Rozbiť difrakčnú bariéru pomocou fluorescenčnej emisnej diferenčnej mikroskopie vedecké správy

Rozbiť difrakčnú bariéru pomocou fluorescenčnej emisnej diferenčnej mikroskopie vedecké správy

Anonim

predmety

  • Biofotonika
  • Zobrazovanie a snímanie
  • Nelineárna optika
  • Mikroskopia s vysokým rozlíšením

abstraktné

Navrhujeme nový fyzikálny mechanizmus na prelomenie difrakčnej bariéry na vzdialenom poli. Pri mikroskopii s diferenčnou fluorescenčnou emisiou (FED) je náš prístup založený na rozdiele intenzity medzi dvoma rozdielne získanými snímkami. Ak sa použije fluorescenčná saturácia, schopnosť rozlíšenia FED sa môže ďalej zvýšiť. Vykonáva sa podrobná teoretická analýza a séria simulačných testov. Platnosť FED v praktickom použití sa demonštruje experimentmi na fluorescenčných nanočasticiach a biologických bunkách, pri ktorých sa dosahuje priestorové rozlíšenie <λ / 4. Tento prístup, ktorý má potenciál dosiahnuť vysokú rýchlosť zobrazovania, sa môže vo výskume v nanorozmeroch široko uplatňovať.

úvod

Z dôvodu difrakcie v zobrazovacom systéme bolo laterálne rozlíšenie konvenčných optických mikroskopov obmedzené na asi polovicu vlnovej dĺžky osvetlenia až do posledných dvoch desaťročí 1 . Od 90. rokov 20. storočia bolo navrhnutých niekoľko metód na porušenie difrakčného limitu, vrátane stochastickej optickej rekonštrukčnej mikroskopie (STORM) 2, fotoaktivovanej lokalizačnej mikroskopie (PALM) 3, stimulovanej emisnej deplečnej mikroskopie (STED) 4, štruktúrovanej iluminačnej mikroskopie (SIM) 5, 6, digitálne spracovanie obrazu 7, 8 a mikroskopia s úplným vnútorným odrazom na základe nanostrukturovaného substrátu 9 . Medzi nimi sú najčastejšie používané STORM, PALM, STED a SIM. Ukázalo sa, že všetci dosiahli super rozlíšenie v ďalekom poli 10, 11, 12, 13, ale každý má stále obmedzenia. STORM a PALM boli dlho brzdené obmedzenou rýchlosťou zobrazovania. V ich zobrazovacom procese je potrebné získať tisíce snímok, takže rekonštrukcia obrazu v super rozlíšení trvá dlho. Hoci rýchlosť zobrazovania STORM bola nedávno zlepšená na ~ 3 s na obraz 14, 15, je stále príliš nízka na skúmanie živých buniek. Navyše, presnosť lokalizácie týchto dvoch metód je výrazne obmedzená pri zobrazovaní fluoroforov so zníženou rotáciou s neznámou náhodnou orientáciou, čo obmedzuje dosiahnuteľné rozlíšenie 16 . Použitím druhého lúča na priestorové zúženie potenciálnej cence uorescencie prostredníctvom stimulovanej emisie môže STED realizovať zobrazovanie vo vysokom rozlíšení pri pomerne vysokej rýchlosti. Fluorescenčné farbivá, ktoré sú k dispozícii pre mikroskopiu STED, sú však stále obmedzené, pretože excitačné aj emisné spektrá sa musia porovnávať s danou vlnovou dĺžkou excitácie a deplécie. SIM kartu je možné použiť aj na prelomenie difrakčnej bariéry. Pravidelným vzorovaním excitačného svetla posúva vysokofrekvenčné informácie zo vzorky do detekčného rozsahu s nižšou frekvenciou. Pretože je však periodicita osvetlenia obmedzená difrakciou, SIM môže rozlíšenie predĺžiť iba faktorom 2, 5 . Okrem toho si SIM vyžaduje nákladné nastavenie, aby sa v praxi dosiahli rýchlosti zobrazovania videa. Aj keď rozlíšenie SIM sa môže v prípade nasýtenej fluorescencie ďalej zlepšiť, takzvaná SSIM 10, 17 je tiež nákladná a ťažko uskutočniteľná. Okrem toho sa fluorescencia v SSIM ľahko fotobieli a spôsobí fototoxicitu v dôsledku dlhodobého vystavenia vzorky svetelnému lúču s vysokou hustotou výkonu. Preto je potrebné neustále vyvíjať nové techniky, ktoré ďalej využívajú potenciál optickej mikroskopie na zobrazovanie s vysokým rozlíšením.

Subtraktívne zobrazovanie 18, 19 môže poskytnúť nové možnosti na zlepšenie priestorového rozlíšenia. Pri tejto metóde sa priestorové rozlíšenie zvyšuje odčítaním konfokálnych signálov získaných pri rôznych veľkostiach dierok. Pomer signál-šum (SNR) je však relatívne nízky. Dôvod je ten, že konfokálne signály, ktoré sa prijímajú pri rôznych veľkostiach dierok, sú budené rovnakým lúčom osvetlenia. Výsledkom je, že po odčítaní sú signály použité na zostavenie konečného obrazu s vysokým rozlíšením tie, ktoré sú emitované na okraji excitačného bodu. Počas procesu sa však odpočítali skutočné efektívne signály, ktoré sú emitované v strede excitačného miesta. Nedávno bol navrhnutý ďalší mikroskop s plným poľom založený na odčítaní obrazu, ktorý môže zlepšiť osové rozlíšenie pri zachovaní laterálneho 20 . Žiaľ, jeho zlepšenie rozlíšenia je možné dosiahnuť iba v blízkom okolí.

Tu navrhujeme novú zobrazovaciu metódu, fluorescenčnú emisnú diferenčnú mikroskopiu (FED), ktorá poskytuje nový spôsob vykonávania vyšetrení v nanorozmeroch. Na osvetlenie vzorky sa používajú dva rôzne modulované lúče, čím sa realizujú dva skenovacie obrazy. Po odčítaní má výsledný rozdielny obraz super-rozlíšenie spolu s pomerne vysokou SNR.

výsledok

V systéme FED sa musia spracovať dva rôzne skenovacie obrázky. Jedným z nich je konvenčný konfokálny obraz získaný, keď je vzorka osvetlená pevným vzorom excitácie; druhý negatívny konfokálny obraz sa získa, keď je vzorka osvetlená šošovkovým excitačným vzorom, ktorý je možné vygenerovať moduláciou osvetľovacieho lúča vírením 0–2

Image

fázová doska. Oba obrázky sú detekované rovnakou dierkou, ktorá funguje ako priestorový filter. Konečný FED obraz s vysokým rozlíšením sa vytvára odčítaním intenzity týchto dvoch obrazov,

Image

kde

Image

sú normalizované distribúcie intenzity konfokálnych, negatívnych konfokálnych a FED obrazov a

Image

je odpočítateľným faktorom. Po odčítaní sa na obrázku rozdielu nevyhnutne objavia niektoré hodnoty negatívnej intenzity. Tieto negatívne intenzity jednoducho vylúčime z obrázka, aby sme zlepšili kvalitu zobrazovania 21 .

Pri spracovaní konfokálneho obrazu sa funkcia bodového rozptylu (PSF) môže vypočítať ako 22

Image

kde

Image

označuje PSF pre šošovku objektívu použitú na excitáciu fluorescencie, ktorá je zobrazená na obrázku 1 (a), a

Image

označuje PSF pre šošovku objektívu vyhodnotenú pri fluorescenčnej vlnovej dĺžke. ďalej

Image

je prenosová funkcia dierky. Obrázok 1 (c) znázorňuje výsledok

Image

vypočítané rovnicou 2. Byť modulovaný vírom 0–2

Image

Fázová doska má PSF pre excitačný obrazec tvar šišky, ako je znázornené na obr. 1 (b). Po konvolúcii s

Image

, PSF pre negatívne konfokálne zobrazovanie,

Image

, tiež vytvára tvar šišky, ako je znázornené na obr. 1 (d). Odčítaním

Image

z

Image

použitím ekv. 1, FED PSF,

Image

, sa získa, ako je znázornené na obrázku 1 (e).

Image

a) PSF konfokálneho vzoru excitácie. b) PSF so záporným vzorcom excitácie. c) PSF na konfokálne zobrazovanie. d) PSF pre negatívne konfokálne zobrazenie. (e) PSF obrazu FED.

Obrázok v plnej veľkosti

Na demonštráciu rozlišovacej schopnosti FED predpokladáme, že dve fluorescenčné častice sú od seba vzdialené λ / 4 a simuláciou sa vypočíta zodpovedajúci FED obraz. Tu,

Image

je vlnová dĺžka lúča osvetlenia. Normalizované profily intenzity čiar zodpovedajúcich konfokálnych, negatívnych konfokálnych a FED obrazov sú zobrazené na obrázku 2 (a), (b) a (c). Ako sa očakávalo, profil intenzity konfokálnej čiary vykazuje iba jeden pík, čo naznačuje zlyhanie pri rozlíšení týchto dvoch častíc. Na rozdiel od toho, na obrázku FED môžeme jasne rozlíšiť dva vrcholy intenzity v línii profilu. Tento výsledok teoreticky demonštruje, že priestorové rozlíšenie <λ / 4, ktoré je ďaleko za difrakčnou bariérou, sa dá realizovať pomocou FED.

Image

Normalizované profily intenzity čiar a) konfokálnych, b) negatívnych konfokálnych a c) FED obrazov pre dva nanočastice oddelené λ / 4. Profily čiar PSF pre (d) negatívne konfokálne a (e) zobrazovanie FED pri rôznych saturačných faktoroch:

Image

(červená krivka),

Image

(zelená krivka) a

Image

(modrá krivka). f) dosiahnuteľné rozlíšenie FED, v jednotkách vlnovej dĺžky lúča svetla, ako funkcia saturačného faktora

Image

pod rôznymi odpočítateľnými faktormi: r = 0, 7 (červená krivka), r = 0, 85 (modrá krivka) a r = 1 (čierna krivka). Všetky simulované výsledky sú prezentované s objektívovou šošovkou NA = 1, 4.

Obrázok v plnej veľkosti

Schopnosť rozlíšenia FED sa môže ďalej zlepšiť, keď sa zvažuje saturácia fluorescencie. Podľa teórie fluorescencie môže každá molekula fluoroforu emitovať v priemere najviac jeden fotón za život

Image

10 . Preto, keď je osvetlená intenzitou lúča nad prahom

Image

, jej fluorescenčná emisia sa nasýti a nelineárne reaguje na intenzitu excitácie 23 . V našom nasýtenom prístupe FED sa v podmienkach nasýtených fluorescenciou vykonáva iba negatívne konfokálne zobrazenie. Konfokálne zobrazovanie sa stále vykonáva v nenasýtenom prípade. PSF pre negatívnu konfokálnu mikroskopiu by sa preto mala prepísať ako

Image

Tu,

Image

označuje PSF pre negatívnu konfokálnu mikroskopiu v nenasýtenom prípade a

Image

je saturačný faktor, ktorý je definovaný ako

Image

, kde

Image

je maximálna intenzita budiaceho lúča;

Image

je prahová intenzita. Ďalej je možné výsledný PSF pre nasýtený FED vyjadriť ako

Image

Profily čiar PSF pre negatívne konfokálne a FED zobrazenie pri rôznych saturačných faktoroch sú uvedené na obrázku 2 (d) a (e). Kedy

Image

sa zvyšuje, FWHM profilu intenzity v FED obrázku sa znižuje. Lepšie rozlíšenie je preto možné dosiahnuť, keď je fluorescenčná emisia pri negatívnom konfokálnom zobrazení nasýtená vysoko intenzívnym osvetľovacím lúčom.

Dosiahnuteľné rozlíšenie FED sa môže odhadnúť vypočítaním distribúcie intenzity FED dvoch tesne umiestnených fluorescenčných nanočastíc a pomocou Rayleighovho kritéria 24 na vyhodnotenie, či je možné rozlíšiť dva vrcholy intenzity. Obrázok 2 (f) a údaje v doplnkovej tabuľke S1 ukazujú priestorové rozlíšenie FED za niekoľkých podmienok. Všimnite si, že hodnota odpočítateľného faktora

Image

bude mať tiež vplyv na výkonnosť FED. A vyššie

Image

môže potlačiť viac šumu, ale zároveň môže do obrazu zaviesť artefakty. Preto hodnota

Image

by sa malo stanoviť tak, aby udržiavalo rovnováhu medzi dosiahnuteľným rozlíšením a výskytom negatívnych intenzít 19 . V praxi po získaní zodpovedajúceho konfokálneho a negatívneho konfokálneho obrazu jednoducho vyladíme hodnotu

Image

v rozmedzí 0, 7 až 1 (jedná sa o empirický rozsah), aby sa dosiahol rozdiel v najvyššej kvalite.

Všimnite si, že vyššie uvedená metóda odhadu rozlíšenia najlepšie zodpovedá riedkym vzorkám. Schopnosť rozlíšenia FED sa mierne zhorší pri zobrazovaní vzoriek s vysokou hustotou, ako sú napríklad niektoré realistické biologické bunky. Na odhadnutie dosiahnuteľného priestorového rozlíšenia v takýchto prípadoch sme vykonali simulačný test na lúčovitej vzorke 25 . Táto vzorka je široko používaná, pretože rozlíšenie zobrazovacej techniky sa dá hodnotiť veľmi jednoducho zmeraním polomeru kruhu vymedzujúceho „nevyriešenú“ strednú oblasť a „rozlíšenú“ periférnu oblasť v zodpovedajúcom obrázku. Výsledky znázornené na obr. 3 ilustrujú, že zatiaľ čo znaky vo vnútri oblasti označenej modrým kruhom nie je možné rozlíšiť v konfokálnom obraze, niektoré znaky vo vnútri rovnakej oblasti sa dajú rozlíšiť v obrázku FED, čo naznačuje zvýšené rozlíšenie. Navyše, ako sa očakávalo, v prípade nasýteného FED boli ďalšie podrobnosti vo vnútri modrého kruhu jasne vyriešené. Preto je FED použiteľný aj pre nanoskopiu týchto vzoriek s vysokou hustotou.

Image

a) Skúšobná vzorka. Veľkosť oblasti: 8 μm až 8 μm, veľkosť pixlov: 20 nm. b) Konfokálny obraz. c) FED snímka s odpočítateľným faktorom r = 0, 7. (d) Nasýtený obrázok FED so subtraktívnym faktorom r = 0, 7 (ζ = 2).

Obrázok v plnej veľkosti

Výkonnosť FED v praxi sa testovala zobrazovaním fluorescenčných nanočastíc (100 nm, žltozelené FluoSpheres, Molecular Probes). Osvetľovacie lúče boli poskytované pulznými laserovými diódami pri vlnovej dĺžke 488 nm. Konfokálne a FED obrázky sú zobrazené na obrázku 4 (a) a (b). Použitím algoritmu Richardson-Lucy na vykonanie dekonvolucie obrazu FED získame obraz FED +, ako je znázornené na obrázku 4 (c). 4 (d) a (e) sú zväčšené pohľady na oblasti označené zelenými rámčekmi na obrázku 4 (a) a (c). Profil intenzity pozdĺž čiary vyznačenej žltými šípkami na obrázku 4 (d) jasne ukazuje, že je možné rozlíšiť dve nanočastice oddelené vzdialenosťou 105 nm, čo znamená, že bola dosiahnutá schopnosť rozlíšenia A / 4, 6. Na konfokálnom obraze sa však vyskytujú rovnaké dve nanočastice. Preto je rozlíšenie podstatne vylepšené pomocou FED. Porovnanie obrázkov 4 (g) a (h), ktoré sú zväčšenými pohľadom na údaje označené bielymi rámčekmi na obrázku 4 (a) a (c), ďalej demonštruje vynikajúcu rozlišovaciu schopnosť FED oproti konfokálnej mikroskopii., Obrázok 4 (i) ukazuje, že tri vrcholy intenzity boli jasne rozlíšené pomocou FED, ale tieto tri vrcholy sa prekrývali v konfokálnom obraze a nemožno ich rozlíšiť.

Image

a) Konfokálny obraz. (b) FED snímka s odpočítateľným faktorom r = 0, 75. (c) FED + obrázok. d) zväčšené zobrazenie údajov označených zeleným rámčekom v písmene a). e) zväčšené zobrazenie údajov označených zeleným rámčekom v bode c). f) Normalizované profily intenzity pozdĺž čiar označených žltými šípkami v písmenách d) ae). g) zväčšené zobrazenie údajov označených bielym rámčekom v písmene a). h) zväčšené zobrazenie údajov označených bielym rámčekom v bode c). i) Normalizované profily intenzity pozdĺž čiary vyznačenej žltými šípkami v písmenách g) ah).

Obrázok v plnej veľkosti

Obraz FED má okrem lepšieho rozlíšenia aj vyššiu SNR. Toto sa dá vysvetliť procesom zobrazovania FED. PSF pre konfokálny obraz je pevný, zatiaľ čo pre negatívny konfokálny obraz je tvar koblihy (dutý). Preto, keď sa vytvorí obraz FED, tieto fluorescenčné signály emitované na okraji excitačného vzorca, ktoré možno považovať za šum, sa odpočítali, čím sa zlepšila SNR. Po dekonvolúcii pomocou algoritmu Richardson-Lucy sa SNR snímok FED môže ešte mierne vylepšiť, ako je znázornené na obr.

Ďalej uvádzame zobrazovacie výsledky biologických buniek značených zeleným fluorescenčným proteínom (GFP). Pri zobrazovaní sa použili dve rôzne oblasti vzorky buniek ľudských embryonálnych obličiek 293 (HEK293). Bunky HEK293, ktoré boli stabilne exprimované pomocou GFP-LC3 v cytoplazme, boli pestované na sterilných sklenených krycích sklíčkach a fixované 4% formaldehydom. Osvetľovacie lúče boli tiež poskytované pulznými laserovými diódami pri vlnovej dĺžke 488 nm. Výsledné konfokálne a FED obrázky sú znázornené na obr. 5. Porovnaním FED obrázkov s ich konfokálnymi náprotivkami demonštrujeme značné zlepšenie rozlíšenia a SNR, keď boli tieto biologické vzorky zobrazované pomocou FED. FED zobrazením bolo odhalených veľa funkcií, ktoré zodpovedajú skutočným štruktúram vo vzorke, ktoré boli úplne skryté pod konfokálnym pozorovaním.

Image

a) Konfokálny obraz oblasti 1 v HEK293. (b) Konfokálny obraz oblasti 2 v HEK293. c) Obraz FED oblasti 1 v HEK293 so subtraktívnym faktorom r = 0, 95. (d) Obraz FED oblasti 2 v HEK293 so subtraktívnym faktorom r = 0, 9.

Obrázok v plnej veľkosti

diskusia

V našom experimente bola vzorka skenovaná laterálne fázou nano-polohovania. Priestorové skenovanie však môže byť tiež uskutočnené rezonančným zrkadlom, pretože požadovaný čas zotrvania na pixel v FED môže byť relatívne krátky. V takom prípade je možné dosiahnuť rýchlosť zobrazovania video rýchlosti; to je dostatočné na skúmanie živých buniek. Vysoká rýchlosť skenovania navyše umožňuje oveľa kratšiu dobu zotrvania na pixel v FED v porovnaní s SSIM, čo výrazne znižuje možnosť fotobielenia a fototoxicity.

V tomto článku sú konfokálne a negatívne konfokálne obrazy odpočítané po jednotlivých snímkach počas experimentu. Presnejšie povedané, fluorescenčná vzorka sa najskôr skenuje nepretržite pomocou pevného osvetlenia, aby sa získal konfokálny obraz. Ďalej je osvetľovací lúč modulovaný tak, aby sa vytvoril vzorec v tvare šišky a opakovane skenuje vzorku, aby sa získal negatívny konfokálny obraz. Počas tohto procesu môže dôjsť k nesúladu obrázkov v dôsledku posunu vzorky. V dôsledku toho nie sú polohy skenovacích bodov na dvoch obrázkoch úplne rovnaké, čo ovplyvňuje kvalitu výsledného obrazu. Tento problém sa dá vyriešiť pomocou schémy odčítania bod po bode. Po detekcii fluorescencie excitovanej obrazcom tuhého osvetlenia v skenovacom bode sa osvetľovací lúč moduluje tak, aby sa vytvoril obrazec v tvare koblihy, ktorý excituje fluorescenciu v rovnakom skenovacom bode. Potom sa vzorec osvetlenia prevedie späť na pevný a presunie sa na ďalší bod skenovania. V tejto schéme je časový interval medzi konfokálnou a negatívnou konfokálnou detekciou na tom istom pixle rovný času zotrvania skenovania. Ako je uvedené vyššie, keď sa skenovanie vykonáva pomocou rezonančného zrkadla, doba zotrvania na každom pixeli môže byť veľmi krátka (~ 0, 3 μs). Z tohto dôvodu možno posun vzorky počas tohto obdobia považovať za zanedbateľný.

Blikanie fluorescencie môže ovplyvniť kvalitu obrazu FED, pretože to spôsobí, že jedna molekula bude emitovať fluorescenciu rôznych intenzít pri konfokálnom skenovaní a negatívnom konfokálnom skenovaní. Najzávažnejšia je situácia, keď je vzorka skenovaná vysokorýchlostným rezonančným zrkadlom a je implementovaná schéma odčítania bod po bode. V takom prípade bude časový interval medzi konfokálnym a negatívnym konfokálnym zobrazením na tom istom pixeli porovnateľný s obdobím fluktuácie fluorescencie. Preto je pre skenovanie video rýchlosti výhodné zvoliť fluorescenčné farbivá, ktoré pomaly blikajú.

V súhrne bola navrhnutá nová nanoskopická FED. Na základe rozdielov intenzity medzi dvoma rozdielne získanými snímkami môže FED dosiahnuť rozlíšenie <λ / 4 vo vzdialenom poli, čo je ďaleko za konvenčnou difrakčnou bariérou. Okrem toho sa jeho schopnosť rozlíšenia môže ďalej zlepšiť, keď je fluorescenčná emisia vzorky pri negatívnom konfokálnom zobrazení saturovaná. Veríme, že táto metóda môže byť široko aplikovaná pri skúmaní v nanorozmeroch.

metódy

Výpočty PSF v FED

Podľa teórie FED možno jeho PSF vypočítať ako

Image

kde

Image

a

Image

- označujú PSF pre konfokálne a negatívne konfokálne zobrazovanie a

Image

predstavuje subtrakčný faktor.

PSF pre konfokálnu mikroskopiu,

Image

, je daný

Image

kde

Image

označuje PSF pre šošovku objektívu použitú na excitovanie fluorescencie. Inými slovami, ide o normalizované rozdelenie intenzity excitačného modelu na vzorke.

Image

označuje PSF pre šošovku objektívu vyhodnotenú pri fluorescenčnej vlnovej dĺžke a p ( x , y ) je prenosová funkcia dierky. Pre jednoduchosť ignorujeme rozdiel vo vlnovej dĺžke medzi excitačným a fluorescenčným lúčom a predpokladáme nekonečne malú dierku. Z toho dôvodu,

Image

a

Image

, Potom možno PSF pre konfokálnu mikroskopiu zapísať ako

Image

Podobne PSF pre negatívne konfokálne zobrazenie sa môže vypočítať ako

Image

kde

Image

je normalizované rozdelenie intenzity modelu excitácie dutých vzoriek na vzorke.

Rozloženie elektrického poľa vo vzorke sa môže vypočítať pomocou zovšeobecneného Debyeho integrálu ako

Image

kde

Image

je vektor elektrického poľa v (

Image

) vyjadrené vo valcovitých súradniciach, ktorých pôvod sa nachádza v ideálnom ohnisku objektívu,

Image

je uhol medzi smerom lúča a optickou osou,

Image

je azimutálny uhol, C je normalizovaná konštanta,

Image

je maticový jednotkový vektor o polarizácii dopadajúceho lúča,

Image

je amplitúdová funkcia dopadajúceho svetla,

Image

označuje funkciu aberácie čela šošovky objektívu a

Image

je funkciou fázovej modulácie pre dopadajúci lúč. V konfokálnom prípade

Image

, zatiaľ čo v negatívnom konfokálnom prípade, keď je osvetľovací lúč fázovo modulovaný vírom 0–2

Image

fázová doska,

Image

,

Nakoniec možno PSF pre FED vypočítať pomocou rovníc. (5), (7), (8) a (9).

Odhad dosiahnuteľného riešenia FED

V tomto článku je rozlíšenie definované ako najmenšia vzdialenosť, pri ktorej je možné rozlíšiť dve fluorescenčné nanočastice. Aby sme to mohli odhadnúť, predpokladáme, že dve nanočastice sú umiestnené blízko seba na osi X oddelené vzdialenosťou

Image

a zobrazujú ich FED. V takom prípade distribúcia intenzity zodpovedajúceho konfokálneho obrazu,

Image

, bude

Image

Tu,

Image

označuje PSF pre konfokálne zobrazovanie.

Podobne distribúcia intenzity zodpovedajúceho negatívneho konfokálneho obrazu,

Image

, možno písať ako

Image

kde

Image

označuje PSF pre negatívne konfokálne zobrazovanie pri rôznych saturačných faktoroch. Všimnite si, že v prípade nenasýtených

Image

možno tiež písať ako

Image

,

Potom distribúcia intenzity výsledného obrazu FED,

Image

, možno získať odpočítaním

Image

z

Image

,

Rayleighovo kritérium sa používa na vyhodnotenie toho, či tieto dva vrcholy intenzity v

Image

možno rozlíšiť. Podľa Rayleighovho kritéria je možné rozlíšiť dva píky, keď je minimálna intenzita medzi nimi menšia ako 73, 5% intenzity piku. V FED, keď je vzdialenosť

Image

medzi dvoma nanočasticami klesá, dva vrcholy intenzity v

Image

sa priblíži k sebe a minimálna intenzita medzi nimi sa určite zvýši. Ak minimálna hodnota intenzity prekročí Rayleighov prah, tieto dva píky už nie je možné rozlíšiť. Preto je možné určiť dosiahnuteľné rozlíšenie FED.

V simulácii sme zmenili hodnotu

Image

nepretržite v

Image

a vypočítal výsledok

Image

, Zmena hodnôt

Image

a

Image

ovplyvní aj dosiahnuteľné riešenie. Tu sme simulovali podmienky, keď r = 0, 7, r = 0, 85 a r = 1, a hodnotu

Image

zmeny z 1 na 15 s rozlíšením 1.

Nastavenie zobrazovania

Doplnkový obrázok S1 ukazuje nastavenie nášho systému FED. Ako osvetľovacie lúče sa používajú dva rôzne modulované lúče, lúč 1 a lúč 2, ktoré majú rovnakú vlnovú dĺžku 488 nm. V prvej polovici periódy zobrazovacieho času T pracuje iba lúč 1, zatiaľ čo v druhej polovici periódy je lúč 1 vypnutý a lúč 2 funguje. Frekvencia modulácie je nastavená na dvojnásobok rýchlosti zobrazovania. Ak je prítomný lúč 1, použije sa polarizátor (polar1) na jeho prevedenie na lineárne polarizovaný lúč. Po odrazení zrkadlom a prechode cez delič polarizačného lúča (B. Halle GmbH, Berlín, Nemecko) sa lúč 1 odrazí dichroickým zrkadlom (Di02-R488-25 × 36, Semrock) a kruhovo polarizuje štvrťvlnovou vlnou plechu. Potom sa lúč 1 zaostrí na vzorku cez šošovku objektívu (HCX PL APO 100 × / 1, 40–0, 7 olej, Leica Microsystems, Nemecko) a vytvorí pevné ohnisko. Fluorescencia excitovaná lúčom 1 sa zbiera rovnakou šošovkou objektívu a prechádza cez dichroické zrkadlo, aby ju oddelila od lúča1. Ďalej sa fluorescenčný lúč ďalej vyčistí pásmovým filtrom (FF03-525 / 50-25, Semrock) a potom sa zaostrí na multimódové optické vlákno (M31L02, Thorlabs), ktoré slúži ako konfokálna diera. Vlákno je pripojené k lavínovej fotodióde (SPCM-AQR-16-FC, PerkinElmer), ktorá detekuje intenzitu fluorescenčného lúča. Zistené fluorescenčné údaje sa spracúvajú počítacím modulom (PicoHarp 300, PicoQuant GmbH, Nemecko) a ukladajú sa do PC. Vzorka sa priestorovo skenuje fázou nano-polohovania (P-734.2, Physik Instrumente GmbH & Co., Nemecko). Týmto spôsobom sa získa konfokálny obraz. V prípade lúča 2 sa do optickej dráhy vloží vírová 0 až 2π fázová platnička (VPP-A1, RPC Photonics, USA). Výsledkom je, že lúč2 po prechode cez šošovku objektívu vytvára na vzorke duté ohnisko v tvare šišky, čím dochádza k negatívnemu konfokálnemu zobrazovaniu. Výsledná fluorescencia sa deteguje ako v prípade lúča. Pred zobrazením je potrebné vykonať kalibráciu, aby sa zabezpečilo, že lúč 1 aj lúč 2 osvetlia rovnakú polohu na vzorke. Získané údaje sú spracované a analyzované pomocou softvéru, ktorý sme vyvinuli (doplnkový obrázok S2).

Kalibrácia systému FED

Pred zobrazením je nevyhnutná kalibrácia, ktorá v rovnakom bode na vzorke vytvára svetelné obrazce v tvare aj v tvare šišky, aby sa zabezpečila kvalita výsledných snímok FED. V tomto článku je kalibrácia dosiahnutá zobrazením jednej fluorescenčnej nanočastice. Po získaní zodpovedajúcich konfokálnych a negatívnych konfokálnych obrazov (doplnkový obrázok 3) sme ich distribúciu intenzity vybavili gaussovskou funkciou, čím sme určili centrálne súradnice týchto dvoch vzorov osvetlenia. Stanovením rozdielu medzi týmito dvoma stredovými súradnicami môžeme ľahko odhadnúť priečny posun medzi osvetľovacími lúčmi a upraviť ho ladením polohy a orientácie odrazového zrkadla v zostave.

Je zrejmé, že je oveľa jednoduchšie kalibrovať nastavenie FED ako systém STED, pretože v STED sa kalibrácia môže vykonať iba zobrazením kovových nanočastíc, takže je potrebné odstrániť niekoľko optických prvkov v zobrazovacom systéme, ako je pásmový filter a dichroické zrkadlo. alebo vymenené počas kalibrácie. V prípade systému FED nie je potrebné meniť žiadne optické prvky.

Doplnková informácia

Súbory PDF

  1. 1.

    Doplnková informácia

    doplnkový súbor

Komentáre

Odoslaním komentára súhlasíte s tým, že budete dodržiavať naše zmluvné podmienky a pokyny pre komunitu. Ak zistíte, že je niečo urážlivé alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte ho ako nevhodné.