). Po druhé, mutačné analýzy ukázali, že väzba LGN vyžadovala záporne nabitú oblasť v JMD E-kadherínu, ktorá pripomína, ako sa p120- a P-katenín viažu na E-kadherín, a LGN sa viaže na NuMA (obrázok 1e). Nakoniec sa väzba p120-katenínu a LGN na cytosolický koniec E-kadherínu vzájomne vylučuje (doplnkový obrázok 6). Celkovo tieto nálezy naznačujú porovnateľný spôsob väzby LGN a pl20-katenínu na prekrývajúcu sa oblasť v rámci E-kadherínu. Použitím mutácie v E-kadheríne, ktorá selektívne narušuje nábor LGN, ale jeho spojenie s p120-katenínom zostáva neporušené, sme preukázali, že jeho spojenie s LGN je nevyhnutné pre orientáciu mitotického vretena indukovaného E-kadherínom (obrázok 4).

Planárne epitelové divízie boli pripisované ďalším bunkovým faktorom vrátane: (1) polarizácie buniek v apikalálnej bazálnej osi, ktorá je stanovená za adhéziou E-kadherínu 39, 40 ; (2) laterálne lokalizované proteíny, ktoré sú nepriamo cielené na kontakt bunka-bunka pomocou E-kadherínu (napríklad DLG 9, 41 a APC 25, 29 ); a (3) ďalšie adhézne komplexy bunka-bunka, ktoré sa tvoria po adhézii E-kadherínu (napríklad JAM-A 42 ). Aj keď tieto faktory naznačujú, že E-kadherín môže nepriamo ovplyvňovať orientáciu delenia epitelových buniek, preukázali sme, že E-kadherín v skutočnosti hrá priamu úlohu. Naše redukcionistické prístupy poskytli dôkaz, že E-kadherín je dostatočný na orientáciu epitelových divízií v neprítomnosti iných spojovacích komplexov alebo juxtamembránovej signalizácie (obrázky 2 a 3), a že na to je nevyhnutná priama väzba medzi E-kadherínom a LGN (obrázok 4). ). Pretože E-kadherín je všadeprítomný adhézny proteín bunka-bunka, komplex E-kadherín / LGN môže byť tiež dôležitý pri orientácii na delenie v neepiteliálnych bunkách, napríklad v asymetrických rozdeleniach kmeňových buniek zárodočnej línie Drosophila, ktoré vyžadujú lokálnu Drosophila E- kadherínové adhézie 26, 29 .

Nevylučujeme možnosť, že na kortikálny nábor LGN / NuMA prostredníctvom E-kadherínu môžu ovplyvniť ďalšie cesty. Naše dáta naznačujú, že LGN je konkurentom z E-kadherínu pri uvoľňovaní NuMA z jadra počas mitotického vstupu a vytvorený komplex LGN / NuMA zostal v adhéziách E-kadherínu viazaných na Gai (obr. 5). Ďalšie mechanizmy by mohli pomôcť pri obmedzovaní komplexu LGN / NuMA na kontakty medzi bunkami. Napríklad regulácia asociácie LGN s Gai, prostredníctvom aPKC sprostredkovanej fosforylácie LGN 39, 40 alebo regulácie výmeny GDP / GTP Gai pomocou Ric8 (odkaz 43) by mohla obmedziť životnosť LGN naviazaného na plazmatickú membránu a tak obmedzujú jeho laterálnu difúziu. Furthermore, while our data imply that the release of NuMA from the nucleus is what triggers the formation of the LGN/NuMA complex at E-cadherin adhesions (Fig. 5), mitotic post-translational modifications of E-cadherin 44, LGN or NuMA 18 may further regulate these interactions.

The existence of additional pathways for orienting the spindle further implies regulatory redundancy, which underscores the importance of planar division orientation in epithelial development and homoeostasis. These pathways may be particularly important in specialized epithelia in which E-cadherin localization is more restricted, such as in invertebrate epithelia where E-cadherin is enriched at the apex of the lateral membrane 45 . In addition, other extracellular cues may instruct cell division orientation through competition with E-cadherin to adjust the cortical localization of LGN/NuMA, for example through apically localized mInsc/Inscuteable 20, 21, 22 . These cues may help to adapt spindle orientation to specific tissue requirements, for instance to induce perpendicular divisions and thereby epithelial multi-layering 2 . It will be interesting to test how the balance between competing cues is regulated, in particular in tissues in which LGN displays distinct localizations corresponding to differently oriented divisions 46 .

metódy

protilátky

The following commercial antibodies were used at the indicated concentrations for western blot (WB) and immunofluorescence (IF): alpha-tubulin (DM1A, Sigma, 1:1, 000 IF), DE-cadherin (DCAD2; T. Uemura, Kyoto University, Sakyo-ku, Kyoto, Japan; Developmental Studies Hybridoma Bank, 1:200 IF), DECMA-1 (GeneTex, GTX11512, 1:500 IF), Gamma-tubulin (Sigma, T6557 Clone GTU-88, 1:1, 000 IF), GST (4C10, Covance, 1:500 WB), HA (Sigma, H6908, 1:250 IF), LGN (Millipore, ABT-174, 1:250 IF and Sigma, SAB2100965, 1:5, 000 WB), and rr1 (mouse; Developmental Studies Hybridoma Bank, 1:250 IF). The E2 (rabbit, 1:250 IF) antibody recognizing the cytosolic tail of E-cadherin was generated in-house.

Recombinant protein expression and binding experiments

GST-tagged cytosolic tail of mouse E-cadherin (NM_009864.2, amino acids 736–783) and the TPR repeats of human LGN (NM_013296.4, amino acids 8–311) were cloned into the BamHI/NotI and EcoRV/KpnI restriction sites of the pET-Duet-1 dual expression plasmid (Novagen), respectively. Control plasmids contained either only GST-tagged cytosolic tail, or LGN–TPR and GST. Constructs were transformed into BL21 (DE3) E. coli and protein expression was induced with 1 mM IPTG for 6 h at 30 °C. Bacteria were subsequently lysed using an Emulsiflex B-15 (Avestin) in a buffer containing 20 mM Tris–HCl pH 8, 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT and protease inhibitor cocktail V (Millipore). Lysates were cleared by high-speed centrifugation and E-cadherin/LGN–TPR complexes were isolated by coupling of 100 μl lysate to glutathione agarose beads (Agarose Beads Technologies) followed by extensive washing in a wash buffer containing 20 mM Tris–HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 2.5 mM DTT, 0.005% Tween, 2.5 % glycerol and protease inhibitor cocktail V (Millipore), all at 4 °C. Bound proteins were eluted in Laemmli buffer and analysed by SDS–PAGE and western blotting with GST and LGN antibodies.

The region of human NuMA containing the LGN-binding site (NM_006185, amino acid 1808–1988) was cloned into a pGEX-TEV plasmid using EcoRI and SacI restriction sites and expressed similarly as the pET-Duet-1 constructs. Protein was isolated on glutathione agarose beads, and the GST was cleaved off with tobacco etch virus (TEV) protease and purified on a MonoQ anion exchange column (GE Healthcare Life Sciences) in 20 mM Tris pH 8, 1 mM DTT, and a NaCl gradient from 0 to 1 M. For competition experiments, an S-tag was cloned C-terminally to LGN-TPR, and GST-E-cad-cyto/LGN–TPR:S-tag complexes were isolated on glutathione agarose beads as described above. The GST-tag was cleaved off with TEV protease, and the eluate was subsequently coupled to S-protein agarose beads (Millipore) for 1 h to specifically enrich for the E-cad-cyto/LGN–TPR complex in the absence of free E-cad-cyto. After washing the beads, 100 μg NuMA was added and incubated at 4 °C overnight to compete off LGN–TPR from E-cad-cyto. Beads were washed, and E-cad-cyto and LGN–TPR were eluted in Laemmli buffer and analysed by SDS–PAGE and western blotting.

The extracellular domain of E-cadherin fused to the Fc domain of human IgG1, E-cad:Fc, was purified by collecting culture media from HEK293 cells expressing pcDNA3-E-cad:Fc cultured in the absence of fetal bovine serum (FBS) for 2–3 days to minimize the presence of serum-derived IgGs during protein purification. Culture media was cleared by centrifugation, and E-cad:Fc was purified over a Protein A column (Pierce).

Cell culture and transfections

Parental Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) GII cells 47, and MDCK cells stably expressing E-cadherin-DsRed 48, GFP-α-tubulin 49, mRFP-EB1 (kindly provided by A. Barth, Stanford University) or truncated E-cadherin (T151) under control of a doxycycline-repressible promotor 34 were cultured at 37 °C and 5% CO 2 in air in low glucose DMEM, 10% FBS, 1 g l −1 sodium bicarbonate and penicillin/streptomycin/kanamycin. U2OS, HEK293T, parental L-cells, L-cells-expressing murine E-cadherin under control of a dexamethasone-inducible promotor (LE-cells) and HEK293 E-cadherin:Fc cells were cultured in high glucose DMEM, 10% FBS, 1 g l −1 sodium bicarbonate and penicillin/streptomycin/kanamycin. All live-cell imaging was performed with the same media formulations in the absence of phenol red. Drosophila S2U cells expressing full-length DE-cadherin, DE-cadherinΔCyto or Fasciclin II cloned into pAc5.1/V5–His B were maintained in Schneider's medium (Invitrogen) supplemented with 10% FBS (Sigma-Aldrich), penicillin/streptomycin/kanamycin, 20 μg ml −1 blasticidin and 125 μg ml −1 hygromycin, as previously described 50 .

MDCK GII cells were transfected using Lipofectamine 3000 (Life Technologies) and U2OS cells transfected using Xtremegene HP (Roche), according to the manufacturer's protocols. For lentiviral-knockdown experiments, cells were infected with lentiviral shRNAs targeting LGN (TRCN0000011025, Mission shRNA plasmid, Sigma-Aldrich) or scrambled control (SHC002, Mission shRNA plasmid, Sigma-Aldrich) produced in HEK293T cells, and analysed at least 3 days after infection. ON-TARGETplus siRNAs against Gnai1, Gnai2 and Gnai3 were obtained from Dharmacon, pEGFP-C1-NuMA was a gift from Michael Mancini (Addgene plasmid #81029).

Spindle orientation measurements

MDCK T151 cells were cultured in the absence or presence of doxycycline (1 μg ml −1 ) and 1.5 × 10 6 cells were seeded onto glass-bottom imaging dishes (Mattek) pre-coated with rat tail collagen type I (Corning). LE-cells were cultured in the absence or presence of 1 μM dexamethasone (Sigma-Aldrich), and 1.5 × 10 6 cells were seeded onto glass-bottom imaging dishes pre-coated with poly- D -lysine (Sigma-Aldrich) to minimize matrix adhesions. The following day, cells were fixed in methanol, blocked in buffer containing 1% BSA, 1% goat serum (GS) and 1% donkey serum (DS), incubated with the indicated antibodies, and subsequently with Alexa-labelled secondary antibodies (Life Technologies) and Hoechst 33342 (Molecular Probes). Stained cells were analysed with a LSM 710 confocal microscope using a 63 × objective (NA 1.4) and the angle of the mitotic spindle in metaphase was measured in Z-stacks of cells of at least three independent experiments using ImageJ software (NIH). Data showed a non-Gaussian distribution and were statistically analysed using the Mann–Whitney test.

Drosophila S2 cells expressing DE-cadherin, DE-cadherinΔcyto or Fasciclin II were resuspended at 1 × 10 6 cells ml −1 in T25 flasks (Corning) and gently swirled for 2 h at 250 rpm to induce the formation of cell–cell contacts. Cells were subsequently fixed in 4% paraformaldehyde and transferred to coverslips pre-coated with poly- L -lysine (Sigma-Aldrich), followed by permeabilization in buffer containing 0.1 % Triton X100, incubation with blocking buffer containing 1% BSA, 1% GS and 1% DS, and incubation with the indicated antibodies and subsequently Alexa-labelled secondary antibodies (Life Technologies) and Hoechst 33342 (Molecular Probes). Cells were imaged with a Zeiss Axiovert 200 with a 63 × objective (NA 1.4), using an AxioCam mRM camera and AxioVision Rel. 4.6 software (Carl Zeiss MicroImaging). Pairs of contacting cells were identified, and the angle of the mitotic spindle in metaphase cells, relative to the cell–cell contacts, was measured using ImageJ software (NIH). Data showed a non-Gaussian distribution and was analysed statistically using the Mann–Whitney test.

Functionalized sidewalls

Sidewall scaffolds were constructed from 250 μm thick silicone sheeting (Bisco HT-6240, Stockwell Elastomers) cut into microwell inserts measuring 14 × 11 mm using a computer-controlled razor writer (Cameo, Silhouette). Stencils were plasma activated using atmospheric plasma (50 W, 45 s, 500 mTorr, PDC-001, Harrick Plasma), and subsequently silanized by immersion in a solution of 2% Triethoxysilylundecanal (Gelest) and 2% Triethylamine (Sigma) in pure ethanol (Goldshield), followed by baking at 85 °C for 3 h. A total of 250 μg ml −1 Protein A/G (Thermo-Pierce) in sodium cyanoborohydride coupling buffer (Sigma) was added to each well and allowed to react with the silanized stencils overnight at 4 °C. Stencils were washed with PBS-containing 0.1% Tween-20 (PBST), incubated for at least 1 h with 200 μg ml −1 E-cadherin:Fc or human IgG Fc (Abcam) at room temperature, and then with 10 mg ml −1 BSA for 30 min to neutralize remaining aldehydes and block exposed silicone. Functionalized stencils were transferred to tissue culture plastic imaging dishes (Ibiditreat, Ibidi), and 2 × 10 3 MDCK cells stably expressing E-cadherin:DsRed or GFP-tubulin were seeded in each well, which were tilted during plating to promote interactions of cells with the sidewalls. Live E-cadherin:DsRed MDCK cells were imaged 3 h after plating in the presence of NucBlue (Molecular Probes) using a Leica SP8 scanning confocal microscope and a 63 × (1.4 NA) objective in a temperature controlled incubator. Alternatively, E-cadherin:DsRed MDCK cells were fixed in ice-cold methanol for 5 min, blocked in buffer containing 1% BSA, 1% GS and 1% DS and incubated with LGN antibody and subsequently Alexa-labelled secondary antibody. MDCK GFP-tubulin cells were imaged overnight (5 min per frame) on a customized Zeiss Observer inverted microscope (Intelligent Imaging Innovations, '3I') using a 20 × objective (NA 0.75) in a temperature and CO 2 -controlled incubator. The orientation of the mitotic spindle in late metaphase (the frame before anaphase onset) and in anaphase was measured using ImageJ software (NIH). Binned data is shown in Fig. 3e, and unbinned data in Supplementary Fig. 3f. At late time points, a fraction of cells displayed extensive expansions at the wall with widths up to 200 μm. Furthermore, a minor fraction of cells associated with Fc-coated sidewalls divided perpendicular to the basal surface. Both of these were excluded from analyses.

Imaging plasma membrane-associated astral microtubules

MDCK cells expressing mRFP-EB1 were seeded onto glass-bottomed imaging dishes (Mattek) pre-coated with either poly- D -lysine (Sigma, according to manufacturer's instructions) or E-cadherin:Fc (functionalized similarly as sidewalls, see above). Six hours after seeding cells in metaphase with the mitotic spindle oriented perpendicular to the basal surface were live-imaged by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) on a Zeiss Observer inverted microscope (3I) through a 100x Plan Fluor objective (1.45 NA) and a 561 nm solid-state laser (CristaLaser) in a temperature and CO 2 -controlled incubator. Images were taken at 1 s intervals for 60 s, and the dwell time of individual EB1 puncta within the TIRF plane (that were present for at least two consecutive frames) was measured using ImageJ software.

Surface micropatterning of alternating protein stripes

Micropatterning of alternating protein stripes was adapted from ref. 31 with some modifications. An array of 10 μm wide lines at a 10 μm pitch was laser-etched into a chrome mask (Photoplot International). Silicon wafers were then spin-coated with SU-8 2010 to a thickness of 10 μm, and exposed to 365 nm ultraviolet radiation through the photomask on a mask aligner (Karl-Suss). Patterns were subsequently developed in SU-8 developer and silanized with chlorotrimethylsilane. Polydimethylsiloxane (PDMS; Sylgard 182, Dow Corning) was cast onto the etched resist-coated wafer, cooked overnight at 60 °C, and peeled off the wafer. Stamps were oxidized with ultraviolet-ozone plasma (45 s, 50 W, 500 mTorr, PDC-001, Harrick Plasma) and inked with a solution of 160 μg ml −1 collagen-IV (Sigma) that was labelled with either cy3.5 or cy5.5 dye (Amersham) according to manufacturer's protocol. After incubation at room temperature for 20 min, stamps were dried under clear air flow and subsequently applied to glass-bottomed imaging dishes (Mattek) under load for 30 s and then gently peeled off after 2 min. Stamped imaging dishes were incubated with 50 μg ml −1 E-cadherin:Fc or human IgG Fc (Abcam) for 1 h and washed with PBS before seeding of 5 × 10 4 cells in each dish. TIRF microscopy of GFP-NuMA expressing cells was performed 3 h after plating using a Zeiss Observer inverted microscope (Intelligent Imaging Innovations, '3I') and a 100 × Plan Fluor (1.45 NA) objective (Olympus) and a 473 nm solid-state laser (CristaLaser) in a temperature and CO 2 -controlled incubator. Alternatively, cells were fixed in ice-cold methanol for 5 min, blocked in buffer containing 1% BSA, 1% GS and 1% DS and incubated with LGN or NuMA antibody and subsequently Alexa-labelled secondary antibody followed by imaging by TIRF microscopy (see above). The fluorescence intensity of LGN/NuMA localized to stripes of E-cadherin:Fc, human IgG Fc or collagen-IV was measured with ImageJ (NIH), and local background fluorescence was subtracted. Statistical analysis of cells was performed using an unpaired student t -test.

Mitochondrial targeting

U2OS cells were co-transfected with YFP-tagged TPR repeats of human LGN (NM_013296.4, amino acids 8–351, cloned into a pcDNA3.1 citrine plasmid using Gateway cloning, Invitrogen). YFP–LGN–TPR or GFP-p120-catenin were co-expressed with the RFP-tagged mitochondrial localization signal of ActA 51, fused to either full cytosolic tail or JMD of E-cadherin (NM_009864.2, amino acids 736–888 and 736–783) 51, containing the indicated point mutations. Live-cell imaging was performed in medium contain 10 mM HEPES on a heat-controlled stage on an Axioskop2 LSM510 confocal microscope (Zeiss) with a 63 × objective (NA 1.4). The ratio of the amount of fluorescence of YFP–LGN–TRP or GFP-p120-catenin at the mitochondria relative to the total amount of fluorescence was measured in ImageJ (NIH). Statistical analysis was performed using an unpaired t -test with Welch correction.

Dostupnosť údajov

The authors declare that the data supporting the findings of this study are available within the paper and its Supplementary Information files.

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplnková informácia

    Supplementary Figures and Supplementary References

  2. 2.

    Peer Review File

Komentáre

Odoslaním komentára súhlasíte s tým, že budete dodržiavať naše zmluvné podmienky a pokyny pre komunitu. Ak zistíte, že je niečo urážlivé alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte ho ako nevhodné.